不含清蛋白的紅細胞生成素製劑的製作方法
2023-05-30 00:54:56 1
專利名稱：不含清蛋白的紅細胞生成素製劑的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及穩定的紅細胞生成素(erythropoietin)(下文簡稱為「EPO」)溶液製劑，其不含血液衍生蛋白，因而具有長期儲存穩定性而無病毒汙染的危險，並且通過包括一種穩定劑來保證生物活性，該穩定劑能夠替換血液衍生成分，即清蛋白或精製明膠。
背景技術：
EPO是一種糖蛋白激素，其屬於包括集落刺激因子(CSF)的細胞因子類，而且主要在腎中產生，也有一些在肝臟中產生。EPO通過促進祖紅細胞(erythroid progenitor cell)的分化和增殖，在產生成熟紅細胞中起主要作用。EPO因其作用具有各種應用，包括治療與腎病有關的貧血症，要求移植骨髓的貧血症，以及與類風溼性關節炎有關的貧血症，與癌症或抗癌劑有關的貧血症，與AIDS有關的貧血症，並且被用來治療患再生障礙性貧血症和慢性腎衰竭的病人。
為了治療上述疾病，設計用於在市場上提供蛋白如EPO的穩定製劑的藥物要求抑制在製備藥物製劑期間發生的化學和物理變化，例如水解，二硫化物交換反應，變性，凝集和吸附，並且要求保持蛋白類藥物的生物活性。
因此，人們致力於抑制EPO製劑的化學或物理變化，以及保持EPO在長期儲存期間的生物活性。為保持EPO蛋白類藥物在長期儲存期間的生物活性，可在EPO藥物製劑中採用穩定劑。
例如，美國專利號4,879,272公開了一種採用人血清清蛋白，牛血清清蛋白，卵磷脂，葡聚糖，環氧乙烷-環氧丙烷共聚物，羥丙基纖維素，甲基纖維素，聚乙二醇氫化蓖麻油，聚乙二醇和類似物來防止水溶液中的EPO變性和被吸收到容器壁內表面的方法。此外，該專利還描述了作為吸附抑制劑的人血清清蛋白的濃度和由於吸附造成的EPO損失之間的關係。
如參考專利中所述，人或牛血清清蛋白，精製明膠和類似物通常被用作穩定劑，用於改善傳統蛋白類藥物製劑中蛋白的穩定性。然而，由於人血清清蛋白在其來源上是依賴於捐獻血液的血液產品，因此很難完全避免病毒汙染的危險。
為了解決這個問題，人們致力於開發一種不採用血液衍生成分就能穩定作為蛋白類藥物的EPO的方法。例如，美國專利號4,992,419公開了一種具有生物相容性和儲存穩定性的EPO製劑，其包括EPO；生理上相容的磷酸鹽緩衝劑；5到50g/L脲；1到50g/L胺基酸；以及0.05到5g/L非離子表面活性劑，其中所述的胺基酸選自L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸，L-穀氨酸，L-蘇氨酸及其混合物；所述的非離子表面活性劑是多聚乙二醇(polymacrogol)類型，例如聚失水山梨糖醇月桂酸亞己酯(polyethylene sorbitan laurate)，失水山梨糖醇三油酸酯以及油酸聚乙二醇醚。該專利表明在無清蛋白的情況下可將EPO蛋白製成儲存穩定的形式。
此外，美國專利號6,120,761揭示了一種用於製備EPO製劑的技術，該EPO製劑不含異質蛋白，例如人血清清蛋白或精製明膠，並通過將胺基酸，例如亮氨酸，絲氨酸，穀氨酸，精氨酸，組氨酸，和類似物用作穩定劑，使EPO處於一種穩定形式。
國際專利申請WO 00/61169公開了另一種穩定的EPO製劑，其包括pH緩衝劑，山梨聚糖單-9-十八烷酸酯聚氧-1，2-乙烷二基衍生物(sorbitan mono-9-octadenoate polyoxy-1，2-ethanediyl derivative)和胺基酸。在這一應用中，一種優選的EPO藥物製劑包括在磷酸鹽緩衝劑體系中作為穩定劑的聚山梨醇酯80和甘氨酸組合。
