一種人皮膚成纖維細胞培養液及培養方法與流程
2023-05-30 02:44:06
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種人皮膚成纖維細胞培養液及培養方法。
背景技術：
隨著人皮膚成纖維細胞分離、培養技術的成熟以及生物醫學工程等技術的發展，以培養人皮膚成纖維細胞為基礎的生物人工皮膚逐漸發展起來，人們一直希望採用這種體外皮膚支持的方法來代替患者損傷的皮膚功能，為患者等待皮膚移植或自身皮膚再生創造條件。目前認為，生物人工皮膚要達到理想支持效果至少需要1010以上數量級的細胞，而在保障細胞活性的條件下，人皮膚成纖維細胞數量越多，其支持及治療效果將越佳，因此，人皮膚成纖維細胞體外大規模培養技術已成為生物人工皮膚技術發展的核心技術。
雖然人皮膚成纖維細胞體外大規模培養技術己取得了許多重大的進展，目前仍難於滿足生物人工皮膚發展的需要，存在著以下問題：
1、動物培養環境中抑制因素的積累是提高細胞密度的主要限制因素。1)體外動物細胞培養中氨離子的積累是抑制細胞生長的主要因素之一，對細胞有很大的毒害作用。2)高乳酸濃度抑制細胞生長。
2、氧氣供應相對不足。氧氣是動物細胞生長的必要物質，且人皮膚成纖維細胞更是一種高耗氧量細胞，在人皮膚成纖維細胞大規模培養過程中，消耗大量氧氣，可導致溶氧急劇降低。這種氧的缺乏也不僅可直接造成細胞的損害，影響細胞的生長速度，還促進培養基中葡萄糖的無氧酵解，增加乳酸的產生，使得培養基中的PH值急劇下降，又對人皮膚成纖維細胞造成進一步的損害。
3、機械損傷。人皮膚成纖維細胞是錨定依賴性細胞，其功能的有效發揮必須依賴於對支架材料等支持物的貼附，而在眾多的體外人皮膚成纖維細胞規模培養方法中，微載體懸浮培養技術較其它培養技術具有以下優點：1)表面積/體積比大，單位體積細胞培養基細胞產率高；2)兼有懸浮培養和貼壁培養的優點；3)培養基利用率高；4)放大容易，可以達到幾升以上的容積，細胞收穫過程不複雜；5)可用簡單的顯微鏡即可觀察細胞在微載體表面的生長情況；因而被廣泛應用人皮膚成纖維細胞體外規模化高密度三維培養術中。但是，在細胞培養過程中許多作用力(如端流和氣泡產生的剪切力、微載體間的碰撞)的作用下，貼在微載體上生長的細胞會受到損傷，抑制細胞生長，並導致細胞死亡。
綜上所述，大規模細胞培養過程中，維持細胞高的活力是個富有挑戰性的課題。最初的研究似乎表明細胞死亡大多由於壞死，而人們逐漸認識到至少是一些細胞系在生物反應器中細胞死亡主要原因是由於氧氣、營養物質的缺乏和氨、乳酸等代謝產物蓄積所引起細胞凋亡所致。隨著細胞凋亡分子機制研究的不斷深入，細胞凋亡的發生被認為是大規模細胞培養過程的重要制約環節，預防並控制細胞凋亡也因此成為研究熱點。
因此，需要研發一種人皮膚成纖維細胞培養液，其可在同等條件下有效減輕規模化培養中各種培養環境因素對人皮膚成纖維細胞造成的損傷，並抑制人皮膚成纖維細胞凋亡的發生，達到進一步提高人皮膚成纖維細胞規模化培養的密度和功能狀態的效果。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明提供了一種人皮膚成纖維細胞培養液，所述對人皮膚成纖維細胞的規模化培養具有良好的效果。
為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
本發明公開了一種人皮膚成纖維細胞培養液，包括：培養基、保護劑、胎牛血清和HEPES；
所述保護劑包括：刺玫果總黃酮提取物、黃芪多糖和胰島素。
優選的，所述培養液包括以下組分：
在本發明提供的一實施例中，所述培養液包括以下組分：
在本發明提供的另一實施例中，所述培養液包括以下組分：
在本發明提供的另一實施例中，所述培養液包括以下組分：
優選地，所述刺玫果總黃酮提取物的製備方法包括以下步驟：
a)將刺玫果乾燥粉碎，用12～16體積倍量的70～80％乙醇微波提取3次，每次提取的時間為40min、20min和10min，過濾後合併提取液；
