一株短小桿菌以及由其發酵製備海藻糖的方法
2023-05-29 23:50:06
專利名稱：一株短小桿菌以及由其發酵製備海藻糖的方法
技術領域：
本發明涉及微生物發酵技術，尤其涉及一種具有低海藻糖酶活性的短小桿菌以及其在發酵製備海藻糖中的應用，屬於生物技術領域。
背景技術：
海藻糖是由兩個葡萄糖基通過a-a_l l鍵連接而成的非還原性二糖，分子式為C12H22O11 2H20，最早從生活在沙漠中的一種甲蟲蛹裡分離得到，後發現廣泛存在於植物、藻類、細菌、黴菌、酵母、昆蟲及無脊椎動物中。它不僅是生物體貯存的一種能量，而且對生物活性物質具有重要的抗逆保鮮作用，生物體處於乾燥、冷凍、高滲透壓、強輻射等不良環境下都能通過體內調節增加海藻糖的含量來抵禦外界不良傷害,此外,通過外加式的海藻糖同樣能對生物體和生物大分子起著良好的非特異性保護作用。海藻糖具有穩定蛋白質和細胞膜的功能，可廣泛應用於醫藥、食品、化妝品工業等領域，可用作藥物和疫苗、抗體、酶等生物製品的保護劑和穩定劑，長期保持它們的生物活性；也可用於器官移植和組織細胞(如造血幹細胞等)的保存。此外，海藻糖在食品保鮮、保質方面也有極其重要的用途。利用微生物來生產海藻糖是目前研究最多的海藻糖製備方法，包括微生物抽提法、酶轉化法等。微生物抽提法是以乳酸菌、酵母、黴菌及其他一些含海藻糖的菌體為提取源；首先通過乾燥、改變滲透壓等方法處理菌體；然後經過乙醇等有機溶劑抽提、精製，從而得到較高純度的海藻糖晶體。中國專利申請CN101481719公開了一種利用啤酒廢酵母同時製備酵母多糖、海藻糖及酵母抽提物的方法，該方法包括啤酒廢酵母脫苦去雜質，啤酒廢酵母的自溶以及酶解與滅活，酵母多糖的分離和乾燥，海藻糖的膜分離、濃縮、結晶及乾燥，酵母抽提物的濃縮及乾燥等步驟；但是採用微生物提取法製備海藻糖的產量不高，生產成本高，不利於工業化應用。酶轉化法製取海藻糖的途徑有多種，按其作用底物分，主要為澱粉、麥芽糖以及葡萄糖。以澱粉為主要原料，通過微生物產生的酶，轉化澱粉生產海藻糖的生產工藝包括①培養微生物，②提取微生物產生的與海藻糖合成有關的海藻糖基合成酶和海藻糖釋放酶，③利用微生物酶轉化澱粉生成海藻糖，④酶轉化體系中，海藻糖的提取純化。該法的優點是以澱粉為原料，生產成本較低，缺點是生產工藝複雜，產物海藻糖與轉化體系中的其他糖類，如麥芽糖、麥芽三糖分離困難，很難獲得高純度的海藻糖；以麥芽糖為原料，通過微生物發酵或微生物酶轉 化一步合成海藻糖，優點是工藝簡單，缺點是成本高，此外與酶轉化澱粉法相似，也存在不易獲得高純度的海藻糖產品的問題；以葡萄糖為底物，利用專一性很強的海藻糖-6-磷酸合成酶與海藻糖-6-磷酸酯酶共同催化葡萄糖可以高效的生成海藻糖，但是在整個反應過程中需要消耗高能物質m)P葡萄糖、GDP葡萄糖以及ADP葡萄糖，很難實現工業化大規模生產。同時酶轉化法還存在需要進行酶的製備和酶的轉化反應等多個步驟，從而導致整製備工藝複雜的缺點。複雜的生產工藝與昂貴的價格已成為海藻糖廣泛應用的最大障礙，因此研究開發海藻糖新的生產方法具有重要的現實意義和應用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種短小桿菌；本發明的另一個目的是提供上述短小桿菌發酵製備海藻糖的方法，從而以較低的成本、簡單的操作提高海藻糖的收率，增加海藻糖的純度。為達到上述發明目的，本發明採用的技術方案是:
一株短小杆sp.SY311菌株,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期是2013年I月21日，保藏號為CGMCC N0.7181。上述菌株最初是由土壤中分離得到，經過初篩、復篩和紫外線誘變而獲得的一株海藻糖高產菌株，具體包括以下步驟:
1)初篩
從備選菌株中，選出能分解海藻糖，即產生海藻糖酶的菌株。具體方法是將保存於斜面的各菌種，點種於以海藻糖作為唯一碳源的篩選平板上(培養基的組成(質量體積比):2%海藻糖；0.5%(NH4)2SO4 ；0.05% 酵母膏；0.1%KH2P04 ；0.06%Na2HP04.12H20 ；0.05%MgS04*7H20 ；2%瓊脂，pH為7.0-7.2)，30°C下培養3d，選取在該平板上生長良好的菌種，轉接於斜面，30°C下培養48h，4°C保存作為復篩菌種；
2)復篩
將初篩所得菌種各I環，接種於裝有發酵基礎培養基30ml的300ml三角瓶中，30°C下，震蕩培養3d，3000rpm離心15min，取上清液10 μ I點樣於1(T IOcm矽膠GF254板，進行薄層層析(TLC)檢測。於展層劑(丙酮:正丁醇:水=8: I: I)中二次展層，20%硫酸甲醇溶液顯色，110°C，反應IOmin顯出斑點，比較樣品和標準品各斑點，在同等實驗條件下，根據斑點的位置、大小和顏色的深淺，篩選出海藻糖高產株；
3)紫外線誘變
將培養18_24h的復篩後的菌株培養液，3000rpm離心lOmin，棄上清，菌體以0.1MKH2PO4-K2HPO4緩衝液(KPB，pH7.0)洗滌三遍後，懸浮於相同緩衝液中，使細菌濃度為1-5 X 108CFU/ml。取10-15ml，置平皿中，於紫外線下，分別照射45s和75s。以無菌水進行梯度稀釋後，塗布於葡萄糖作為唯一碳源的平板(培養基的組成(質量體積比):2%葡萄糖、
0.5%(NH4)2SO4'0.05% 酵母膏、0.1%KH2P04、0.06%Na2HP04.12Η20、0.05% MgS04.7H20、2% 瓊脂，pH為7.0-7.2，30°C下培養2d。挑取平板上的單菌落分別點種海藻糖平板和葡萄糖平板，30°C下培養2d。挑選在海藻糖平板上不生長，而在葡萄糖平板上生長良好的突變株，轉接斜面，30°C下培養2d，4°C保存。將突變菌株和野生菌株進行搖瓶發酵試驗，從中篩選得到海藻糖高產菌株。應用上述短小桿菌CGMCC N0.7181發酵製備海藻糖的方法，包括以下步驟:
(I)菌種活化，將菌種保藏號 為CGMCC N0.7181的短小桿菌sp.SY311菌株由斜面轉接入培養基中，30°C下，培養I 2天；(2)製備種子液，取上述活化菌種接種於種子培養基中，30°C下，以200rpm震蕩培養20 24h，以培養好的菌懸液作為種子液；按質量體積比，所述種子培養基的組成:2%麥芽糖，0.5% 蛋白腖，0.1% 酵母膏，0.1%KH2P04,0.06%Na2HP04.12H20，0.05% MgSO4.7Η20,其餘為水；
(3)發酵，將上述種子液按照2 4%的接種量接入到裝有培養基的發酵罐中發酵，每4 6h從罐中取樣，在95 100°C下烘乾至恆重檢測海藻糖和殘留葡萄糖含量，培養56 64h後終止發酵，得到發酵液；按質量體積比，所述培養基的組成:3 4%葡萄糖，0.6 0.9%玉米漿，0.4 0.6%KH2P04,其餘為水；
(4)去蛋白，將上述發酵液以2800 3200rpm離心8 12min，收集上清液，再經沸水浴8 Ilmin,過濾去除蛋白質得到清液；
(5)收集海藻糖組分,將上述清液流入陽離子交換柱,去離子水洗脫，收集海藻糖組分，再流入陰離子交換柱，去離子水洗脫，收集海藻糖組分；
