基於液相晶片檢測對蝦白斑病病毒的方法
2023-05-29 23:53:16 1
專利名稱：基於液相晶片檢測對蝦白斑病病毒的方法
技術領域：
本發明涉及輔助鑑定對蝦白斑病病毒的引物對、引物探針組合物以及它們的應用，更具體涉及基於液相晶片檢測對蝦白斑病病毒的方法。
背景技術：
對蝦白斑病(White spot disease, WSD)是世界範圍內對海水對蝦養殖危害最為嚴重的對蝦病毒病之一，由白斑綜合症病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)引起。白斑綜合症病毒又稱對蝦白斑病病毒。1993年日本首次報導養殖的日本對蝦暴發WSD。隨後的研究發現，WSD不但可以使各個生長階段的斑節對蝦和日本對蝦致病和死亡，而且還會引起包括蟹和鰲蝦在內的許多淡水和海水甲殼類生病，發病3-10天內死亡率達到100%，造成嚴重的經濟損失。1996年起在中國大面積暴發WSD，使中國對蝦養殖遭受嚴重打擊，對蝦減產70%，至今未能恢復。近年來，在許多野生甲殼類動物中先後檢出WSSV，表明WSSV己經在野生環境中蔓延開來。為此，各國把建立靈敏的檢測方法放在研究的首位，利用這些檢測方法篩選帶病蝦和無病蝦，來對WSD進行預防和控制，繁殖疾病的蔓延，保障養殖對蝦的種質和對蝦養殖業的健康發展。由於目前還沒有對對蝦敏感的連續細胞系，因此分子生物學檢測方法成為檢測和診斷對蝦病毒的主要手段。其中，以原位雜交和PCR應用得最為廣泛。原位雜交具有特異性強、敏感性高的優點，但方法相當繁瑣，不適宜對大量樣品進行檢測。PCR方法比較快速、靈敏，但是需要溴化乙錠染色觀察結 果，溴化乙錠是強致癌物，對人體和環境有危害，交叉汙染問題比較嚴重。
發明內容
本發明的目的是提供輔助鑑定對蝦白斑病病毒的引物對、引物探針組合物以及它們的應用，更具體涉及基於液相晶片檢測對蝦白斑病病毒的方法。本發明提供了輔助鑑定對蝦白斑病病毒的特異引物對，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。本發明還提供了輔助鑑定對蝦白斑病病毒的引物探針組合物，由所述特異引物對和探針Tl組成；所述探針Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述特異引物對或所述引物探針組合物可用於製備輔助鑑定對蝦白斑病病毒的試劑盒。所述特異弓I物對或所述弓I物探針組合物可用於輔助鑑定對蝦白斑病病毒。本發明還保護一種輔助鑑定對蝦白斑病病毒的試劑盒，包括所述特異引物對或所述引物探針組合物。本發明還保護一種輔助鑑定對蝦白斑病病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的基因組DNA為模板，用所述特異引物對進行PCR擴增；如果所述PCR擴增得到了擴增產物，待測病毒為候選的對蝦白斑病病毒；如果所述PCR擴增沒有得到擴增產物，待測病毒為候選的非對蝦白斑病病毒。所述擴增產物的大小可為100-250bp之間，具體可為232bp。所述待測病毒為對蝦白斑病病毒或流行性造血器官壞死病毒。
本發明還保護行另一種輔助鑑定對蝦白斑病病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的基因組DNA為模板，用所述特異引物對進行PCR擴增後與所述探針Tl進行雜交，如果雜交結果為陽性待測病毒為候選的對蝦白斑病病毒，如果雜交結果為陰性待測病毒為候選的非對蝦白斑病病毒。所述待測病毒為對蝦白斑病病毒或流行性造血器官壞死病毒。
所述輔助鑑定對蝦白斑病病毒的方法具體包括如下步驟(液相晶片法):
(I)以待測病毒的基因組DNA為模板，用所述特異引物對進行PCR擴增；
(2)製備微球懸液
①將表面羧基化的螢光編碼微球漩渦振蕩20s，取75 μ L (約含3 X IO6個微球)置於1.5mL離心管中，IOOOOg離心lmin,棄上清；
②在步驟①的離心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(ρΗ4.5)，漩渦混合，超聲波處理30-60秒(400W的功率，每超聲9秒停6秒)；
③在步驟②的離心管中加入1.0nmol所述探針Tl，漩渦混合；