b)將步驟a得到的提取液上大孔吸附樹脂柱，經水洗至無色後，用70～90％乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇得浸膏，乾燥至恆重。
優選地，所述培養基為DMEM。
山刺玫(Rosa davurica Pall.)為薔薇科薔薇屬落葉灌木植物,主要分布於我國東北地區,其果實為刺玫果。傳統醫學將刺玫果列為補藥,據《中華大辭典》稱:刺玫果具有健脾理氣、養血調經之功效。現代醫學研究發現,刺玫果具有抗衰老、抗疲勞、耐缺氧,增強人體免疫功能作用,長期服用能顯著提高人體中SOD含量。
刺玫果為藥食同源的寶貴資源，其富含有機酸,黃酮、香豆素、昌醇、三菇、烯烴、皂試、揮髮油、多種礦物質、微量元素等多種活性成分,其中的黃酮類化合物具有抗氧化、降低脂質過氧化反應、抗衰老和抗自由基等作用。
組分中的黃芪多糖等可有效保護細胞膜和線粒體膜的完整性，從而減少各種培養環境因素對人皮膚成纖維細胞的損傷，能有效保護人皮膚成纖維細胞膜的完整性。
氧自由基不僅通過對生物膜中不飽和脂肪酸進行過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產物引起細胞損傷，自由基(或氧化應激)在細胞凋亡過程起重要的誘導作用。本發明組分中的刺玫果總黃酮提取物是一種天然的水溶性抗氧化劑，它能通過淬滅生物膜內的自由基活性保護人皮膚成纖維細胞膜，使人皮膚成纖維細胞免受氧化損害。此外，刺玫果總黃酮提取物中富含多種水溶性物質，亦能夠清除02-，減少H202的產生，還可能阻斷羥自由基的產生，可非常有效地減輕活性氧分子對細胞膜及細胞器膜的損傷。
Ca2+是細胞凋亡發生過程中重要的信息分子，Ca2+持續升高可使核酸內切酶激活，使DNA片段化，因此鈣離子的內穩定失調強與人皮膚成纖維細胞損傷的發生具有非常重要的關係，並被認為是轉化至不可逆期的界限步驟。本發明中的刺玫果總黃酮提取物具有良好的鈣阻滯作用。
黃芪多糖不僅可在缺氧條件下經無氧酵解，產生ATP，且不產生有害的代謝產物，還作為一種能量合成促進劑，在缺血、缺氧等應激狀態下，激活磷酸果糖激酶和丙酣酸激酶，促進對糖的利用，更快、更多地為人皮膚成纖維細胞提供了能量，使鈣泵在缺氧狀態下仍能維持一定的生理活性，保持了鈣離子內低外高的穩態，從能有效的保護人皮膚成纖維細胞膜的完整性和細胞的功能而減輕人皮膚成纖維細胞損害，抑制了人皮膚成纖維細胞的凋亡。
胰島素可通過作用於人皮膚成纖維細胞表面的胰島素受體，增強人皮膚成纖維細胞對葡萄糖的攝入和利用，促進人皮膚成纖維細胞蛋白內蛋白合成，從而進一步增強人皮膚成纖維細胞的功能與活力。
本發明提供了一種人皮膚成纖維細胞培養方法，包括：採用本發明提供的人皮膚成纖維細胞培養液培養人皮膚成纖維細胞。
作為優選，人皮膚成纖維細胞培養方法採用微載體培養方法。
綜上所述，本發明公開的人皮膚成纖維細胞培養液能通多種機制在人皮膚成纖維細胞規模化培養過程有效地減輕各種因素對人皮膚成纖維細胞的損傷，並抑制人皮膚成纖維細胞凋亡的發生，從而達到進一步提高人皮膚成纖維細胞規模化培養的密度和功能狀態，並有效延長人皮膚成纖維細胞的體外生存時間的目的。
附圖說明
圖1示實施例1細胞的生長曲線；
圖2示實施例1負載細胞的微載體在倒置顯微鏡下觀察及DAPI染色後螢光倒置顯微鏡下觀察結果；其中2-1示實驗組倒置顯微鏡觀察結果，2-2示實驗組DAPI染色結果，2-3示對照組1倒置顯微鏡觀察結果；2-4示對照組1DAPI染色結果；2-5示對照組2倒置顯微鏡觀察結果；2-6示對照組2DAPI染色結果；2-7示對照組3倒置顯微鏡觀察結果；2-8示對照組3DAPI染色結果；2-9示對照組4倒置顯微鏡觀察結果；2-10示對照組4DAPI染色結果；
圖3示實施例2負載細胞的微載體在倒置顯微鏡下觀察及DAPI染色後螢光倒置顯微鏡下觀察結果；其中3-1示實驗組倒置顯微鏡觀察結果，3-2示實驗組DAPI染色結果，3-3示對照組1倒置顯微鏡觀察結果；3-4示對照組1DAPI染色結果；3-5示對照組2倒置顯微鏡觀察結果；3-6示對照組2DAPI染色結果；3-7示對照組3倒置顯微鏡觀察結果；3-8示對照組3DAPI染色結果；3-9示對照組4倒置顯微鏡觀察結果；3-10示對照組4DAPI染色結果；
