從細菌中提取異源不溶性蛋白質的製作方法
2023-05-30 00:28:51 1
專利名稱：從細菌中提取異源不溶性蛋白質的製作方法
背景技術：
以含有編碼哺乳動物蛋白質的DNA序列的載體轉化細菌是常用的方法。用細菌表達哺乳動物蛋白質，可得到高產量的這種蛋白質，它包含在細菌的包涵體內。為了得到並純化這種蛋白質，必須從細菌中提取出含有蛋白質的包涵體。
在過去，分離包涵體的方法是通過離心發酵液體培養基(fermentation broth)，除去上清，將細菌沉澱物重懸在緩衝液中，然後用機械方法，如均質化處理或超聲處理，或者，用溶菌酶加去圬劑處理，使細菌細胞裂解。再將含有裂解細菌細胞的混合物離心，得到上清液和包涵體沉澱。包涵體沉澱物，是對細菌細胞體裂解和離心處理後得到的含有包涵體的沉澱。但是，這種處理方法包括離心含有活細菌發酵液體培養基的第一步操作。在大批量的離心過程中，活細菌常常會以氣溶膠的形式被離心發散到周圍的空氣中。
美國專利4,958,007通過在發酵液體培養基中加入甲苯或酸來首先使細菌滅活而解決了這個問題。然後將此培養基離心，除去上清液，將細菌沉澱物重懸在緩衝液中，並調整此懸液的pH，使最終pH為6-9。換句話說，就是將被酸化的發酵液體培養基的pH，調整到6-9。然後通過均質化處理使細菌細胞裂解，從細胞中釋放出包涵體。這種方法避免了在離心過程中活細菌發散到空氣中；但是，如果使用甲苯滅活細菌，這種方法必須在防爆炸的房間內操作，因為甲苯是易燃性的，它的氣霧會引起爆炸。而且，如果用酸滅活細菌，細菌沉澱物重懸於緩衝液中，再將懸液的pH調整至最終pH為6-9，這樣，會使原來可溶性的細菌蛋白質變成不溶性的，結果導致包涵體沉澱中含有不可接受的高濃度宿主細菌蛋白質。
因此，有必要對提取不溶性重組蛋白質的方法進行改進，改進的方法應該在離心之前就殺滅全部或絕大部分細菌，絕大部分宿主細菌蛋白質應保留在溶液中，佔絕對優勢的不溶性蛋白質應該是細菌表達的異源性蛋白質。發明概述本發明通過當細菌尚存在於發酵液體培養基中時，裂解這種表達異源性蛋白質的細菌，隨後可任選地用酸處理滅活細菌，來滿足上述改進要求。然後可以在不發散活菌的狀態下進行離心。這種對細菌的裂解處理，顯著地降低了活菌的數量，並且可以在密閉系統中進行操作，使含有活菌的液體培養基的發散降到最小程度，或者完全消除。用本發明方法獲得的包涵體含有更高純度的異源性蛋白質，也就是說與按用現有的技術提取得到的包涵體相比較，這種包涵體含有更低濃度的不溶性細菌蛋白質。
本發明提供了三種從表達異源性蛋白質的細菌中提取含有異源性蛋白質的包涵體的方法。
第一個實施方案包括如下步驟(a)在發酵液體培養基中發酵表達異源不溶性蛋白質的細菌；(b)裂解包含在發酵液體培養基中的細菌；(c)離心該發酵液體培養基，得到包涵體沉澱和上清液；(d)除去上清液，得到包涵體沉澱。
本發明的第二個實施方案包括如下步驟(a)在發酵液體培養基中發酵表達異源不溶性蛋白質的細菌；(b)裂解包含在發酵液體培養基中的細菌；(c)在0-15℃的溫度下冷卻或保持該發酵液體培養基；(d)向已均質化處理的發酵液體培養基加入酸，使其pH達到大約2.0；(e)在0-15℃的溫度下溫育被酸化的發酵液體培養基，以便殺滅所有殘存的未被裂解的細菌；(f)離心該發酵液體培養基，得到包涵體沉澱和上清液；(g)從包涵體沉澱物中除去上清液；(h)將此包涵體沉澱懸浮在緩衝液中，得到懸浮液；(i)將pH調整液加入到該懸浮液中，使懸浮液的pH達到6-9；(j)裂解在步驟(i)的懸浮液中包含的懸浮固體；(k)離心該懸浮液，得到含有異源性蛋白質的包涵體沉澱和上清液；(l)除去上清液，得到被分離出的含有異源性蛋白質的包涵體。