④在步驟③的離心管中加入2.5 μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的製備方法:將IOmg碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現用現配)充分混勻，室溫避光孵育30min ；
⑤在步驟④的離心管中加入2.5μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的製備方法同上)充分混勻，室溫避光孵育30min ；
⑥在步驟⑤的離心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清；
⑦在步驟⑥的離心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清；
⑧在步驟⑦的離心管中加入100 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重懸，得到微球懸液；
(3)將步驟(I)的產物和步驟(2)得到的微球懸液進行雜交即為實驗組，用TE緩衝液代替步驟(I)的產物即為對照組；將雜交體系混合均勻後98°C變性lOmin，然後在與雜交溫度相同的溫度下孵育15min，18000g離心2min，棄上清；然後加入50 μ L用I X TMAC雜交液稀釋至500倍體積的SA-PE，48°C -54°C (優選為54°C)雜交15min，18000g離心2min，棄上清；然後加入50 μ LI X TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，置於BD FACSArray液相晶片儀中進行分析；如果LQRR ^ 3，檢測結果為陽性；如果LQRR < 2，檢測結果為陰性；LQRR=MFIS/MFIB, MFIS為實驗組的螢光強度中位值，MFIB為對照組的螢光強度中位值。
PCR 擴增的反應程序:94°C 2min ；94°C 30sec、6(TC 30sec,72°C 30sec, 30 個循環；72°C延伸 5min ;4°C保溫。
液相晶片是一種新型快速檢測技術，集流式細胞術、納米螢光微球、螢光信號數字處理和傳統化學發光技術為一體，具有所需檢測樣本量少、檢測周期短的優點。
採用本發明提供的特異引物對鑑定對蝦白斑病病毒具有良好的特異性。採用本發明提供的引物探針組合物結合液相晶片鑑定對蝦白斑病病毒，除了良好的特異性外，還具有靈敏度高、操作簡便、所需時間短、不汙染環境、不存在對人的健康威脅，可以進行高通量檢測的優點。本發明非常適合對進出境水生動物進行檢測。
圖1為實施例2中的電泳圖。圖2為雜交溫度為54°C時，BD FACSArray液相晶片儀的輸出圖譜。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。DNA 提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.4.0):大連寶生物公司，D824A。PCR試劑盒(PCR Amplification Kit):大連寶生物公司，貨號為 R011。RNA 提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer4.0):大連寶生物公司，貨號為 DV819A。RT-PCR 試劑盒(PrimeScript RT-PCR Kit):大連寶生物公司，貨號為DRR014S。對蝦白斑病病毒(WSSV)，DNA病毒，參考文獻:江育林；陳在賢；鄭堅川.用PCR快速檢測對蝦白斑病病毒DNA.[J]中國動物檢疫.1998 (03)。流行性造血器官壞死病毒(EHNV)，DNA病毒，參考文獻:黃輝三；李明玉；母尹楠等流行性造血器官壞 死病毒(EHNV)PCR快速檢測試劑盒的研製.[J]臺灣海峽2011 (01)。鯉春病毒血症病毒(SVCV)，RNA病毒，參考文獻:付峰；劉葒；黃佳；蔡生力鯉春病毒血症病毒(SVCV)的研究進展[J]中國水產科學.2006 (02)。傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)，RNA病毒，參考文獻:嶽志芹；劉葒；梁成珠等實時定量RT-PCR檢測魚類傳染性造血器官壞死病毒方法的建立與應用[J].水生生物學報.2008(01)。病毒性出血性敗血症病毒(VHSV)，RNA病毒，參考文獻:悅穗；餘曉巍；王建平等；應用巢式逆轉錄聚合酶鏈反應檢測魚類病毒性出血性敗血症病毒(VHSV) [J]海洋與湖沼2009(07)。