一種輪蟲的篩選方法與流程
2023-07-02 19:34:16 4
本發明涉及生物篩選
技術領域：
，且特別涉及一種輪蟲的篩選方法。
背景技術：
：不論是海水魚還是淡水魚，在育苗及幼體培育期間，其開口活餌料主要選用輪蟲。按照每尾育苗每天攝食20～50隻輪蟲來計算，1個生產5000萬尾魚苗的中小型育苗企業，每天對輪蟲的需求量就需要達到15～25億隻，按照1：1的比例採收輪蟲來計算，育苗單位每天需要生產25～50億隻輪蟲。輪蟲大多數品係為周期性孤雌繁殖，即其生活史由孤雌繁殖和有性繁殖兩部分構成。通常情況下，輪蟲通過高效的孤雌繁殖過程增加種群數量，但是在高密度養殖條件下，則啟動有性繁殖，產生休眠卵來抵禦不良環境條件。有性繁殖的產生大大限制了種群繁殖的效率，甚至有崩潰的危險，從而限制了輪蟲的產量，所帶來的是活餌料供應不足的問題。因此實際生產中需要得到有性生殖傾向低的輪蟲品系擴大培養，而該篩選方法目前尚未見報導。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種輪蟲的篩選方法，用於快速、精準的篩選有性生殖傾向最低的輪蟲品系，從而解決高密度培養條件下輪蟲的有性生殖所帶來的輪蟲餌料供應不足的問題，提高培養效率，節約生產成本，具有極佳的推廣價值。本發明解決其技術問題是採用以下技術方案來實現的。本發明提出一種輪蟲的篩選方法，用於篩選有性生殖傾向最低的輪蟲，包括：將多個目標輪蟲品系分別於環境密度≤0.1ind./ml的條件下穩定化增殖2-4周，建立單克隆培養母種群，從單克隆培養母種群中選擇帶卵輪蟲作為母體，使其於環境密度≤0.1ind./ml的條件下生產F1代輪蟲幼體，將齡長<2h的F1代輪蟲幼體分別放置於不同體積的輪蟲培養液中單獨培養，並使得各F1代輪蟲在發育過程中經歷穩定的種群密度，每天更換一次輪蟲培養液。將不同種群密度下培養的各F1代輪蟲產生的F2代幼體分別挑出單獨培養，計算各F1代輪蟲種群對應的F2代有性個體比率。將F2代有性個體比率和對應的F1代經歷的種群密度進行非線性擬合，求得各F1代輪蟲種群的有性生殖閾密度。將多個目標輪蟲品系的F1代輪蟲種群的有性生殖閾密度進行比較，得有性生殖傾向最低的輪蟲品系。本發明較佳實施例提供的輪蟲的篩選方法的有益效果是：通過多個目標輪蟲品系分別於環境密度≤0.1ind./ml的條件下穩定化增殖以及於環境密度≤0.1ind./ml的條件下生產F1代幼體，有效控制母系效應對輪蟲F1代以及F2代的影響，提高實驗結果的可重複性。通過不同種群密度的F1代輪蟲種群以及對應的F2代有性個體比率進行非線性擬合，求得各F1代輪蟲種群的有性生殖閾密度；並通過比較多個目標輪蟲品系的有性生殖閾密度，得到有性生殖閾密度值最高的，即有性生殖傾向最低的輪蟲，並用於大批量培養，可顯著提高生產種群的輪蟲最大培養密度，有利於高密度集約化培養，從而節約生產成本。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對範圍的限定，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發明試驗例提供的各品系輪蟲種群(有性生殖閾密度不同)的種群增長圖。具體實施方式為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。下面對本發明實施例的一種輪蟲的篩選方法進行具體說明。一種輪蟲的篩選方法，用於篩選有性生殖傾向最低的輪蟲，包括：將多個目標輪蟲品系分別於環境密度≤0.1ind./ml的條件下穩定化增殖2-4周，建立單克隆培養母種群。