本發明的第三個實施方案包括如下步驟(a)在發酵液體培養基中發酵表達異源不溶性蛋白質的細菌；(b)裂解包含在發酵液體培養基中的細菌；(c)在0-15℃的溫度下冷卻或保持該發酵液體培養基；(d)將硝酸加入到該發酵液體培養基中，使其pH達到約2.0；(e)在大約0-15℃的溫度下培育這種酸化的發酵液體培養基，以便殺滅細菌；(f)使該液體培養基的pH上升到大約8.5；(g)對此液體培養基作裂解處理；(h)離心已裂解的液體培養基，得到包涵體沉澱和上清液；(i)除去上清液，得到分離的含有異源性蛋白質的包涵體。附圖的簡要說明該圖顯示，用本發明的方法得到的，和不是用本發明的方法得到的包涵體的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖。發明詳述在此引用的所有美國專利(U.S.Patents)作為一個整體在此引入作為參考。
本發明提供了幾種方法，用於提取不溶性的非細菌蛋白質，特別是提取通過基因轉化的細菌，如大腸桿菌(E.Coli)產生的哺乳動物蛋白質。在細菌中表達的非細菌蛋白質被稱為異源性蛋白質。在此所用的術語「轉化的細菌」表示該細菌是經基因工程轉化能產生異源性蛋白質的細菌。這種基因工程轉化通常需要對細菌引入一個表達載體。這種表達載體能夠自我複製，並能依靠細菌基因組內的相關基因進行蛋白質表達。細菌表達載體的構建是本專業人員熟知的，只要編碼目標蛋白質的核苷酸序列是已知的，或者是可以得到的。例如，DeBoer在美國專利4,551,433中公開了用於細菌表達載體的啟動子，Goeddel等在美國專利4,601,980中，以及Riggs在美國專利4,431,739中，公開了用大腸桿菌表達系統生產哺乳動物蛋白質的方法；下列文獻中公開了如何構建用於細菌表達的合成基因的方法Riggs，同上述，Ferretti等，美國國家科學院院刊83599(1986)，Sproat等，核酸研究132959(1985)，和Mullenbach等，生物化學雜誌261719(1986)。很多細菌表達載體可從市售得到，或者通過美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，Maryland)獲得。
在一種細菌培養基中，將已經被表達載體轉化的細菌，在刺激異源性蛋白質表達的條件下培養生長。這種含有轉化細菌的細菌培養基被稱為發酵液體培養基。
在本發明的第一個實施方案中，通過用標準的技術，在0-25℃的溫度下，對發酵液體培養基作超聲波處理或均質化處理，將表達異源性蛋白質的轉化細菌裂解，優選的是轉化的大腸桿菌。通常對整個發酵液體培養基的超聲處理或均質化處理，應當持續進行直到全部細胞基本上都被裂解為止。這樣可以通過後續的離心處理，從包涵體中有效地除去可溶性蛋白質和細胞小碎片，最後可以得到最高的蛋白質純度。
超聲處理通常可用於裂解包含在分析量體積(10-20ml)發酵液體培養基中的細菌。對於更大量的材料，應該用高壓均質化處理。對於分析量體積(10-20ml)的發酵液體培養基，可用Heat-Systems-Ultrasonic，Inc的No.W-85型超聲處理器(Ultrasonic ProcessorMode No.W-85)，它配有一個1/8英寸(3.2mm)的錐形微管頭，對於總量為10ml的液體培養基，可優選地在50％工作循環下，用18分鐘總超聲處理時間，1秒脈衝(9分鐘淨超聲處理時間)。
如果用均質化處理來裂解細菌，優選的是對發酵液體培養基進行多次處理。已經證明，在11000磅/英寸2(psi)的壓力下，使發酵液體培養基3次通過MICROFLUIDIZER(M-110型微型流控器)是適當的。在超聲處理或使用MICROFLUIDIZER均質化處理過程中，優選使系統密閉以防止活菌散發。大尺寸的均化器常常安裝在密閉系統中。
然後將經超聲處理或均質化處理的發酵液體培養基離心，得到含有包涵體的溶液和上清液。離心的速度應該足以使絕大多數包涵體被沉澱，但是，又應該足夠慢，以保持絕大多數細胞碎片在上清液中懸浮。這種離心速度一般應該是大約5000rpm-10000rpm(轉/分鐘)。優選的是7000-10000rpm，用1.5英寸的錐形微型離心管，在Model No.5402EPPENDORF微型離心機中離心大約10分鐘或一個等效的時間。然後除去上清液，得到含有異源性蛋白質的包涵體。
