含基因的組合物的製作方法
2023-05-30 02:36:11 1
專利名稱：含基因的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及含基因的組合物。更具體地說，本發明涉及用於把一基因導入妊娠母體所帶的胎兒以表達該基因的含基因的組合物。本發明還涉及一種用於把一基因導入包括實驗動物、家畜、經濟動物在內的動物的胎兒的方法。
近年來，已開發出幾種直接把外源基因導入動物或人體內的方法，希望將這些方法應用於治療基因組異常所引起的疾病用的基因治療。
象先天性基因缺陷這樣的由先天性基因異常引起的疾病最好在產前階段治療。就把基因導入產前受治療者而言，在動物試驗中對受精卵進行微量注射是目前唯一的有效方法[Palmitter，R.D.Brinster，R.L.Annu.Rev.Genet.，20，465-499(1986)]。
儘管用於受精卵的微量注射法為把基因導入胚胎發育早期開闢了道路，但尚未開發出把外源基因導入胎兒的手段。此外，微量注射法不能用於人體妊娠情況下胎兒的基因治療。
因此，本發明的一個目的是提供一種用於把外源基因導入發育期胎兒的方法；本發明的另一目的是提供一種用於該方法中的含基因的組合物。
本發明人對用於把目的基因通過胎兒母體導入胎兒的方法進行了各種研究，結果發現，當把基因和特定運輸因子一起導入母體時，它們能穿過作為胎兒和母體間血液屏障的胎盤基底膜；還發現，基因可以導入胎兒細胞以進行原位表達。這些發現導致本發明的完成。
因此，本發明提供一種包括一種基因和一種運輸因子的含基因的組合物，所述運輸因子能夠把該基因從妊娠母體運輸到胎兒細胞。
本發明還提供了一種通過將上述含基因的組合物導入妊娠母體而把基因導入胎兒細胞的方法。
附圖簡述
圖1表示用本發明的組合物給藥後胎兒和母體肝臟的基因組DNA的Southern印跡分析結果。
圖2表示只用外源基因給藥後胎兒和母體肝臟的基因組DNA的Southern印跡分析結果。
圖3表示交媾後第3、6、9、12和15天用本發明組合物給藥時的胎兒基因組DNA的Southern印跡分析結果。
圖4表示交媾後第9天用本發明組合物給母體給藥時從小鼠胎兒、新生小鼠、一月齡幼鼠收集的基因組DNA的Southern印跡分析結果。
圖5表示從圖4中所示一月齡幼鼠的器官收集到的基因組DNA的狹線印跡分析結果。
圖6表示交媾後第9天用本發明組合物給母體給藥時從小鼠胎兒和新生小鼠收集到的RNA的Northern印跡分析結果。
圖7表示收集自已導入了SV40-CAT基因的小鼠和新生小鼠的蛋白質的CAT活性。
圖8表示用X-gal染色獲得的組織化學切片圖，以及β-肌動蛋白-lacZ的表達。所述β-肌動蛋白-lacZ已通過在交媾後第8.5天用本發明的組合物給母體給藥而導入胎兒中。
圖9表示小鼠胎兒(已導入的β-肌動蛋白-lacZ在其中得到表達)的組織切片。
圖10表示已導入SR-α-HST-1基因的2周齡小鼠及其母鼠的血小板數目(其中，血採自心臟)。
圖11表示已導入SR-α-HST-1基因的3周齡小鼠及其母鼠的血小板數目(其中，血採自眶靜脈)。
圖12表示已導入SR-α-HST-1基因的3周齡小鼠及其母鼠血清中的HST-1蛋白濃度。
本發明中「運輸因子」這一術語用來指幫助基因運輸至靶細胞的物質。本發明中所用的運輸因子能把基因從母體導入其胎兒細胞。更具體地說，當把該運輸因子導入帶有胎兒的妊娠母體時，它能將基因導入胎兒細胞。運輸因子的例子有陽離子脂多胺。其中，雙C10-C20烷基醯胺甘氨醯基精胺是優選的，而雙十八烷基醯胺甘氨醯基精胺是特別優選的。
對本發明中所用的基因沒有特別限制，只要該基因能用於最好在胎兒期治療或預防的疾病即可，或者能用於為飼養象實驗動物、家畜和寵物這樣的經濟動物而進行的基因導入即可。