另一些努力在於對EPO以外的蛋白類藥物進行穩定化處理。例如，國際專利申請WO 00/48635(EP 1154796)公開了一種不含清蛋白的凍幹的因子VIII組合物，其用於治療由缺乏因子VIII導致的血友病A，該組合物包括凝結因子，即因子VIII，其用作抗血友病因子。這一應用表明在無清蛋白存在的情況下，通過採用穩定劑和填充劑(bulkingagent)，例如胺基酸和糖，可製備血液成分的藥物製劑。具體來說，除了因子VIII之外，可向製劑中加入以下成分4％到10％的填充劑，選自甘露醇，甘氨酸和丙氨酸，或2％到6％的羥乙基澱粉(hydroxyethylstarch)(下文中簡稱為″HES″)作為填充劑；1％到4％的穩定劑，選自蔗糖，海藻糖，棉子糖和精氨酸；1mM到5mM鈣鹽；100mM到300mM氯化鈉；以及pH保持為約6到8的緩衝劑。
此外，如美國專利號5,358,708中所描述的，可採用蛋氨酸，組氨酸或其混合物作為穩定劑，使蛋白類藥物例如幹擾素，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSFs)或白細胞介素穩定化並延長其儲存期。
美國專利號4,457,916公開了一種穩定腫瘤壞死因子(TNF)的方法，該腫瘤壞死因子是由巨噬細胞產生的蛋白，存在為水溶液或粉末形式，該方法基於採用選自下列的穩定劑非離子表面活性劑，選自D-半乳糖，D-木糖，D-葡糖醛酸，海藻糖，葡聚糖和HES中的一種物質，及其混合物。通過採用這類選自非離子表面活性劑，具體的糖或與糖相關的化合物及其混合物的穩定劑，可將TNF製成水溶液或粉末形式，其可被儲存一段延長的時間而不失活，且通過冷凍、融化，凍幹以及加熱預處理而變得穩定。
然而，當為了使EPO製劑穩定而對其進行凍幹時，凍幹增加了上述物理和化學問題的危險。即使解決了這些問題，EPO製劑的凍幹還存在另一缺點，即製造成本過高。
因而，本發明人特意發明了一種可注射形式的穩定EPO溶液製劑，其不含血液衍生蛋白，因而不存在病毒汙染的危險，並且通過採用EPO穩定劑，而具有長期儲存穩定性並保證了生物活性，該EPO穩定劑能替代傳統用於蛋白類製劑的穩定劑，清蛋白。
發明內容
本發明提供了一種可注射和穩定的紅細胞生成素(erythropoietin)(EPO)溶液製劑，通過利用不含血液來源蛋白的穩定劑，該製劑保持其活性一段延長的時間，而無病毒汙染的危險，該製劑包括EPO，不含清蛋白的穩定劑，非離子表面活性劑，以及張度劑(tonicity agent)。
附圖簡述
圖1示出了在40℃下儲存一星期之後，EPO殘留率和羥乙基澱粉(HES)濃度的關係圖。
實施本發明的最佳方式對本領域技術人員而言明顯的是，不同蛋白在儲存期間和不同條件下會因其化學性質的差異以不同的比率逐漸失活。
也就是說，用於蛋白穩定的物質對延長蛋白儲存期的積極作用對不同蛋白並不相同。出於這一原因，用於實現儲存穩定性的穩定劑的用量和類型會根據感興趣的蛋白的類型而變化。此外，當對不同的蛋白採用同一穩定劑時，由於在儲存期間蛋白在性質和濃度上的變化，因此該穩定劑對蛋白穩定有不同效果。
因此，本發明人意欲發現一種非蛋白穩定劑，其能夠在儲存期間使EPO穩定，從而提供一種穩定的EPO溶液製劑，該製劑能夠使EPO的生物活性保持一段延長的時間，而無病毒汙染的危險。
本發明人旨在實現上述目的而進行的透徹全面的研究導致了本發明，結果發現，採用HES和/或特定胺基酸作為穩定劑而獲得了可注射和穩定的EPO溶液製劑，該製劑不含異質蛋白例如人血清清蛋白或精製明膠，因而無病毒汙染危險，該製劑使EPO的生物活性保持一段延長的時間。