在本發明的第二個實施方案中，當細菌在發酵液體培養基中被裂解之後，使該液體培養基的溫度下降到0-15℃。然後，在大約0-15℃的溫度下用硫酸，磷酸，硝酸或鹽酸使發酵液體培養基的pH降到大約2.0，再在此溫度下溫育該液體培養基，以便殺滅所有殘存的細菌，典型地是溫育大約1小時。這步操作是重要的，因為單純均質化處理不能殺滅全部細菌。用於降低pH的優選的酸是磷酸或者硝酸。然後如上所述離心該發酵液體培養基，除去上清液，分離出包涵體沉澱。再將此包涵體沉澱懸浮於緩衝液中。可用於再懸浮這種沉澱的緩衝液是例如磷酸鈉，磷酸鉀和三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸(TRIS)。優選的緩衝液含有50mMTRIS，5mM EDTA和50mM NaCl，pH8.5(TEN緩衝液)。所形成懸浮液的最終pH可用適合的鹼調整到大約為6.0-9.0，優選的是8.5。可用於pH調整步驟的適合的鹼是例如NaOH，KOH等等。用於升高pH的優選鹼溶液是25％w/v NaOH溶液。
然後將經pH調整的懸浮液，用超聲處理或均質化處理再次進行裂解，以便使存在於懸浮液中的固體成分分散開，隨後進行離心。最後，除去包含可溶性宿主細菌蛋白質和細胞碎片的上清液，回收含有不溶性哺乳動物蛋白質的沉澱。如果有必要，可用優選的約pH8.5的緩衝液將該沉澱洗一次或二次。在0-15℃的溫度下加酸是必要的。其它所有的提取操作可在0-32℃的溫度下進行。
在本發明的第三個實施方案中，表達異源不溶性蛋白質的細菌是培養在發酵液體培養基中。發酵液體培養基中的細菌，可用上述的超聲處理或均質化處理使之裂解。然後該發酵液體培養基的溫度下降至0-15℃，並將硝酸加到發酵液體培養基中，使該液體培養基的pH降至大約2.0。然後將該發酵液體培養基在0-15℃下溫育，持續能殺滅所有殘留細菌的必要時間長度，典型的是大約1小時。
然後再使該發酵液體培養基的pH上升至大約8.5，並通過均質化處理或超聲處理，使包含有殘留細菌的懸浮固體再次被裂解。在此第二次裂解處理之後，將該液體培養基離心，得到上清液和包涵體沉澱。然後除去上清液，得到被分離的含有不溶性異源蛋白質的包涵體。
在大批量操作時，優選的是採用實施方案2和3的酸殺菌方法，因為酸殺菌方法易於殺滅基本上100％的細菌。而僅用均質化處理要殺滅100％的細菌，成本上是不值得的。因為，為了達到這個目標，需要通過多次均質化處理。
分離出包涵體之後，可用標準的生物化學方法對異源性蛋白質進行去摺疊，再摺疊和進行純化。可參見例如《蛋白質純化指南》(Guide toProtein Purification，Deutscher等編輯(Academic Press，SanDiego，CA，1990))。
下列的實施例將對本發明作詳細描述。顯然，對於本領域的技術人員，有可能在不違背本發明的目的和意圖的前提下，對材料和方法進行修改。
本發明可以用如下的，非限制性實施例來闡明。除非另有說明，對於如下固體混合物中的固體，液體中的液體，以及液體中的固體，所給出的百分數分別是基於重量/重量(wt/wt)，體積/體積(vol/vol)和重量/體積(wt/vol)。
實施例1(本發明的實施方案1)用於本實施例的人白介素-10(IL-10)表達質粒含有如下序列(a)人IL-10編碼區核苷酸序列，Viere，P.等，美國國家科學院院刊，881172(1991)；(b)tac啟動子，其3』末端與IL-10編碼區核苷酸序列的5』末端併合，Zurawski，等，免疫學雜誌，1373554(1986)；(c)lpp 3』編碼區和非編碼區，包括轉錄終止區，位於rh IL-10編碼區的下遊，Ghrayeb，J.等，EMBO.J.32437(1984)；(d)來自質粒pBR 322的四環素抗性基因，Sutcliff.J.G.，C.S.H.Sypmp.Quant.Biol.135612(1978)；(e)copTS可熱誘導複製起點，Hakkaart，M.J.J.等，分子基因遺傳學，183326(1981)和Andreoli，P.M.