例如，當已經證實胎兒缺少某一基因時或當很清楚胎兒因其家族史而缺少某一基因時，這類基因就可用於本發明。此外，也可使用用於治療胎兒患有的先天性疾病的基因。
下表顯示了先天性遺傳病和缺陷基因產物之間的關係。
表1先天性遺傳病缺陷基因產物家族性高膽固醇血症 低密度脂蛋白受體脂質中的代謝錯誤載脂蛋白苯丙酮尿症 苯丙氨酸羥化酶血友病甲因子VIII血友病乙凝固因子IX鳥氨酸轉氨甲醯酶缺乏鳥氨酸轉氨甲醯酶基因高酪氨酸血症富馬醯乙醯乙酸羥化酶囊性肺纖維化通過囊性肺纖維化的跨膜傳導調節因子假肥大性肌營養不良 小肌營養不良蛋白基因產物Li-Fraumeni綜合症 p53蛋白成視網膜細胞瘤 RB蛋白Lesch-Nyhan綜合症 次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶腺苷脫氨酶缺陷 腺苷脫氨酶Nieman-Pick病 鞘磷脂磷酸二酯酶ITay-Sacks病 氨基己糖苷酶Aα1-抗胰蛋白酶缺陷 α1-抗胰蛋白酶抗凝血酶III缺陷 抗凝血酶III氨甲醯磷酸合成酶缺陷氨甲醯磷酸合成酶生長激素缺陷(IA型)生長激素甲狀腺球蛋白缺陷 甲狀腺球蛋白21-羥化酶缺陷 21-羥化酶(先天性腎上腺增生)丙酮酸脫氫酶缺陷 丙酮酸脫氫酶另外，通過把本發明的組合物和方法用於患自發遺傳病的動物或敲除的動物(用人工方法使其具有基因功能障礙的動物)，它們就可用於基因導入模型。而且，在病毒性肝炎或嬰兒惡性腫瘤的治療中，一些反義寡核苷酸在病毒性肝炎(甲、乙或C肝)存在下抑制病毒性基因產物，其它一些反義寡核苷酸抑制癌基因(癌基因導致象維爾姆斯瘤和成神經細胞瘤這樣的嬰兒惡性腫瘤)和造成其它疾病的基因的表達。
被導入動物體內的基因的例子有(1)用於在動物體內產生藥物的基因，(2)用於改善動物肉、物理成分、毛、乳質量的基因，(3)通過將基因從胎生動物中剔除或將基因導入胎生動物而對基因功能進行研究的基因材料，(4)用於恢復基因在基因缺陷(造成子宮中死胎)動物中的表達的基因材料。
胎兒包括除人之外的哺乳動物如狗、牛、馬、山羊、綿羊、猴、貓、豬、小鼠和大鼠的胎兒，也包括人的胎兒。
對所採用的基因形式沒有特別限制。然而，就導入和表達的容易程度而言，為表達基因而構建的質粒是特別優選的。一個強有力的啟動子和/或增強子和一個基因的組合更為優選，因為促進了表達。如果使用高度器官特異性的啟動子，所謂的器官擊靶(organtargeting)也是可能的，其中基因在特定器官中表達。
在本發明的含基因的組合物中，基因和運輸因子可以混合物的形式存在。也可以這樣的形式存在，即把混溶狀態的運輸因子與基因相混合。此外，也可以把已形成脂質體的運輸因子與基因相混合。如果運輸因子已形成一種脂質體，那麼基因最好存在於脂質體內部、其膜中或膜的表面中。用來形成脂質體的方法例如有渦動處理、超聲處理、反相蒸發、冷凍乾燥、增溼、採用多元醇的方法、機械化學法、脂溶法以及噴霧乾燥法。製備脂質體時，下列成分可以作為成膜成分添加磷脂如雙十四醯基磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、磷脂酸等，膽固醇，α-生育酚，磷酸三十二烷基酯以及十八烷胺。
基因和運輸因子的比例根據它們的性質而有所變化。通常優選的是，每μg DNA中摻入1-100nmol、特別是5-10nmol的運輸因子。
本發明的組合物優選通過注射方法給妊娠母體給藥，特別優選的是動脈注射或靜脈注射。此外，本組合物可以通過導管給藥到母體的血管中。如果在妊娠期的話，對給藥時間就沒有特別的限制。不過，特別優選的是，在器官發生期間(organogenic period)用本組合物給藥。