圖4示實施例3負載細胞的微載體在倒置顯微鏡下觀察及DAPI染色後螢光倒置顯微鏡下觀察結果；其中4-1示實驗組倒置顯微鏡觀察結果，4-2示實驗組DAPI染色結果，4-3示對照組1倒置顯微鏡觀察結果；4-4示對照組1DAPI染色結果；4-5示對照組2倒置顯微鏡觀察結果；4-6示對照組2DAPI染色結果；4-7示對照組3倒置顯微鏡觀察結果；4-8示對照組3DAPI染色結果；4-9示對照組4倒置顯微鏡觀察結果；4-10示對照組4DAPI染色結果。
具體實施方式
本發明提供了一種人皮膚成纖維細胞培養液及培養方法，所述人皮膚成纖維細胞培養液對人皮膚成纖維細胞的規模化培養具有良好的效果。
下面將結合本發明具體實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領域技術人員應當理解，對本發明的具體實施例進行修改或者對部分技術特徵進行同等替換，而不脫離本發明技術方案的精神，均應涵蓋在本發明保護的範圍中。
實施例中使用的試劑和組分均為市售或自製來源。
如：
胰島素來源於市售(Sigma)
DMEM培養基來源於市售(Gbico)
胎牛血清來源於市售(Gbico)
黃芪多糖來源於國產市售
刺玫果總黃酮提取物來源於自製
人皮膚成纖維細胞來源於本實驗室保存
微載體cytodex3源於市售
HEPES來源於國產市售
DAPI染料來源於市售(Sigma)
實施例1：利用本發明公開的培養液規模化培養人皮膚成纖維細胞
1、配製培養液
試驗組：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、60mg刺玫果總黃酮提取物、20mg黃芪多糖和10-7mmol胰島素。
對照組1：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。
對照組2：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、120mg刺玫果總黃酮提取物。
對照組3：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、40mg黃芪多糖。
對照組4：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10-7mmol胰島素。
2、微載體cytodex3預處理：將0.25g微載體cytodex3置於50ml塑料離心管中，用0.lmol/L、pH為7.0無鈣續磷酸續緩衝液(PBS)浸泡過夜後，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經121℃高壓滅菌30分鐘後，吸出PBS，用培養基洗滌2次，最後用以上配製的培養液浸泡10小時以上，備用。
3、濃縮靜止接種法接種細胞：消化收集平板培養的人皮膚成纖維細胞懸液，總量為2×107的細胞懸液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉培養瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含微載體cytodex3的人皮膚成纖維細胞懸液經注射孔緩緩注入微重力旋轉培養瓶中，繼續添加上述培養液至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其稍稍扭松，靜止橫放於二氧化碳孵箱中，培養條件為溫度:37℃，二氧化碳濃度:5％。