產芥子酶的深綠木黴菌株及其應用的製作方法

2023-05-29 17:35:06 2

專利名稱：產芥子酶的深綠木黴菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種木黴菌株及其應用。具體是一株能代謝產生芥子酶、對常見植物病原真菌有強烈拮抗作用的深綠青黴(Trichederma atroviride)及其在以蕓薹屬植物為土壤燻蒸材料時促進硫代葡萄糖甙降解的應用。屬於利用微生物對農業廢棄物或農副產品下腳料通過生物降解提高其生物有效性或實現廢棄物的高附加值的具體應用。
背景技術：
土傳病害是危害設施蔬菜生產的重要病害之一，主要通過土壤、植物殘體或土壤中的病菌殘體傳播。土壤消毒處理是控制土傳病害的重要措施，其中以溴甲烷為代表的土壤燻蒸劑因為其較好的使用效果一直在多種作物土傳病害的防治上被廣泛應用，但由於它對臭氧層的破壞作用，聯合國環境規劃署在1997年規定工業國家在2005年禁用溴甲烷，而發展中國家也將於2015全面禁用溴甲烷。因此，溴甲烷替代技術研究將是當前及未來很長時間內土壤消毒的研究熱點之一。生物燻蒸是利用外源加入到土壤中的植物有機質在分解過程中產生的揮發性殺生氣體抑制或殺死土壤中的有害生物的方法。1994年Angus等將蕓薹屬(Brassica spp.) 植物組織深翻到小麥田，發現能夠減少小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis var. tritici)的數量，並首次將該種土壤處理方法稱為生物燻蒸。蕓薹屬植物組織中含有大量的硫代葡糖酸酯(Glucosinolates, GSLs), GSLs本身的殺生活性不高,但植物組織在腐爛過程中，GSLs可被植物自身產生的植物源酶一黑芥子酶(Myrosinase)水解而形成揮發性和殺生性很強的異硫氰酸酯(Isothiocyanates, ITCs)類物質,對農業生產中的寄生線蟲、 鍵刀菌(Fusarium spp.)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)大_花輪枝抱(Verticillium dahliae)、根腐絲囊黴(Aphanomyces euteiches)、疫黴(Phytophthoraspp.)和畸雌腐黴 (Pythium irregulare)等多種重要土傳植物病原菌和雜草昆蟲等具有很強的抑制殺生作用。此外，生物燻蒸還能提高土壤有機質含量、改善土壤結構、對環境無汙染、對植物無藥害，因此被視為很有應用前景的環保型土壤處理措施。生物燻蒸材料的降解是由微生物或酶參與的生物學過程，大量的應用和研究發現，即使是相同的植物原料，生物燻蒸效果仍然不穩定，可預見性差，影響生物燻蒸效果的因素主要有燻蒸材料中GSLs的總含量及GSLs的種類、土壤水份含量、土壤溫度以及燻蒸材料的降解速度和降解程度，因此，如何通過優化以上影響提高生物燻蒸的效果將是生物燻蒸技術研究的熱點。國外已有的研究表明，在土壤處理時間內，蕓薹屬植物中硫代葡萄糖苷的降解率僅為30-50%，排除土壤條件及材料的破碎程度的影響後，促進燻蒸材料中GSLs 降解的芥子酶的含量及活性高低是重要的影響因素，而通過在土壤中添加能促進生物燻蒸材料快速降解、釋放殺生氣體的微生物菌株將為生物燻蒸研究提供新的思路和技術支撐。芥子酶普遍存在於所有含硫甙葡萄糖苷植物的種子、根、莖和葉中。目前在分屬 15個科500多種雙子葉植物中均鑑定到黑芥子酶的存在，但在實際的燻蒸過程中，植物內源的芥子酶的活性仍不能滿足GSLs降解的要求。此外，國外研究還發現微生物體內以及一些以含黑芥子酶的植物為宿主的昆蟲中也存在黑芥子酶，例如Aspergillus sp. NR46F13、 啤酒酵母、交鏈抱黴屬的 Alternaria brassicae、莖點黴(Lepthosphaeria maculans 或 Phoma Iingam)、擬步行蟲(Tenebrio molitor)、黃條跳甲(Phyllotreta undulate)、甘藍蟲牙(Brevicoryne brassicae)、小菜蛾(Plutella xylostella)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等。但國內對微生物或昆蟲體內芥子酶的研究幾乎還處於空白狀態。更未有通過添加產芥子酶的微生物提高生物燻蒸效果的公開報導。深綠木黴由於其較強的生態競爭能力、對許多植物病原真菌的生長抑制作用以及對作物生長的促進作用，已被國內外作為一種重要的生防菌在農業生產上應用，但對於能代謝產生芥子酶的深綠木黴，國內外未見公開報導。

發明內容