此處所用的術語″穩定″或″穩定化(劑)″意欲表示在特定的儲存條件下儲存一段預定時間的情況下，活性成分的損失一般低於10％。通常，在10℃下儲存2年，在25℃下儲存6個月，或在40℃下儲存1或2星期的情況下，保持EPO殘留率為90％或更高，優選約95％時，認為EPO製劑是穩定的。
EPO和其它蛋白類藥物的儲存穩定性對確保精確劑量，以及抑制EPO的抗原物質的可能產生是很重要的。認為，只要EPO未轉化為組合物中聚集體或片段形式的抗原化合物，對於實際給藥，EPO在製備和/或儲存期間的損失約10％是可接受的。
下文將更加詳細地介紹本發明。
一方面，本發明提供了一種穩定的EPO溶液製劑，其包括治療有效量的EPO，不含清蛋白的穩定劑，非離子表面活性劑以及張度劑。
在一個優選的方面中，本發明提供了一種穩定的EPO溶液製劑，其包括羥乙基澱粉(HES)或HES和胺基酸的混合物作為穩定劑。
在上述方面中，本發明中採用的羥乙基澱粉(HES)優選使用的濃度為0.1％到10％，更優選為0.1％到3％。
本發明穩定的EPO溶液製劑還可包括另一穩定劑，胺基酸，其選自穀氨酸，穀氨醯胺，甘氨酸或它們的鹽，及其混合物。
此外，本發明穩定的EPO溶液製劑中採用的非離子表面活性劑可選自聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯脂肪酸酯，聚氧乙烯烷基酚醚，失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯，以及聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
更優選地，非離子表面活性劑可選自聚山梨醇酯20和80及其混合物。
此外，用於本發明EPO溶液製劑的張度劑可選自氯化鈉，甘露醇，山梨醇及其混合物。
更優選地，所述張度劑是氯化鈉。
在一個更優選的方面中，本發明穩定的EPO溶液製劑是溶解於本領域公知的生理上可接受的緩衝劑中的溶液製劑。
更優選地，該緩衝劑是注射用水。
對本領域技術人員顯而易見的是，本發明的以上目的或其它目的，特徵以及其它優點在以下詳細描述、實施例以及附上的權利要求書中將能被更清楚地理解。
本發明中採用的EPO是採用任何方法從天然的或重組的來源或從這兩者製備得到的。天然EPO可從血液或尿中提取。重組EPO可在遺傳重組法轉化的哺乳動物細胞培養物中製備。
本發明的EPO溶液製劑中含有治療有效量的EPO。通常，治療有效量的EPO為單次使用的小瓶中有約2,000到10,000國際單位(IU)。
本領域通常使用的EPO穩定劑是不含血液衍生成分如清蛋白和明膠的藥學優選組合物，其例子有糖類，包括單糖和多糖，糖醇，環多醇，胺基酸，無機鹽，有機鹽，含硫還原劑，表面活性劑和螯合劑。其它有用的穩定劑可包括基本化合物例如精氨酸，胍或咪唑；聚合物例如聚乙烯-吡咯烷酮和聚乙二醇；以及二肽例如甘氨醯甘氨酸和甘氨醯-L-穀氨酸。
作為EPO穩定劑，糖類可包括單糖，如甘露糖，葡萄糖，果糖和木糖；和多糖，如乳糖，麥芽糖，蔗糖，棉子糖和葡聚糖；而糖醇可包括甘露醇，山梨醇和甘油。環多醇可包括肌醇。
此外，作為EPO穩定劑的胺基酸包括甘氨酸，丙氨酸，賴氨酸，亮氨酸，穀氨酸，天冬氨酸，組氨酸，脯氨酸和色氨酸的L和D異構體，以及它們的鹽。
EPO溶液製劑還可包括無機鹽，例如，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣，磷酸鈉，磷酸鉀，以及碳酸氫鈉；有機鹽，例如，檸檬酸鈉，檸檬酸鉀和醋酸鈉；以及含硫還原劑，例如，穀胱甘肽，硫辛酸，硫基乙醇酸鈉，硫甘油，α-單硫甘油以及硫代硫酸鈉。