(6)後處理，將上述海藻糖組分經過脫色、過濾、低壓濃縮、結晶、乾燥後得到產物海藻糖。上述技術方案中，按質量體積比，所述步驟(I)中培養基的組成為1%蛋白腖，0.5%酵母膏，0.5%麥芽汁，0.5%酪腖，0.2%牛肉膏，0.2%甘油，0.005%失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚(Toween80)，0.l%MgS04*7H20,1.5% 瓊脂，其餘為水。
上述技術方案中，所述步驟(3)中發酵溫度28 32°C，通氣量0.6 0.8: KV/V)，攪拌速度180 200rpm，發酵pH為5.5 6.0。上述技術方案中，所述步驟(5)中的陽離子交換柱為732陽離子交換柱，陰離子交換柱為717陰尚子交換柱。本發明中，脫色、過濾、低壓濃縮、結晶、乾燥屬於現有技術，本領域技術人員可以根據產物需要合理選擇；本發明優選:以活性炭或122樹脂對海藻糖組分脫色後，經過濾膜過濾(孔徑為0.45 μ m)得到含有海藻糖的濾液；採用旋轉薄膜蒸發儀，將濾液50°C減壓濃縮至無水分蒸出，邊攪拌邊加入冷凍無水乙醇，於4°C靜置過夜後，過濾收集海藻糖晶體；將海藻糖晶體於真空乾燥箱中，45°C真空乾燥5h即得到海藻糖產品。本發明中，葡萄糖和海藻糖的測定方法:將步驟(3)中的發酵液以3000rpm離心15min,以3，5_ 二硝基水楊酸比色法(DNS法)先測出上清液中葡萄糖的量，然後以6M HCl酸解樣品30min，NaOH中和後DNS法測定總糖量，然後按下列公式計算出上清液中海藻糖的量:
海藻糖=(總糖-還原糖)X 342/360 ;其中342為海藻糖分子量；360為2分子葡萄糖總分子量。發酵法是一種在一定的基質上培養菌株微生物，再通過微生物發酵來生產海藻糖，最後從發酵液中提取精製而得到海藻糖晶體的方法，其中菌株的選擇以及發酵液的成分對海藻糖的轉化、提取、精製結果起著決定作用。本發明利用的菌種短小桿菌Curtobacterium sp.SY311,保藏號CGMCC N0.7181,最初是由土壤中分離得到,經過初篩、復篩和紫外線誘變而獲得的一株海藻糖高產菌株，與野生型相比，海藻糖酶活性降低，有利於海藻糖的積累。由於上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點:1.本發明使用的菌株經過紫外線誘變突變，海藻糖酶活性低，即該菌株分解酵母液中海藻糖的能力弱，有利於海藻糖在發酵液中累計增加，從而提高最終海藻糖產物的收率。2.本發明利用葡萄糖為原料，通過發酵製備海藻糖，發酵液組分簡單，產物存在於發酵液中，雜質少，易於提純，製備得到的海藻糖產物與海藻糖標準品一致。3.本發明公開的製備工藝簡單，為一步法直接合成海藻糖，所用原料來源廣泛，成本低，適合於工業化生產。
圖1為實施例三中海藻糖、葡萄糖含量與發酵時間的關係 圖2為實施例四中海藻糖、葡萄糖含量與發酵時間的關係 圖3為本發明製備的海藻糖的紅外光譜 圖4為標準海藻糖樣品的紅外光譜圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:
實施例一誘變處理篩選短小桿菌突變株及性能測試
菌株最初是由土壤中分離得到，經過初篩、復篩和紫外線誘變而獲得的一株海藻糖高T11H, % Curtobacterium sp.SY311,保藏號CGMCC N0.7181,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期是2013年I月21日，具體包括以下步驟:
1)初篩
從備選菌株中，選出能分解海藻糖，即產生海藻糖酶的菌株。具體方法是將保存於斜面的各菌種，點種於以海藻糖作為唯一碳源的篩選平板上(培養基的組成(質量體積比):2%海藻糖；0.5%(NH4)2SO4 ；0.05% 酵母膏；0.1%KH2P04 ；0.06%Na2HP04.12H20 ；0.05%MgS04*7H20 ；2%瓊脂，pH7.0-7.2)，30°C，培養3d，選取在該平板上生長良好的菌種，轉接於斜面，30°C，培養48h，4°C保存作為復篩菌種；