本發明的目的在於針對以蕓薹屬植物為土壤生物燻蒸材料時，其中的GSLs降解釋放殺生氣體ITCs的速度慢、降解程度低進而燻蒸效果不穩定的生產實際問題，提出將一種能代謝產生芥子酶促進GSLs降解釋放殺生氣體ITCs、同時對植物病原菌具有拮抗作用而對植物生長具有促進作用、生長速度快、易於培養、土壤定殖力強的深綠木黴 Trichederma atroviride菌株應用於土壤的生物燻蒸，以提高其對土傳病蟲害的防治效果O本發明的目的是這樣實現的一種產芥子酶的深綠木黴(Trichederma atroviride)菌株，其特徵在於所述深綠木黴菌株的保藏號為CGMCCNo. 5609,該菌株在 PDA平板上30°C培養4天即可覆蓋直徑90mm的平板，菌絲體表面疏鬆、平坦，初為白色；在培養的第3天明顯可見有孢子產生，最初為淡綠色，以後逐漸增多，呈現深綠色，產孢叢束排列成同心的輪紋，培養基背面棕黃色。一種保藏號為CGMCC No. 5609的產芥子酶的深綠木黴菌株的應用，其特徵在於 將所述深綠木黴以固體菌劑的形式施用到含有蕓薹屬(Brassica spp.)植物組織為燻蒸材料的土壤中，通過生物燻蒸殺滅土壤中的病蟲害，防治作物土傳病害。在所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用中所述深綠木黴的固體菌劑是這樣獲得的將深綠木黴的保藏菌株置入試管斜面培養基PDA中進行試管斜面活化後，再置入裝有液體培養基I3DB的容量為250ml的三角瓶，裝液量為80ml/250ml ;將三角瓶置於搖床培養 3-4天，搖床的轉速160r/min，培養期的環境溫度為28±2°C;結束後以5%接種量V/W接入固體培養基，在28±2°C環境中繼續培養6-8天，每隔2-3天翻拌一次，至產孢；最後自然風乾或30°C烘乾後粉碎過10-20目篩，獲得固體菌劑，固體菌劑中的含菌量為lO.Ucfu/g。在所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用中所述的試管斜面培養基PDA是這樣獲得的稱取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時，然後用兩層紗布過濾，再加葡萄糖20 克，瓊脂20克，溶化後補足水至1000毫升；所述的液體培養基PDB是這樣獲得的稱取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時，然後用兩層紗布過濾，再加葡萄糖20克，溶化後補足水至1000毫升；所述的固體培養基是由質量配比為I : I : I的麩皮草炭稻草粉復配均勻混合後獲得。在所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用中所述的以固體菌劑形式加入到含有蕓薹屬植物組織的土壤中進行生物燻蒸防治植物土傳病害是指在蕓薹屬植物組織均勻撒到土壤表層後，將固體菌劑均勻撒在植物組織表面，隨後進行土壤旋耕，澆水後覆蓋塑料膜， 固體菌劑用量為30-40公斤/畝。在所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用中所述的蕓薹屬植物組織是指芥菜、 油菜、大白菜、甘藍的植物組織，或芥菜、油菜、大白菜、甘藍的殘體，或由它們製備的餅柏。本發明的優點在於保藏號為CGMCC No. 5609的產芥子酶的深綠木黴 (Trichederma atroviride)菌株,對殺生氣體ITCs有極強的耐受能力，它不僅能代謝產生促進GSLs降解快速釋放殺生氣體ITCs，而且作為一種已被廣泛接受的生防菌，對多種土傳病害有較好的防效；尤其是該菌株生長速度快，易於培養且產孢子量大，有較強的土壤及根際定殖能力，在土壤燻蒸期發揮其促進ITCs釋放的功能，燻蒸結束後繼續發揮其生防菌的功能，是一株優良的多功能生防菌株。該菌株的固體菌劑的可以通過常規的固體淺盤培養， 成本低，生產方法簡單，可操作性強，本發明為土壤生物燻蒸注入新生力量，提供一種新的技術支撐。


圖I是深綠木黴(Trichederma atroviride)) 18SrDNA的ITS3部分序列分析聚類結果。圖2是固體菌劑對瓜果腐黴(Pythium aphanidermatum)的抑制作用；圖中，A為培養24小時的觀察圖，B為培養72小時的觀察圖。圖3是固體菌劑對立枯絲核病菌(Rh izoctonia solani Kiihn)的抑制作用；圖中，A為培養24小時的觀察圖，B為培養72小時的觀察圖。圖4是固體菌劑對辣椒疫黴病菌(Pytophthora capsici Leonian)的抑制作用； 圖中，A為培養24小時的觀察圖，B為培養72小時的觀察圖。圖5是固體菌劑對辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)的抑制作用；圖中， A為培養24小時的觀察圖，B為培養72小時的觀察圖。圖6是固體菌劑對辣椒枯萎病菌(Fusaiumoxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans) 的抑制作用；圖中，A為培養24小時的觀察圖，B為培養72小時的觀察圖。
具體實施例方式實施例I江蘇省農業科學院從土壤中篩選得到一種木黴菌株，該菌株於2011年12月23 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。保藏號為CGMCC No.5609，菌株特徵為在PDA平板上30°C培養4天即可覆蓋直徑90mm的平板，菌絲體表面疏鬆、平坦，初為白色；在培養的第3天明顯可見有孢子產生，最初為淡綠色，以後逐漸增多，呈現深綠色，產孢叢束排列成同心的輪紋，培養基背面棕黃色。經形態學和分子生物學手段鑑定為深綠木黴(Trichederma atroviride)。分子生物學鑑定結果深綠木黴(Trichedermaatroviride) ITS 序列為 SEQ ID N0. I。