有用的表面活性劑包括非離子表面活性劑，其包括帶有親水性或疏水性部分的嵌段聚合物，如聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯脂肪酸酯，聚氧乙烯烷基酚醚，失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯；以及聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，採用接枝共聚法合成的聚合物活化劑。
聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯包括以商品名Tween銷售的聚山梨醇酯。此外，聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的商業可得例子包括以商品名Poloxamer或Pluronic銷售的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
本發明可注射和穩定的EPO溶液製劑包括一種主穩定劑HES；另一種穩定劑，胺基酸；選自氯化鈉，甘露醇，山梨醇及其混合物的張度劑；選自聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80及其混合物的非離子表面活性劑；以及注射用水。
更詳細地，在本發明用作主穩定劑的HES是葡萄糖單元的高度支化聚合物，它是通過支鏈澱粉進行鹼性羥乙基化作用而合成的。清蛋白是一種單分散性的膠體，分子量為69,000g/mole，與用作血漿增量劑的清蛋白不同的是，HES則是多分散性的膠體，其中聚合物的80％的分子量為30到2,400,000g/mole。本發明中採用的HES是一種中等分子量的HES，其平均分子量為200,000g/mole。
本發明穩定的EPO溶液製劑中所含用作主穩定劑的HES的優選使用濃度為0.1％到10％，更優選為0.1％到3％。
本發明穩定的EPO溶液製劑中採用的另一種穩定劑包括胺基酸和其鹽，如鈉鹽鉀鹽和鹽酸鹽。
優選的胺基酸包括穀氨醯胺，甘氨酸，精氨酸，脯氨酸，穀氨酸，組氨酸，以及必需胺基酸，包括異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，色氨酸和纈氨酸，以及它們的鹽。上述胺基酸或它們的鹽可被單獨添加或組合兩種或多種進行添加。
作為本發明另一種穩定劑的特別優選胺基酸有L-穀氨酸，L-穀氨醯胺，L-甘氨酸以及它們的鹽。這些胺基酸和它們的鹽可被單獨添加或組合兩種或多種進行添加。
加入本發明穩定的EPO溶液製劑中的胺基酸的用量範圍為約1到20mg/ml，優選約2到10mg/ml。
用於本發明溶液製劑中的優選非離子表面活性劑是聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80及其混合物。
用於本發明穩定EPO溶液製劑中的張度劑可選自氯化鈉，甘露醇，山梨醇及其混合物。
本發明的穩定EPO溶液製劑通常被調整為pH值約5.0到8.0。優選的pH範圍為約6.0到7.0。可採用選自氯化鈉，甘露醇，山梨醇以及其它相應物質的張度劑的緩衝劑水溶液獲得適當的pH條件。
本發明穩定的EPO溶液製劑可通常裝在密封的和滅菌的塑料或玻璃容器中。本發明的溶液製劑可以安瓿，小瓶或一次性注射器中的規定劑量供應，或者以多劑量形式例如注射袋或瓶供應。