等，微生物學雜誌，135612(1978)發酵將含有上述質粒的E.Coli K 12株培養物，在通氣和振蕩的條件下，在水基發酵培養基中培養。每升培養基含有30g酪蛋白胺基酸(Difco)，20g酵母膏(Difco)，5g磷酸二氫鉀，20g甘油，1gMgSO4，和10mg四環素(Sigma)。用25％w/v NaOH調整pH至7.0，溶解氧在5psi的壓力下，維持在相對於空氣的30-100％飽和度。起始溫度控制在30℃。當用配有NO.54綠色濾光片的Klett Summerson比色計測定，發現培養物的濁度達到大約100 Klett單位時，使溫度上升到約38℃，12-14小時後收穫培養物。
提取為了裂解細菌細胞，可在大約11000psi壓力下，使全部發酵液體培養基通過MICROFLUIDZER M-110勻化器(Microfludics公司)三次。勻化器和產物容器都置於冰浴中，這樣可使均質化懸浮液的溫度保持在0-15℃。
然後將該發酵液體培養基的溫度下降至4℃，並在pH7下振蕩大約1小時。接著將該懸浮液分成250ml的等分量，在4℃下，用SORVAL離心機(RC5C型)，在GS-3轉頭中，以轉速8000rpm離心65分鐘。棄去上清液，被提取的IL-10留在沉澱中。可用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(Laemmli，U.K.Nature 227680(1970))顯示所得到包涵體的純度，如
圖1泳道1所示。按照這種方法，將此包涵體再懸浮於緩衝液中，使其濃度在1cm的光路(比色杯)中，與初始液體培養基的光密度差等於15 OD550。該緩衝液包含2.3％十二烷基磺酸鈉(SDS)，10％甘油，0.062M Tris-HCl pH6.8，0.001％溴酚蘭和5％β-巰基乙醇(新鮮加入)。用DAIICHI微型梯度凝膠板(共有12個加樣孔)，每個加樣孔加入10μl樣品。凝膠板在電泳緩衝液中，在恆定的電流下(35mA/每塊凝膠板)進行電泳。當蘭色染料到達凝膠板底部時，切斷電流，將凝膠板按Laemmli所述方法顯影，文獻同上。結果如附圖中泳道1所示。
實施例2(本發明的實施方案2)如實施例1所述製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。當發酵液體培養基如實施例1中所述被均質化之後，使該液體培養基的溫度降低至4℃，並通過加入85％w/w磷酸，使其pH降至2.0。然後將此酸化的懸浮液在4℃下振蕩大約1小時。接著將此酸化的懸浮液分成250ml的等分量，在4℃下，用SORVAL離心機(RC5C型)，在GS-3轉頭中以轉速8000rpm離心65分鐘。棄去上清液，用1/4起始發酵液體培養基體積的TEN緩衝液再次懸浮包涵體沉澱，並用25％NaOH溶液使該緩衝液的pH上升至8.5。再使形成的懸浮液通過MICROFLUIDIZER M-110勻化器三次，並如上所述用SORVAL離心機，在GS-3轉頭中離心。棄去上清液，被提取的IL-10留在沉澱中。
用SDS-PAGE顯示所得到包涵體的純度，如附圖中泳道2所示。
實施例3(本發明的實施方案2)如實施例2所述製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。用9NHNO3溶液，而不是用磷酸，使發酵液體培養基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE顯示所得到包涵體的純度，如附圖中泳道3所示。
實施例4(本發明的實施方案2)如實施例2所述製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。用9NH2SO4溶液，而不是用磷酸，使發酵液體培養基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE顯示所得到包涵體的純度，如附圖中泳道4所示。