本發明的組合物給藥到母體後穿過胎盤基底膜，然後到達臍帶，最後到達胎兒，這樣就將基因導入了胎兒細胞。已經證實，被導入的基因在產出後的新生兒細胞中存在並得以表達。
因此，本發明的組合物在把基因導入胎兒的實驗中、在預防基因缺陷嬰兒的出生中、在胎兒基因缺陷的預防和治療中都很有用。該組合物也可用於飼養經濟動物和寵物。
實施例下面將通過實施例更具體地描述本發明。這些實施例不能被理解成對本發明的限定。實施例1(1)用於導入的質粒採用SV40-氯黴素乙醯轉移酶(CAT)質粒[4752bp，Promega的產品]。(2)運輸因子採用雙十八烷基醯氨基甘氨醯基精胺(DOGS)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)p6983](Transfectum，Biosepra Inc.的產品)。(3)本發明組合物的製備向133μgSV40-CAT質粒中加入250μl 0.3M NaCl水溶液以製備質粒溶液。另外，把20μl96％乙醇加入500μgDOGS中並在室溫下保溫5分鐘。向所得溶液中加入180μl純化水以製備DOGS溶液。向含有200μl DOGS溶液和250μl純化水的溶液中加入質粒溶液。將混合物在渦流混合器中機械搖動，以獲得本發明的組合物。(4)基因的導入i)在交媾後(P.C.)第9.5天，把按上述方法製備的組合物注射到每隻妊娠雌性小鼠(體重約30g，Charles River Co.)的尾靜脈中。七天後(交媾後第16.5天)取出母體肝臟。同樣，用剖腹產術分離出胎兒。從肝臟和胎兒收集基因組DNA，對其進行Southern印跡分析檢查CAT基因的存在。按Pro.Natl.Acd.Sci.USA83，4993-4997(1986)所述方法收集基因組DNA。通過在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳來分離被限制酶SalI完全消化的DNA和未被消化的DNA，然後將DNA印跡到Hybond-N+nylon膜(Amersham的產品)上。採用由32P標記過的SV40-CAT片斷(1908bp，Hind III片斷)作探針，將印跡雜交。在放射自顯影圖上檢測特定區帶。
結果證實，如圖1所示，外源基因即SV40-CAT質粒被導入胎兒細胞。
圖1中，線1和2是對照SV40-CAT質粒(33pg)的基因組DNA，線3和4得自未處理過的母體肝臟，線5和6來自未處理過的胎兒，線7和8來自用本發明組合物給藥過的母體肝臟，而線9和10來自處理過的胎兒。ii)結果示於圖2，該結果是在這樣的實驗中獲得的，即未與運輸因子混合的純SV40-CAT質粒以類似於i)中所述的方式給妊娠小鼠藥給。從圖2可清楚地看出，在沒有運輸因子的情況下SV40-CAT質粒不能有效地導入胎兒細胞中。圖2中，線1和2是來自對照SV40-CAT質粒(33Pg)的基因組DNA，線3和4來自只用質粒給藥的母體肝臟，而線5和6來自其胎兒。iii)圖3表示在類似於上述i)的實驗中獲得的結果，該實驗中在不同的時刻用本發明組合物給藥。從圖3可清楚地看出，當在交媾後第3～6天期間給藥時，幾乎沒有基因被導入；交媾後大約9天後給藥基因開始能被導入；交媾後大約第9天導入基因的效率最高。圖3中，線1和2是來自對照SV40-CAT質粒(33pg)的基因組DNA，線3和4來自在交媾後第3天導入了基因的胎兒，線5和6來自在交媾後第6天導入了基因的胎兒，線7和8來自在交媾後第9天導入了基因的胎兒，線9和10來自在交媾後第12天導入了基因的胎兒，而線11和12來自在交媾後第15天導入了基因的胎兒。實施例2以類似於實施例1中所述的方式，在交媾後第9天用實施例1(3)中獲得的本發明組合物給小鼠給藥。從交媾後第16.5天的胎兒、新生小鼠、1月齡小鼠收集基因組DNA。進行Southern印跡分析。