在本發明中，如下面的實施例中詳細描述的，EPO溶液製劑在40℃和25℃下預定的時間段內受到嚴格的加速穩定性測試。此後，測定每一EPO溶液製劑中EPO的殘留率，用於選擇和確定穩定劑。
更詳細地，製備出含有HES主穩定劑的EPO溶液製劑，並將其在40℃和25℃下儲存預定的一段時間。採用反相高性能液相色譜法(RP-HPLC)測定每種製劑中的EPO殘留率。結果是，含有HES，L-穀氨醯胺，L-穀氨酸和L-甘氨酸的溶液製劑中EPO的殘留率高於其它溶液製劑，從而確保了EPO的長期穩定性。
根據本發明的穩定劑HES能替代清蛋白，具有較輕微的毒性，可易於以低價獲得，並且無輸液傳播疾病的危險，因此便於使用。就此，本發明人發現，採用本領域中可注射和通常用作血漿增量劑的HES，懸浮劑以及抗冷凍劑，製備出具有長期穩定性的EPO溶液製劑。
通過下面的實施例可以更好地理解本發明，給出這些實施例僅僅是為了進行說明，不應將它們解釋成對本發明的限制。
實施例1各種濃度的HFS對FPO穩定性的作用為製備含有0-3％(0-30g/L)HES而未加入特定胺基酸的EPO溶液，將0-3％HES溶於0.9L注射用水中，並在70±5℃下攪拌20分鐘以上，然後冷卻到35℃。向各個冷卻的溶液中加入氯化鈉和聚山梨醇酯，使它們溶於溶液中。向各個溶液中加入額外的注射用水直至最終體積為1L。攪拌後，分別將各溶液調節至pH 6.9。然後，使各溶液過濾通過0.22-mm膜，並補充預定量的EPO。將得到的溶液填充到I型玻璃瓶中，從而製得了穩定的樣品。EPO的用量範圍為2,000到10,000IU。
將製備的穩定樣品儲存在40℃下達一星期，採用RP-HPLC測定EPO的殘留率。
發現合適濃度的HES對EPO有穩定化作用，因而確保了EPO的長期儲存穩定性。結果示於下面的表1中。
表1含有不同濃度HES的EPO溶液製劑的穩定性測試結果
如表1和圖1所示，在不含特定胺基酸但HES的濃度為1％到3％之間的穩定樣品中EPO的殘留率較高。在含1％HES的樣品中觀察到最高的EPO殘留率。
實施例2含HES和胺基酸的溶液的等滲壓性對EPO穩定性的作用根據本發明，利用純水來製備可注射的EPO溶液製劑。為了使這些溶液製劑為等滲壓的，0.5到10g/L氯化鈉，甘露醇，山梨醇或其他相應物質被加到每種溶液中。與實施例1中的相同，這些溶液製劑被調整成pH值為6.9。為了評價製劑的等滲壓性對EPO穩定性的作用，下面將根據與實施例1相同的方法，利用預定量的HES和各種量的氯化鈉來製備EPO溶液，如表2所示。利用冰點滲壓計(Gonotec GmbH)來測量每種所制樣品的重量克分子滲透濃度。這些樣品在40℃下儲存兩個星期，然後採用RP-HPLC測定EPO的殘留率。結果示於下面的表2中。
表2含有不同濃度NaCl的EPO溶液製劑的穩定性測試結果
如表2所示，當利用測試實施例2和3的NaCl濃度製備EPO溶液時，發現經測量具有298和347mOsm重量克分子滲透濃度的EPO溶液分別具有相對較高的儲存穩定性94％和96％。
實施例3含有HES和穀氨醯胺的溶液中EPO的穩定性評價為了研究含有作為穩定劑的HES和穀氨酸的溶液中EPO的穩定性，採用1％HES和8mg/mL穀氨醯胺，按照與實施例1相同的方法製備EPO溶液。將EPO溶液儲存在40℃/RH75％的恆溫箱中達2星期，在25℃/RH60％的另一恆溫箱中儲存6個月。然後，採用RP-HPLC法(Waters Company)測定EPO溶液中EPO的殘留率。結果示於下表3中。
表3含有HES和穀氨醯胺的EPO溶液製劑的穩定性測試結果