實施例5(不是本發明的實施方案)如實施例2所述，用85％w/w磷酸酸化均質化液體培養基，製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。在將酸化的懸浮液振蕩1小時之後，用25％w/v NaOH溶液使該懸浮液的pH上升至8.5。使該懸浮液通過MICROFLUIDIZER M-110勻化器三次，並分成250ml的等分量，在4℃下，用SORVAL離心機(RC5C型)，在GS-3轉頭中以轉速8000rpm離心65分鐘。棄去上清液，被提取的IL-10留在沉澱中。
用SDS-PAGE顯示所得到包涵體的純度，如附圖中泳道5所示。
實施例6(實施方案3)如實施例5所述製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。用9NHNO3溶液降低發酵液體培養基的pH至2.0。
用SDS-PAGE顯示所得到包涵體的純度，如附圖中泳道6所示。
實施例7(不是本發明的實施方案)如實施例5所述製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。用9NH2SO4溶液降低發酵液體培養基的pH至2.0。
用SDS-PAGE顯示所得到包涵體的純度，如附圖中泳道7所示。
實施例8(不是本發明的實施方案)泳道8顯示如國際專利申請PCT/US94/01909中所述的，從中國倉鼠卵巢中製備和純化的IL-10的純度。通過如實施例1中所述的SDS-PAGE圖來測定純度，不同的是對加樣孔加入20ml樣品。
實施例9(不是本發明的實施方案)泳道9顯示一個高分子量標準標誌物，用於估算圖中其他泳道中蛋白質的分子量。
實施例10(現有技術)按實施例1發酵產生IL-10的細菌。發酵作用完成之後，用9NHNO3使該發酵液體培養基的pH降低至2.0，並振蕩1小時。然後用25％W/V NaOH使該液體培養基的pH上升至8.5。使形成的懸浮液通過MICROFLUIDIZER M-110勻化器三次，並如上所述用SORVAL離心機在GS-3轉頭中離心。棄去上清液，被提取的IL-10留在沉澱中。
用SDS-PAGE顯示所得到包涵體的純度，如附圖中泳道10所示。
實施例11(現有技術)如實施例10所述製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。用9NH2SO4溶液使發酵液體培養基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE顯示所得到的包涵體的純度，如附圖中泳道11所示。
實施例12(現有技術)如實施例10所述製備含有IL-10的包涵體，除有如下更改。用85％w/w H3PO4溶液使發酵液體培養基的pH降低至2.0。
用SDS-PAGE顯示所得到的包涵體的純度，如附圖中泳道12所示。
結論圖1顯示，本發明的實施方案具有獲得含有低濃度雜質的包涵體的驚人能力，即此包涵體內僅含有低濃度不溶性宿主蛋白質。圖中泳道1顯示的含有IL-10的包涵體的SDS-PAGE凝膠，是按本發明的第一個實施方案，在實施例1中的提取結果。含有細菌的發酵液體培養基經過均質化處理和離心，得到被分離的高純度包涵體。
圖1泳道2，3和4顯示按本發明的第二實施方案獲得的包涵體的純度。泳道2，3和4顯示的包涵體，是分別按照實施例2，3和4得到的，其中對均質化的發酵液體培養基進行了酸化處理，並在0-15℃的溫度下溫育，然後離心得到包涵體沉澱和上清液。將此沉澱再懸浮於緩衝液中，使其pH上升至8.5，並將此懸浮液作均質化處理。然後再次離心，分離出包涵體沉澱。為了酸化該均質化處理的液體培養基，實施例2(泳道2)用磷酸，實施例3(泳道3)用硝酸，實施例4用硫酸。圖1明顯地表明，本發明的第二實施方案能獲得高純度的包涵體。
用實施例6的方法得到的泳道6，顯示的是按照本發明的第三實施方案的方法獲得的包涵體的SDS-PAGE凝膠。在此實施方案中，被均質化處理的發酵液體培養基的pH是用硝酸使之降低至大約2.0，並在0-15℃的溫度下振蕩大約1小時。然後再使該液體培養基的pH上升至大約8.5。接著將此液體培養基再次作均質化處理，並離心得到被分離的包涵體。按照本發明的第三實施方案，只有用硝酸才能得到高純度的包涵體。如果用磷酸或者硫酸代替硝酸，將會得到含有不可接受的高濃度不溶性宿主細菌蛋白質的包涵體，分別如實施例5，泳道5和實施例7，泳道7所示。