實施例1、特異引物對和特異探針的設計通過大量序列比對和擴增效果比較，設計用於擴增對蝦白斑病病毒的特異引物對和特異探針。特異引物對如下(靶序列為232bp):Fl (序列表的序列 I):5』 -CCGCAATGGAAAGTCTGA-3』 ；Rl (序列表的序列 2):5』 -GGTGAAGGAGGAGGTGTT-3』。特異探針的核苷酸序列(序列表的序列3)如下:5』 -CTGATGCACAGATGAAGGAAGAAGA-3』。實施例2、應用特異引物對輔助鑑定對蝦白斑病病毒分別將對蝦白斑病病毒、流行性造血器官壞死病毒、鯉春病毒血症病毒、傳染性造血器官壞死病毒和病毒性出血性敗血症病毒作為待測病毒進行如下實驗:
1、採用DNA提取試劑盒提取待測病毒(對蝦白斑病病毒或流行性造血器官壞死病毒)的基因組DNA。
2、以步驟I得到的基因組DNA為模板，採用Fl和Rl組成的引物對，採用PCR試劑盒，在梯度PCR擴增儀上進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
PCR擴增的反應體系:在0.2mL PCR反應管中，依次加入10XPCR buffer2.5 μ L、dNTP (各 2.5mmol/L) 2.Ομ UlOpmol/μ L Fl I μ L、IOpmol/μ L Rl I μ L、Taq (5U/μ L)0.25μ L、基因組DNA2.Ομ L(約300ng)，加入雙蒸水使反應體積達到25 μ L。以上反應體系中，除了引物、基因組DNA和雙蒸水，其它組分均為PCR試劑盒的組分。
PCR 擴增的反應程序:94°C 2min ；94°C 30sec、6(TC 30sec,72°C 30sec, 30 個循環；72°C 延伸 5min ;4°C 保溫。
3、採用RNA提取試劑盒提取待測病毒(鯉春病毒血症病毒、傳染性造血器官壞死病毒或病毒性出血性敗血症病毒)的總RNA。
4、以步驟I得到的總RNA為模板，採用Fl和Rl組成的引物對，採用RT-PCR試劑盒，在梯度PCR擴增儀上進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產物。
RT-PCR擴增的反應體系:在0.2mL PCR反應管中，依次加入10 X RT-PCRbuffer2.5 μ L> dNTP (各 2.5mmol/L) 2.0 μ L、IOpmol/μ L FlI μ L> IOpmol/ μ L Rll μ L、Inhibiter0.5 μ L、AMV XL0.5 μ L, AMV Taq (5U/μ L) 0.25 μ L、25mmol/L MgCl25.0 μ L、總RNA5.0 μ L，加入雙蒸水使反應體積達到25 μ L。以上反應體系中，除了引物、總RNA和雙蒸水，其它組分均為RT-PCR試劑盒的組分。
RT-PCR 擴增的反應程序:50 °C 30min ；94 °C 2min ；94 °C 30sec、60 °C 30sec、72°C 30sec,30 個循環；72°C延伸 5min ;4°C保溫。
5、將步驟2得到的PCR擴增產物和步驟4得到的RT-PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。
電泳圖見圖1，泳道I至泳道5依次為對蝦白斑病病毒、流行性造血器官壞死病毒、鯉春病毒血症病毒、傳染性造血器官壞死病毒和病毒性出血性敗血症病毒，泳道M為DL2000markero以對蝦白斑病病毒的核酸為模板，採用Fl和Rl組成的引物對進行PCR，得到了大小在100-250bp 之間擴增產物，其它四種病毒均未得到任何擴增產物。將對蝦白斑病病毒的擴增產物進行測序，測序結果表明，擴增產物的大小為232bp。
實施例3、應用引物探針組合物輔助鑑定蝦白斑病病毒
一、引物和探針的製備
製備如下引物和探針:
F2:5』 -biotin-CCGCAATGGAAAGTCTGA-3』 ；
R2:5』 -biotin-GGTGAAGGAGGAGGTGTT-3』。
探針T1: 5，-NH2-CTGATGCACAGATGAAGGAAGAAGA-3 』。
F2是在Fl的5』末端進行生物素標記得到的，R2是在Rl的5』末端進行生物素標記得到的。探針Tl是在序列表的序列3所示單鏈DNA片段的5』末端進行氨基化修飾得到的。
二、液相晶片檢測體系的建立