結果是，當含有HES和穀氨醯胺的組合物在40℃和25℃的嚴格條件下儲存時，與EPO的初始含量相比，EPO的殘留率分別為95％和91％。
實施例4含有HES和穀氨酸的溶液中EPO穩定性的評價為了研究含有作為穩定劑的HES和穀氨酸的溶液中EPO的穩定性，採用1％HES和8mg/mL穀氨酸，按照與實施例1相同的方法製備EPO溶液。將EPO溶液儲存在40℃/RH75％的恆溫箱中達2星期，在25℃/RH60％的另一恆溫箱中儲存6個月。然後，採用RP-HPLC法(Waters Company)測定EPO溶液中EPO的殘留率。結果示於下表4中。
表4含有HES和穀氨酸的EPO溶液製劑的穩定性測試結果
結果是，當含有HES和穀氨酸的組合物在40℃和25℃的嚴格條件下儲存時，與EPO的初始含量相比，EPO的殘留率分別為94％和96％。
實施例5含有HES，穀氨醯胺和甘氨酸的溶液中EPO穩定性的評價為研究含有作為穩定劑的HES，穀氨醯胺和甘氨酸的溶液中EPO的穩定性，採用1％HES，8mg/mL穀氨醯胺和2mg/mL甘氨酸，按照與實施例1相同的方法製備EPO溶液。將EPO溶液儲存在40℃/RH75％的恆溫箱中達2星期，在25℃/RH60％的另一恆溫箱中儲存6個月。然後，採用RP-HPLC法(Waters Company)測定EPO溶液中EPO的殘留率。結果示於下表5中。
表5含有HES，穀氨醯胺和甘氨酸的EPO溶液製劑的穩定性測試結果
結果是，當含有HES，穀氨醯胺和甘氨酸的組合物在40℃和25℃的嚴格條件下儲存時，與EPO的初始含量相比，EPO的殘留率分別為96％和95％。
前述實施例的目的僅在於闡釋本發明，而不應理解為對本發明的限制。
工業應用性如上所述，由於本發明的EPO溶液製劑不含異質蛋白例如人血清清蛋白或明膠，因此其具有優異的長期儲存穩定性，而無病毒汙染的危險。
權利要求
1.一種紅細胞生成素(EPO)溶液製劑，其包括治療有效量的EPO；以及不含清蛋白的穩定劑，其選自羥乙基澱粉(HES)和HES與胺基酸的混合物。
2.根據權利要求1所述的EPO溶液製劑，其中所述HES的濃度為0.1％到10％。
3.根據權利要求1所述的EPO溶液製劑，其中所述胺基酸選自穀氨酸，穀氨醯胺，甘氨酸或它們的鹽，及其混合物。
4.根據權利要求1所述的EPO溶液製劑，進一步包括非離子表面活性劑和張度劑。
5.根據權利要求4所述的EPO溶液製劑，其中所述非離子表面活性劑選自聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯脂肪酸酯，聚氧乙烯烷基酚醚，失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯，以及聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。
6.根據權利要求4所述的EPO溶液製劑，其中所述張度劑選自氯化鈉，甘露醇，山梨醇及其混合物。
全文摘要
本發明公開了紅細胞生成素(EPO)的一種穩定藥物溶液製劑，其包括一種不含血液衍生蛋白的穩定劑，從而使EPO活性維持一段延長的時間，而無病毒汙染的危險。該穩定溶液製劑進一步包括非離子表面活性劑和張度劑，從而防止儲存期間EPO損失並且便於對身體給藥。
文檔編號A61K38/18GK1832754SQ200480022551
公開日2006年9月13日 申請日期2004年7月27日 優先權日2003年8月6日
發明者曹貞媛, 鄭順觀, 具正, 千準熙, 安泰軍, 全銀卿, 高在敬, 金太瑩, 白永玉, 徐惠蘭 申請人:希傑公司