泳道8是通過中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生的人IL-10 SDS-PAGE凝膠。泳道9是高分子量標準的SDS-PAGE凝膠。泳道10，11和12顯示分別在實施例10，11和12中，按照現有方法得到的包涵體SDS-PAGE凝膠，表明與按照本發明的方法提取的包涵體相比較，用已前從細菌中提取異源性蛋白質的方法得到的包涵體，基本上都含有較高濃度的宿主蛋白質。
總之，按照本發明的所有實施方案都能獲得較高純度的包涵體，如圖1中泳道1，2，3，4和6所示，而用其它方法提取包涵體時，會導致包涵體含有不可接受的高濃度宿主蛋白質。
當本發明以上述具體的實施方案被描述之後，本領域普通的技術人員可能知道多種本發明的替換，修改和變更。所有這些替換，修改和變更都應歸入本發明的精神和範圍之中，其只通過權利要求來加以限制。
權利要求
1.一種從表達異源性蛋白質的細菌中提取該異源性蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)在發酵液體培養基中發酵細菌；(b)裂解包含在發酵液體培養基中的細菌；(c)離心該發酵液體培養基，得到包涵體沉澱和上清液；(d)除去上清液，得到分離的含有異源性蛋白質的包涵體沉澱。
2.一種從表達異源性蛋白質的細菌中提取該異源性蛋白質的方法，其包括如下步驟(a)在發酵液體培養基中發酵細菌；(b)裂解包含在發酵液體培養基中的細菌；(c)在大約0-15℃的溫度下冷卻或保持該發酵液體培養基；(d)向該發酵液體培養基加入酸，使其pH達到大約2.0；(e)在0-15℃的溫度下溫育被酸化的該發酵液體培養基，以殺滅所有殘存的未被裂解的細菌；(f)離心發酵液體培養基，得到包涵體沉澱和上清液；(g)從包涵體沉澱上除去上清液；(h)將此包涵體沉澱懸浮在緩衝液中，得到懸浮液；(i)將pH調整溶液加入到該懸浮液中，使懸浮液的pH達到6-9。(j)裂解在步驟(i)的懸浮液中包含的懸浮固體；(k)離心該懸浮液，得到含有異源性蛋白質的包涵體沉澱和上清液；(l)除去上清液，得到分離的含有異源性蛋白質的包涵體。
3.權利要求2的方法，其中被酸化的發酵液體培養基被保持在0-25℃的溫度。
4.權利要求2的方法，其中步驟(d)中被酸化的發酵液體培養基，在離心之前，在0-15℃的溫度下溫育大約1小時。
5.權利要求2的方法，其中所用的酸選自磷酸，硝酸，鹽酸和硫酸。
6.一種從表達異源性蛋白質的細菌中提取該異源性蛋白質的方法，其基本上由如下步驟組成(a)在發酵液體培養基中發酵該細菌；(b)裂解包含在發酵液體培養基中的細菌；(c)在大約0-15℃的溫度下冷卻或保持該發酵液體培養基；(e)將硝酸加入到該發酵液體培養基中，使其pH達到約2.0；(f)在0-15℃的溫度下溫育被酸化的發酵液體培養基，以便殺滅細菌；(g)使該液體培養基的pH升到大約8.5；(h)使包含在該液體培養基中的固體裂解並分散開；(i)離心該發酵液體培養基，得到上清液和含有包涵體的包涵體沉澱；(j)除去上清液，得到分離的含有異源性蛋白質的包涵體。
全文摘要
從表達哺乳動物蛋白質的轉化細菌中提取不溶性哺乳動物蛋白質，通過對發酵液體培養基作均質化處理，並離心該均質化的液體培養基，從含有包涵體的沉澱上除去上清液，從而避免了宿主細菌蛋白質的不可逆性不溶解化作用。在另一個實施方案中，將被均質化液體培養基的pH在離心之前調整到2.0。然後將這種酸化的液體培養基離心，並將其沉澱再懸浮在緩衝液中，再次進行均質化處理，再通過離心分離出包涵體。
文檔編號C12P21/00GK1156481SQ95194734
公開日1997年8月6日 申請日期1995年6月19日 優先權日1995年6月19日
發明者Y·阿爾羅伊, J·朱, R·康登 申請人:先靈公司