1、採用DNA提取試劑盒提取對蝦白斑病病毒的基因組DNA。
2、以步驟I得到的基因組DNA為模板，採用F2和R2組成的引物對，採用PCR試劑盒，在梯度PCR擴增儀上進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增的反應體系:在0.2mL PCR反應管中，依次加入10XPCR buffer2.5 μ L、dNTP (各 2.5mmol/L) 2.0μ UlOpmol/μ L F21 μ L、IOpmol/μ L R21 μ L、Taq (5U/μ L)0.25μ L、基因組DNA2.0μ L (約300ng)，加入雙蒸水使反應體積達到25 μ L。以上反應體系中，除了引物、基因組DNA和雙蒸水，其它組分均為PCR試劑盒的組分。PCR 擴增的反應程序:94°C 2min ；94°C 30sec、60°C 30sec、72°C 30sec, 30 個循環；72°C延伸 5min ;4°C保溫。3、寡核苷酸探針與微球共價偶聯①將表面羧基化的螢光編碼微球漩渦振蕩20s以使其充分分散，取75 μ L (約含3 X IO6個微球)置於1.5mL離心管中，IOOOOg離心lmin，棄上清。②在步驟①的離心管中加入50 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，漩渦混合，超聲波處理30-60秒(400W的功率，每超聲9秒停6秒)。③在步驟②的離心管中加入1.0nmol探針Tl，漩渦混合。④在步驟③的離心管中加入2.5 μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的製備方法:將IOmg碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現用現配)充分混勻，室溫避光孵育30min。⑤在步驟④的離心管中加入2.5μ L碳二亞胺溶液(碳二亞胺溶液的製備方法同上)充分混勻，室溫避光孵育30min。⑥在步驟 ⑤的離心管中加入1.0mL0.02g/100mL Tween-20水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清。⑦在步驟⑥的離心管中加入1.0mL0.1g/1OOmL SDS水溶液，混勻，IOOOOg離心lmin,棄上清。⑧在步驟⑦的離心管中加入100 μ L0.lmol/L N-甲基咪唑水溶液(pH4.5)，重懸微球(探針已偶聯至微球表面)，得到微球懸液，2-8°C避光保存，待用。4、雜交實驗組的雜交體系:由1.5 μ L步驟3得到的微球懸液、33 μ L1.5 X TMAC雜交液、
14.5 μ L TE緩衝液和2.5 μ L步驟2得到的PCR擴增產物(即25微升PCR擴增產物的十分之一)組成。空白對照組的雜交體系:用等體積的TE緩衝液代替RT-PCR擴增產物，其它同實驗組的雜交體系。將雜交體系混合均勻後於98°C變性lOmin，然後在與雜交溫度相同的溫度下孵育15min，18000g離心2min，棄上清；然後加入50 μ L用IXTMAC雜交液稀釋至500倍體積的SA-PE，選定溫度下雜交15min (分別採用481:、501:、521:、541:或561:的雜交溫度)，18000g離心2min，棄上清；然後加入50 μ LI X TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，置於BDFACSArray液相晶片儀中進行分析。每個雜交溫度的實驗組設置三個重複處理，每個雜交溫度的空白對照組設置三個
重複處理。每個重複處理中:參與計數的螢光編碼微球均在100個以上，表明用於計算的螢光編碼微球數量有效，所產生的螢光強度中位值(MFI)可信；3個空白對照組的螢光編碼微球的MFI值均小於500，試驗可進行結果判斷。
採用48 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為273，實驗組處理的MFI為4364±20.5。
採用50 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為269，實驗組處理的MFI為4953±15.6。
採用52 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為263，實驗組處理的MFI為5191±26.1。