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫外消毒後的超淨臺中，用75％酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10ml注射器(其中一支裝有培養液，另一支不裝培養基)分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入容器內，容器內氣泡從另一支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿後再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最後將其移入二氧化碳培養箱中，安裝在培養裝置上，並根據所接種微載體和細胞的量調整容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內外壁上為宜。本試驗中設定旋轉初速度為7.6rpm。
4、微載體cytodex3生長細胞的DAPI染色法：取出樣品後用DAPI染色，置於37℃下0.5小時後，在螢光顯微鏡下觀察，長有細胞的多孔微載體為藍色，未長細胞的微載體仍為背景色。
試驗結果：
1、試驗組和對照組在為期7天的培養中細胞生長曲線(參見圖1)，可見實驗組中的細胞密度高於均對照組，且懸浮細胞數較少；
2、在培養的第5天，螢光倒置顯微鏡下及DAPI染色(參見圖2)後，可見實驗組中多個微載體相互聚集在一起，且己完全被細胞所包裹，且微載體上的貼壁細胞數較對照組密集，細胞活力較好，說明本發明的培養液具有較好的人皮膚成纖維細胞保護功能，可促進進一步地規模化培養。
實施例2：利用本發明公開的培養液規模化培養人皮膚成纖維細胞
試驗組：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、50mg刺玫果總黃酮提取物、30mg黃芪多糖和10-8mmol胰島素。
對照組1：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。
對照組2：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、100mg刺玫果總黃酮提取物。
對照組3：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、60mg黃芪多糖。
對照組4：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10-8mmol胰島素。
按照與實施例1相同的方法進行微載體cytodex3預處理、濃縮靜止接種法接種細胞和DAPI染色計數。結果如下：
在培養的第5天，螢光倒置顯微鏡下及DAPI染色(參見圖3)後，可見實驗組中多個微載體相互聚集在一起，且己完全被細胞所包裹，且微載體上的貼壁細胞數較對照組密集，細胞活力較好，說明本發明的培養液具有較好的人皮膚成纖維細胞保護功能，可促進進一步地規模化培養。
實施例3：利用本發明公開的培養液規模化培養人皮膚成纖維細胞
試驗組：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、80mg刺玫果總黃酮提取物、40mg黃芪多糖和10-6mmol胰島素。
對照組1：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。
對照組2：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、160mg刺玫果總黃酮提取物。
對照組3：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、80mg黃芪多糖。
對照組4：在1L DMEM(高糖型)培養基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10-6mmol胰島素。
按照與實施例1相同的方法進行微載體cytodex3預處理、濃縮靜止接種法接種細胞和DAPI染色計數。結果如下：
在培養的第5天，螢光倒置顯微鏡下及DAPI染色(參見圖4)後，可見實驗組中多個微載體相互聚集在一起，且己完全被細胞所包裹，且微載體上的貼壁細胞數較對照組密集，細胞活力較好，說明本發明的培養液具有較好的人皮膚成纖維細胞保護功能，可促進進一步地規模化培養。