結果證實，如圖4所示，所有情況下都存在導入的基因。圖4中，線1和2是來自對照SV40-CAT質粒(33pg)的基因組DNA，線3和4來自交媾後第16.5天的胎兒，線5和6來自新生小鼠，線7和8來自1月齡小鼠。然後，從1月齡小鼠的各種器官提取基因組DNA並進行狹線印跡分析。發現基因已被導入各器官。圖5中，線1是來自大腦的基因組DNA，線2來自甲狀腺，線3來自胸腺，線4來自心臟，線5來自肺，線6來自肝臟，線7來自脾，線8來自胰，線9來自腎，線10來自小腸，線11來自子宮，而線12來自肌肉。實施例3通過Northern印跡分析證實了如實施例1-i)所述導入的基因SV40-CAT的表達。
簡言之，從胎兒或新生小鼠的全身提取RNA，所述胎兒或新生小鼠已按類似於實施例1-i)的方式、採用同工基因(isogen)(Nippongene)導入了基因。通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離RNA(20μg)，然後印跡到硝化纖維素膜(Nitroplus Cellulosemembrane，Micron Separations Inc.的產品)上。以類似於實施例1所述的方式，採用由32P標記的SV40-CAT片斷作探針進行雜交。結果在所有的胎兒及新生小鼠中都發現，導入的基因轉錄到RNA上。圖6中，線1代表未處理的胎兒，線2代表已導入了基因的胎兒，而線3代表已導入了基因的新生小鼠。
接著，從如實施例1-i)中所述導入了基因的胎兒和新生小鼠的全身提取蛋白質樣品，然後分析外源基因的表達，即分析CAT的酶活性。簡言之，使每一樣品中的蛋白量彼此相等，並使樣品在60℃下熱處理5分鐘以使CAT固有抑制因子失活。用已知方法分析CAT活性(Zhu，N.，Liggitt，D.，Liu，Y.Debs，R.，Science 261，209-211(1993)；以及Gorman，C.M.，Moffat，L.F.Howard，B.H.，Mol.Cell.Biol.2，1044-1051(1982))。通過把200nmol乙醯輔酶A加入用0.1μCi14C(55mCi/mmol)標記的終體積為150μl的氯黴素中來測定酶活性。
結果證實，導入的基因在所有胎兒和新生小鼠中都得到表達，這表明CAT蛋白已經產生。圖7中，線1表示未處理的胎兒，線2表示已導入了外源基因的胎兒，線3表示已導入了外源基因的新生小鼠，而線4表示0.2μU CAT的對照CAT。實施例4把含有小雞β-肌動蛋白啟動子的lac Z質粒(Sakura，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86，5758-5762(1989))用作待導入的質粒。用133μg lac Z質粒和400nmol DOGS，按類似於實施例1(3)中所述的方式製備本發明的組合物。
把這樣獲得的組合物注射到交媾後第8.5天的每隻妊娠雌性小鼠的尾靜脈中以導入基因。在交媾後第10.5天分離胎兒。採用Cheng′s方法通過用X-gal染色來檢測β-肌動蛋白-lac Z活性(Cheng，T.C.，Wallace，M.C.，Merlie，J.P.Olsow，E.N.，Science 201，215-218(1993))。把染色胎兒浸於含20％蔗糖和0.2％葡萄糖的4℃磷酸緩衝鹽水中之後，製備冷凍切片。把連續切片切成30μm厚，為用核堅牢紅進行復染選擇合適的切片。獲得了染色的切片。