2)復篩
將初篩所得菌種各I環，接種於裝有發酵基礎培養基30ml的300ml三角瓶中，30°C，震蕩培養3d, 3000rpm,離心15min,取上清液10 μ I點樣於1(T IOcm娃膠GF254板,進行薄層層析(TLC)檢測。於展層劑(丙酮:正丁醇:水=8: I: I)中二次展層，20%硫酸甲醇溶液顯色，110°C，反應IOmin顯出斑點，比較樣品和標準品各斑點，在同等實驗條件下，根據斑點的位置、大小和顏色的深淺，篩選出海藻糖高產株；
3)紫外線誘變
將培養18_24h的復篩後的菌株培養液，3000rpm，離心lOmin，棄上清，菌體以0.1MKH2PO4-K2HPO4緩衝液(KPB，pH7.0)洗滌三遍後，懸浮於相同緩衝液中，使細菌濃度為1-5X 108CFU/ml。取10-15ml，置平皿中，於紫外線下，分別照射45s和75s。以無菌水進行梯度稀釋後，塗布於葡萄糖作為唯一碳源的平板(培養基的組成(質量體積比):2%葡萄糖、0.5%(NH4)2S04、0.05% 酵母膏、0.1%KH2P04、0.06%Na2HP04.12Η20、0.05% MgS04.7H20、2% 瓊月旨，pH:7.0-7.2，30°C，培養2d。挑取平板上的單菌落分別點種海藻糖平板和葡萄糖平板，30°C，培養2d。挑選在海藻糖平板上不生長，而在葡萄糖平板上生長良好的突變株，轉接斜面，30°C，培養2d，4°C保存。將突變菌株和野生菌株進行搖瓶發酵試驗，從中篩選得到海藻糖高產菌株。本發明篩選得到的海藻糖高產菌株，菌體短杆狀，G+，無動力；在普通瓊脂培養基上，形成黃色圓形菌落，表面光滑、邊緣整齊；觸酶試驗( + )，MR試驗(-)，硝酸鹽還原試驗(-)，吲哚試驗( + )，澱粉水解(+ );最適生長溫度25-30 0C ;生長pH 6.0-10.0。實施例二搖瓶發酵製備海藻糖
本發明篩選得到的海藻糖高產菌株經過優化發酵工藝可製備得到高產量的海藻糖，具體包括如下步驟:
將保藏號CGMCC N0.7181的短小桿菌Curtobacterium sp.SY311轉接斜面，30°C，培養48h後取I環，接種於裝有30ml種子培養基的300ml三角瓶中，30°C，200rpm,震蕩培養20h，作為種子液；然後，將種子液按2-4%的種量接入裝有50ml發酵液的500ml三角瓶中。按質量體積比，所述斜面培養基的組成:1%蛋白腖、0.5%酵母膏、0.5%麥芽汁、
0.5%酪腖、0.2%牛肉膏、0.2%甘油、0.005%Toween80、0.l%MgS04*7H20、1.5%瓊脂，其餘為水；pH 為 7.0-7.2。按質量體積比，所述種子培養基的組成:2%麥芽糖、0.5%蛋白腖、0.1%酵母膏、
0.1%ΚΗ2Ρ04、0.06%Na2HP04.12H20、0.05%MgS04.7H20，pH 為 7.0-7.2。發酵培養基的組成為:葡萄糖3%、4%(W/V);玉米漿0.6%、0.9%(ff/V)；KH2PO4 0.4%、
0.5%、0.6% (W/V);發酵起始pH為5.5,6.0,6.5 ;發酵溫度為28°C、30°C、32°C ;接種量可為2%，3%、4 % (V/V)0具體發酵條件及發酵液中海藻糖產量見表1:
表1各組發酵條件
權利要求
1.一株短小桿菌sp.SY311菌株,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期是2013年1月21日，保藏號為CGMCC N0.7181。