其中，本發明中目標輪蟲品系可以為不同品種的輪蟲，也可以為同一品種採集自不同地區的輪蟲，例如不同地區採集的萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)，本領域工作人員可根據實際情況進行選定，在此不做限定。由於跨代母體效應在輪蟲有性生殖的傾向性方面具有顯著影響，且建立單克隆培養母種群需要輪蟲不斷的生殖，而有性生殖則會產生休眠卵以及雄卵，降低種群增長速度，加大實驗成本以及影響實驗效果，因此採用孤雌生殖快速穩定的建立單克隆培養母種群。經發明人發現，於環境密度≤0.1ind./ml的條件下穩定化增殖2-4周是建立單克隆培養母種群的最佳時間以及最佳環境密度，該密度下，輪蟲進行孤雌生殖效果佳且培養成本較為低廉。優選地，目標輪蟲品系由從野外採集的休眠卵置於盛有輪蟲培養液的容器內，將容器放置於20-25℃，光周期L：D＝16:8、光照強度為1000-3000lx的恆溫培養箱中孵化而得。該條件下，孵化速率快，孵化後的輪蟲成活率高。其中休眠卵採集是指在野外，從水流靜緩的河汊、池塘、海邊潟湖等處採集富含休眠卵的底泥，將底泥放置於黑暗低溫的容器中帶回實驗室，並置於冰箱中。優選地，於孵化步驟開始前將野外採集的休眠卵放置於4-5℃的條件下進行保存，該溫度範圍內，休眠卵保存時間長，且活性高，溫度過高，會導致休眠卵孵化，溫度過低，會影響休眠卵的活性。優選地，將孵化而得的每個輪蟲單獨轉移至第二細胞培養板內，每孔加入2-5ml的輪蟲培養液，每隔1-2天更換一次輪蟲培養液，獲得各輪蟲的單克隆培養種群作為目標輪蟲品系。具體地，單克隆培養種群的密度為≤1ind./ml，種群規模至少達到1000隻個體，可為後續實驗提供足夠的實驗樣本。由於有時實驗並非在單克隆培養種群建立後立即進行操作，因此優選地，將目標輪蟲品系進行穩定化增殖之前，於15-20℃之間，保持種群密度為1ind./ml的情況下穩定培養15-30天。期間，可通過每天更換培養液和隨機挑出一些個體的辦法控制食物濃度以及種群密度，使輪蟲受食物濃度、環境溫度和種群密度影響的母系效應一致化，從而後續實驗的可重複性佳。更優選地，將目標輪蟲品系進行穩定化增殖之前，於15℃，保持種群密度1ind./ml的情況下穩定培養30天，目標輪蟲品系的活性佳。更優選地，將目標輪蟲品系進行穩定化增殖之前，在20℃，保持種群密度1ind./ml的情況下穩定培養15天，目標輪蟲品系的活性佳。從單克隆培養母種群中選擇帶卵輪蟲作為母體，使其於環境密度≤0.1ind./ml的條件下生產F1代幼體，此時在該低密度環境下生產出的F1代幼體理論上均為非混交雌體。將齡長<2h的F1代幼體分別放置於不同體積的輪蟲培養液中單獨培養，並使得F1代個體在發育過程中經歷穩定的種群密度，通過計算獲得每個F1代輪蟲所生活的種群密度。期間每天更換一次輪蟲培養液，保證食物濃度相同。在本發明其他實施例中，還可以採用將不同數量的F1代幼體分別放置於同樣體積的輪蟲培養液中，建立不同的種群密度的各F1代輪蟲。需注意的是：這裡使F1代個體在發育過程中經歷穩定的種群密度最好包括小於0.1ind./ml的數值以及大於0.1ind./ml的數值，這樣設置的原因是輪蟲的有性生殖與種群密度密切相關，因此F1代輪蟲的種群密度大於0.1ind./ml，F1代會受到自體產生的有性生殖誘導信號的刺激，其後代中會有一定比例的個體為混交雌體，而F1代輪蟲種群的種群密度小於0.1ind./ml的部分，則可驗證在0.1ind./ml條件下進行孤雌生殖是否為合理設置。