圖8表示出導入了基因的小鼠的全身染色結果。切片染色的結果示於圖9。如圖所示，在胎兒的各種器官中β-肌動蛋白-lac Z活性都得到表達。圖8中，a-e表示已導入基因的胎兒，f表示未處理過的對照胎兒。圖9中，g表示沿縱向切開的胎兒的全身切片，h表示通過心臟切開的胎兒的全身前部切片，i表示右眼泡切片(放大圖)，j表示胰芽切片(放大圖)，k表示左前肢芽切片(放大圖)，FB指前腦，H指心臟，MT指中腎小管，Nc指脊索，IRS指視網膜內的空間，PB指胰芽，D指背面，V指腹面。實施例5把HST-1基因用作待導入的基因。使用時，構建含HST-1cDNA和SR-α啟動子的重組表達載體，將其導入妊娠母體。研究後代小鼠中HST-1基因是否得以表達。因為已經知道HST-1基因產物能增加血小板數量，所以通過血小板計數來檢測表達與否。(1)待導入的基因採用含有與SR-α啟動子連接的HST-1基因的表達質粒。(2)製備本發明的組合物重複實施例1(3)的步驟，所不同的是採用133μg SR-α-HST-1基因。(3)基因的導入把如上述製備的組合物注射到交媾後第10.5天的每隻妊娠雌性小鼠的尾靜脈中以導入該基因。在後代小鼠出生後第2周和第3周測定其血小板數目。同時也測定其母體的血小板數目。結果示於圖10和11。圖10表示從心臟採集的血的結果，而圖11表示從眶靜脈採集的血的結果。
從這些結果可以清楚地看出，導入了HST-1基因的幼鼠的血小板數目高於對照小鼠血小板數目。這表明，HST-1基因被導入幼鼠體內，並且該基因在小鼠中得到表達。
用ELISA測定3周齡小鼠血清中的HST-1蛋白。簡言之，用採自每隻3周齡小鼠的50μl血清和已知方法進行ELISA以測定HST-1蛋白量(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，pp12368-12372，December1994)。結果示於圖12。圖12中的數據表明，在由導入了HST-1基因的母體生產的幼鼠的血液中檢測到HST-1蛋白。
用本發明的組合物給妊娠母體給藥時，可以防止有基因缺陷的後代的出生，而且可以在妊娠期間治療基因缺陷。在動物實驗中，在胚胎發生期把未知基因導入動物中，可以研究該基因在個體發育中的作用。此外，該組合物可用於產生生理活性物質(如動物體內的藥物)或提高這類物質的產量。因此，可通過改善物理成分、改善肉、乳和毛的質量而用於飼養動物。
權利要求
1.一種包括基因和運輸因子的含基因的組合物，所述運輸因子能把該基因從母體運輸到胎兒細胞。
2.根據權利要求1的組合物，通過用該組合物給母體給藥而將該基因導入胎兒。
3.根據權利要求1或2的組合物，其中運輸因子是雙C10-C20烷基醯胺甘氨醯基精胺。
4.根據權利要求1或2的組合物，其中運輸因子是雙十八烷基醯胺甘氨醯基精胺。
5.根據權利要求1-4中任一項的組合物，它被用於防止有基因缺陷的嬰兒的出生、防止和治療胎兒的基因缺陷、飼養動物。
6.一種用於通過給妊娠母體給藥而將基因導入胎兒細胞的含基因的組合物，該組合物是通過把含基因的溶液和含雙十八烷基醯胺甘氨醯基精胺的溶液混合併用機械搖動法搖動而獲得的。
7.一種把基因導入胎兒細胞的方法，該方法包括用權利要求1-6中任一項定義的含基因的組合物給妊娠母體給藥。
全文摘要
一種包括基因和運輸因子的含基因的組合物，所述運輸因子能把該基因從母體運輸到胎兒細胞。用本發明的組合物給妊娠母體給藥時，可以防止有基因缺陷的後代的出生，而且可以在妊娠期間治療基因缺陷。在動物實驗中，在胚胎發生期把未知基因導入動物中，可以研究該基因在個體發育中的作用。此外，該組合物可用於飼養象寵物、經濟動物和家畜這樣的動物。
文檔編號A61K48/00GK1166788SQ9519565
公開日1997年12月3日 申請日期1995年8月31日 優先權日1994年10月14日
發明者本真, 落谷孝廣, 吉田尚, 杉村隆, 寺田雅昭 申請人:第一製藥株式會社