採用54 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為274，實驗組處理的MFI為5769±17.2。
採用56 °C的雜交溫度，對照組處理的MFI為271，實驗組處理的MFI為2892±21.9。
結果表明:採用48°C _54°C的雜交溫度，實驗組處理的MFI變動幅度不大，採用高於54°C的雜交溫度時，實驗組處理的MFI下降劇烈，最佳雜交溫度為54°C。
雜交溫度為54°C時，BD FACSArray液相晶片儀的輸出圖譜見圖2。圖2中:A:突光編碼微球的數量及範圍:採用54°C的雜交溫度，實驗處理組在Red-A、YelloW-A通道下的相對螢光強度；C:採用54°C的雜交溫度，實驗處理組在Red-A通道下相對螢光強度；D:採用54°C的雜交溫度，實驗處理組在Yellow-A通道下相對螢光強度。從圖2可以觀察到，偶聯在微球上的探針Tl與對蝦白斑病病毒的PCR擴增產物在Red-A、Yel1w-A檢測通道下均有突光信號，表明液相晶片構建成功。
三、液相晶片檢測體系重複性驗證
重複進行三次步驟二，雜交溫度均採用54°C，計算各批次間檢測得到的MFI的變異係數。結果顯示，變異係數在5.8%以內，表明步驟二的方法具有良好的可重複性。
四、液相晶片檢測體系的特異性驗證
分別將對蝦白 斑病病毒、流行性造血器官壞死病毒、鯉春病毒血症病毒、傳染性造血器官壞死病毒和病毒性出血性敗血症病毒作為待測病毒進行步驟二，雜交溫度均採用54°C，結果見表I。
表I特異性檢測結果
權利要求
1.輔助鑑定對蝦白斑病病毒的特異引物對，由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
2.輔助鑑定對蝦白斑病病毒的引物探針組合物，由權利要求1所述特異引物對和探針Tl組成；所述探針Tl的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.權利要求1所述特異引物對或權利要求2所述引物探針組合物在製備輔助鑑定對蝦白斑病病毒的試劑盒中的應用。
4.權利要求1所述特異引物對或權利要求2所述引物探針組合物在輔助鑑定對蝦白斑病病毒中的應用。
5.輔助鑑定對蝦白斑病病毒的試劑盒，包括權利要求1所述特異引物對或權利要求2所述引物探針組合物。
6.一種輔助鑑定對蝦白斑病病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的基因組DNA為模板，用權利要求1所述特異引物對進行PCR擴增；如果所述PCR擴增得到了擴增產物，待測病毒為候選的對蝦白斑病病毒；如果所述PCR擴增沒有得到擴增產物，待測病毒為候選的非對蝦白斑病病毒。
7.一種輔助鑑定對蝦白斑病病毒的方法，包括如下步驟:以待測病毒的基因組DNA為模板，用權利要求1所述特異引物對進行PCR擴增後與權利要求2所述引物探針組合物中的探針Tl進行雜交，如果雜交結果為陽性待測病毒為候選的對蝦白斑病病毒，如果雜交結果為陰性待測病毒為候選的 非對蝦白斑病病毒。
全文摘要
本發明公開了一種基於液相晶片檢測對蝦白斑病病毒的方法。本發明提供了輔助鑑定對蝦白斑病病毒的特異引物對，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。本發明還保護輔助鑑定對蝦白斑病病毒的引物探針組合物，由所述特異引物對和探針T1組成；所述探針T1的核苷酸序列如序列表的序列3所示。採用本發明提供的特異引物對鑑定對蝦白斑病病毒具有良好的特異性。採用本發明提供的引物探針組合物結合液相晶片鑑定對蝦白斑病病毒，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、所需時間短、不汙染環境、不存在對人的健康威脅，可以進行高通量檢測的優點。本發明非常適合對進出境水生動物進行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103173570SQ20131011652
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月3日 優先權日2013年4月3日
發明者方紹慶, 尹偉力, 劉寧, 張曉文, 王穎, 許紅巖, 段效輝, 粟智平, 耿金培, 李金慶 申請人:中華人民共和國煙臺出入境檢驗檢疫局