將各F1代輪蟲產生的F2代幼體分別挑出單獨培養，保證各F1代輪蟲的種群密度不變，且於相同的環境溫度下進行培養，使得各F1代輪蟲受食物濃度、環境溫度和種群密度影響的母系效應一致化。計算各F1代輪蟲對應的F2代有性個體比率；優選地，F2代有性個體比率由以下方式獲得：將挑出的F2代幼體分別置於第一細胞培養板內，第一細胞培養板的每個孔內添加有0.15-0.22ml的輪蟲培養液，每24h更換一次，直至可以通過F2代帶卵情況分辨F2代為混交雌體或非混交雌體結束培養，此處採用的分辨方法為通過卵的不同形態進行分辨。具體地，輪蟲可以生產三種形態的卵，其中非混交雌體生產的非需精卵體積較大，卵膜薄而透明；混交雌體產生兩種卵，一種是雄卵，即需精卵未受精者，體積較小，約為非需精卵的一半至十分之一，卵膜較薄而透明，另一種為休眠卵，即受精後的需精卵，其體積比雄卵的體積大，具堅厚的卵殼，不透明，殼面上常有突起或雕刻花紋。需說明的是，此處所述術語「第一」、「第二」僅用於區分描述，即第一細胞板與第二細胞板均為細胞板。記錄上述各F2代混交雌體與非混交雌體的個數，通過混交雌體數量與雌體總數的比率得各F2代對應的有性個體比率。將F2代有性個體比率和對應的F1代種群密度進行非線性擬合，求得各F1代輪蟲的有性生殖閾密度；輪蟲的有性生殖發生與其種群密度密切相關，因而有性生殖閾密度的定義為當一個種群中出現有性雌體時的種群密度。本發明中，我們使用種群中一半雌體發生有性生殖時的種群密度Q50作為某一輪蟲品系有性生殖閾密度的指示標準。對於某一物種和克隆種群來說，這個值是判斷種群是否會發生有性生殖的關鍵指標，也是分析物種或種群有性生殖傾向性的一個重要依據。例如，利用非線性擬合公式進行擬合；其中，公式中y為有性個體比率，x為種群密度。將多個目標輪蟲品系的F1代輪蟲的有性生殖閾密度進行比較，得有性生殖傾向最低的輪蟲品系。本發明中採用的輪蟲培養液，可以直接購買於市面，也可以自行配置。優選地，本發明中優選為自行配置，具體地，採用間接配製法，即先配置濃縮母液，再向水中添加濃縮母液的方式配製最終使用的輪蟲培養液，其中水為雙重蒸餾水或純水，防止雜菌或雜質汙染該輪蟲培養液，影響其效果。配置該輪蟲培養液的具體各原料以及濃度如表1所示：表1輪蟲培養液的具體成分該輪蟲培養液營養豐富，適合輪蟲生存繁殖，提高輪蟲的存活率以及生長速度。試驗例在北京市的後海、密雲水庫以及玉淵潭分別採集後海品系輪蟲休眠卵、密雲水庫品系輪蟲休眠卵以及玉淵潭品系輪蟲休眠卵，其中，各品系輪蟲均為萼花臂尾輪蟲。將各品系輪蟲休眠卵分別置於盛有輪蟲培養液的容器內，將容器放置於25℃，光周期L：D＝16:8、光照強度為3000lx的恆溫培養箱中孵化，孵化而得的每個輪蟲單獨轉移至第二細胞培養板內，每孔加入2ml的輪蟲培養液，每隔1天更換一次輪蟲培養液，獲得各品系輪蟲的單克隆培養種群作為目標輪蟲品系。其中，單克隆培養種群的密度為1ind./ml，種群規模至少達到1000隻個體，於20℃之間，保持種群密度為1ind./ml的情況下穩定培養30天。然後將各目標輪蟲品系分別於環境密度≤0.1ind./ml的條件下穩定化增殖4周，建立單克隆培養母種群。從單克隆培養母種群中選擇帶卵輪蟲作為母體，使其於環境密度≤0.1ind./ml的條件下生產F1代輪蟲幼體，將齡長<2h的F1代輪蟲幼體分別單獨放置於輪蟲培養液中，使其種群密度分別為6.4ind./ml、3.2ind./ml、1.6ind./ml、0.8ind./ml、0.4ind./ml、0.2ind./ml、0.1ind./ml、0.05ind./ml、和0.025ind./ml，每個目標輪蟲品系設五個重複樣本。