2.應用權利要求1所述短小桿菌CGMCCN0.7181發酵製備海藻糖的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)菌種活化，將菌種保藏號為CGMCCN0.7181的短小桿菌sp.SY311菌株由斜面轉接入培養基中，30°C下，培養1 2天； (2)製備種子液，取上述活化菌種接種於種子培養基中，30°C下，以200rpm震蕩培養20 24h，以培養好的菌懸液作為種子液；按質量體積比，所述種子培養基的組成:2%麥芽糖，0.5% 蛋白腖，0.1% 酵母膏，0.1%KH2P04,0.06%Na2HP04.12H20，0.05% MgSO4.7Η20,其餘為水； (3)發酵，將上述種子液按照2 4%的接種量接入到裝有培養基的發酵罐中發酵，每4 6h從罐中取樣，在95 100°C下烘乾至恆重檢測海藻糖和殘留葡萄糖含量，培養56 64h後終止發酵，得到發酵液；按質量體積比，所述培養基的組成:3 4%葡萄糖，0.6 0.9%玉米漿，0.4 0.6%KH2P04,其餘為水； (4)去蛋白，將上述發酵液以2800 3200rpm離心8 12min，收集上清液，再經沸水浴8 Ilmin,過濾去除蛋白質得到清液； (5)收集海藻糖組分,將上述清液流入陽離子交換柱,去離子水洗脫,收集海藻糖組分，再流入陰離子交換柱，去離子水洗脫，收集海藻糖組分； (6)後處理，將上述海藻糖組分經過脫色、過濾、低壓濃縮、結晶、乾燥後得到產物海藻糖。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:按質量體積比，所述步驟(I)中培養基的組成為1%蛋白腖，0.5%酵母膏，0.5%麥芽汁，0.5%酪腖，0.2%牛肉膏，0.2%甘油，0.005%失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚(Toween80)，0.l%MgS04*7H20,1.5%瓊脂，其餘為水。
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟(3)中發酵溫度28 32°C，通氣量0.6 0.8: 1 (V/V)，攪拌速度180 200rpm，發酵pH為5.5 6.0。
5.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述步驟(5)中的陽離子交換柱為732陽離子交換柱，陰離子交換柱為717陰離子交換柱。
全文摘要
本發明公開了一種短小桿菌及其應用，該短小桿菌Curtobacterium sp. SY311菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.7181。由上述短小桿菌發酵製備海藻糖的方法，具體為(1)菌種活化；(2)製備種子液；(3)發酵；(4)去蛋白；(5)收集海藻糖組分；(6)後處理，將上述海藻糖組分經過脫色、過濾、低壓濃縮、結晶、乾燥後得到產物海藻糖。本發明使用的菌株經過紫外線誘變突變，海藻糖酶活性低，有利於海藻糖在發酵液中累計增加，從而提高最終海藻糖產物的收率；本發明公開的製備工藝簡單，為一步法直接合成海藻糖，所用原料來源廣泛，成本低，產物雜質少，易提純，適合於工業化生產。
文檔編號C12R1/01GK103173398SQ20131011569
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月3日 優先權日2013年4月3日
發明者王蕾, 黃瑞, 顧冠彬 申請人:蘇州大學