將各F1代輪蟲種群產生的F2代幼體分別挑出，單獨置於每個孔內添加有0.2ml的輪蟲培養液第一細胞培養板內培養，每24h更換一次輪蟲培養液，直至可以通過F2代所帶卵的形態分辨F2代為混交雌體或非混交雌體才結束培養，並通過有性雌體個數與總雌體的個數的比值求得各種群密度對應的有性個體比率，實驗數據如表2、表3以及表4所示：表2玉淵潭輪蟲品系實驗結果表3後海輪蟲品系實驗結果表4密雲水庫輪蟲品系實驗結果其中，輪蟲培養液的具體各原料以及濃度如表5所示：表5輪蟲培養液的具體成分將表2、表3以及表4的數據根據公式進行非線性擬合，其中，y為有性個體比率，x為種群密度，得各品系a、b、k的平均數值如下，並求得各品系的有性生殖閾密度，即當y為0.5時產生有性生殖的種群密度，如表6所示：表6各輪蟲品系的生殖閾密度abkyx玉淵潭0.887269.589279.378310.50.27後海0.8869642.024059.654130.50.41密雲0.9191517.5743616.170980.50.19由表6可得，後海品系的有性生殖閾密度值0.41最大，因此後海品係為有性生殖傾向最低的輪蟲品系。試驗例採用實施例中的三個目標輪蟲品系的F1代做三組種群增長實驗，每組設3個平行樣，具體地，在20攝氏度，光周期為L:D＝16:8，光照強度為3000lx，培養液中小球藻濃度為1×106cell/mL，每天更換新鮮培養液的培養條件下，進行該實驗30天，每天記錄各平行樣的種群密度，得到的各目標輪蟲品系的各平行樣的種群密度數據如表7、表8以及表9所示：表7密雲水庫品系的種群增長實驗結果由表7數據可知，密雲水庫品系在培養開始至培養25天，種群密度持續增長，最高平均種群密度30.8ind./mL，接著種群密度開始下降，有性生殖增強，產生大量休眠卵。表8後海品系的種群增長實驗結果由表8數據可知，後海品系在培養開始至培養25天，種群密度持續增長，第26天至培養結束，種群密度呈波動增長並維持穩定，結束實驗，最高平均種群密度59.6ind./mL，至結束培養平均種群密度57.4ind./mL，種群增長速度良好，有性生殖率低。表9玉淵潭品系的種群增長實驗結果由表9數據可知，玉淵潭品系在培養開始至培養25天，種群密度持續增長，最高平均種群密度28.2ind./mL，接著種群密度開始下降，有性生殖增強，產生大量休眠卵。根據表7、8、9的各品系輪蟲的種群密度的平均值可得，種群增長實驗過程中，三個品系的增長速度並非理論增長值，這是因為實際培養過程中，部分輪蟲先天性無法生育以及培養過程中會有幼體的死亡率等的影響，均為本實驗正常接受範圍內。由表7、8、9的數據可得，後海品系相比於其他兩組，具有顯著較高的種群增長率。根據表7、8、9的各品系輪蟲的種群密度的平均值製作各品系輪蟲種群(有性生殖閾密度不同)增長圖，增長圖參閱圖1，由圖1可以直觀的看出，後海品系的種群增長率遠高於其他兩組，即三者中，有性生殖傾向最低的後海克隆品系相比於其他兩組明顯具有較好的擴大培養潛力，從而證明本發明提供的輪蟲篩選方法安全可靠。綜上所述，本發明實施例的輪蟲的篩選方法，可快速，精準的篩選多個目標輪蟲品系中有性生殖傾向最低的輪蟲，並用於大批量培養，可顯著提高生產種群的輪蟲最大培養密度，有利於高密度集約化培養，從而解決有性生殖所帶來的輪蟲餌料供應不足的問題，節約生產成本，具有極佳的推廣價值。以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述並非旨在限制要求保護的本發明的範圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。當前第1頁1 2 3