深綠木黴(Trichederma atroviride) 18SrDNA的ITS3部分序列分析聚類結果見圖I。圖I為該深綠木黴(Trichederma atroviride)的系統發育樹。採用鄰位相連算法(Neighbor Joining method)獲得分支系統樹,並通過自舉分析(bootstrap)進行置信度檢測，自展數據集為1000次。用Mega4. O進行統計和聚類分析構建進化樹。用Kimura 雙參數模型，計算各序列分化距離，缺少和不確定的位點在計算中被省略。結果表明該菌株與發育樹中深綠木黴(Trichederma atroviride)的同源性最高,達90%,所以確定該菌株為深綠木黴。實施例2 培養基的配製試管斜面培養基PDA的配製稱取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時，然後用兩層紗布過濾，再加葡萄糖20克，瓊脂20克，溶化後補足水至1000毫升，裝量為試管高度的1/5-1/6，用試管塞塞好試管口，121°C高壓滅菌25min，趁熱取出後擺斜面至冷卻備用， 斜面高度不超過試管高度的1/3。液體種子培養基PDB的配製稱取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時，然後用兩層紗布過濾，再加葡萄糖20克，補足水至1000毫升，然後分裝，裝液量為80-100ml/250ml 三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121 °C高壓滅菌25min，冷卻後備用。固體培養基的配製麩皮草炭稻草粉質量配比為I: I : I。在本實施例中， 取麩皮1kg，草炭1kg、稻草粉Ikg均勻攪拌，加水調整培養基水分含量為60-65%，121 °C高壓滅囷40min,間隔24小時後在冋樣條件重新滅囷一次，冷卻後備用。實施例3 產芥子酶的深綠木黴(Trichederma atroviride)固體菌劑的製備(本實施例涉及的各種培養基均勻實施例2提供)a)菌種的活化採用試管斜面保藏菌種的活化方法將試管斜面保藏的菌種挑取一塊直徑5mm左右的保藏號為為CGMCC No. 5609的深綠木黴菌絲塊接種到試管斜面培養基PDA中活化，在 28±2°C的環境中培養3-5天後備用。採用安瓿管冷凍乾燥保藏菌種的活化方法在超淨工作檯中用70%酒精棉球擦洗安瓿，然後用砂輪在安瓿中挫一道溝，用無菌紗布墊或無菌毛巾包好安瓿，然後用手掰開安瓿管向其中加入0. 5-1. Oml液體培養基TOB，慢慢旋轉安瓿，使凍幹菌種復水，然後再將此轉接到試管斜面培養基PDA中活化，在28±2°C的環境中培養3-5天後備用。b)液體培養將試管活化好的所述深綠木黴挑取三塊直徑8mm左右的菌塊分別接種在三個容積為250ml的裝有IOOml液體培養基PDB三角瓶中，置於搖床，搖床的轉速160r/min，在 28±2°C的環境中培養3-4天後備用。c)固體培養將液體培養好的250ml所述深綠木黴培養物接入5kg固體培養基中，將固體培養物平鋪在淺盤中，厚度5-8cm，上面蓋上雙層經高壓滅菌處理的紗布，在28±2°C環境中繼續培養6-8天，每隔2-3天翻拌一次，同時適當補加無菌水，培養至產孢；最後自然風乾或30°C烘乾(水分含量小於10% )即為固體菌劑，菌劑含菌量為lO—cfu/g。以上所有接種操作必須在無菌條件下，即在超淨工作檯的酒精燈旁或經紫外線滅菌處理1-2小時的房間，固體培養的房間也需事先用紫外線滅菌處理1-2小時。實施例4保藏號為CGMCC No. 5609的深綠木黴(Trichederma atroviride)對生產上常見病原真菌生長的抑菌試驗參試菌株瓜果腐黴(Pythiumaphanidermatum)；立枯絲核病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)；辣椒疫黴病菌(Pytophthoracapsici Leonian)；辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)；辣椒枯萎病菌(Fusaiumoxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans)。試驗方法將保藏號為為CGMCC No. 5609的深綠木黴及各病原菌分別單獨接種到PDA平板上，30°C恆溫培養，獲得各個菌株的新鮮菌絲塊(直徑5毫米)，再將該深綠木黴分別與各個病原菌的新鮮菌絲塊接種到PDA平板的中(每個平板接種I個深綠木黴的菌絲塊以及I種病原菌的菌絲塊)，兩個菌絲塊之間相距5釐米，30°C恆溫箱中分別於24小時和72小時培
養觀察。試驗結果見圖2 圖6，由圖可見，保藏號為為CGMCC No.5609的深綠木黴 (Trichederma atroviride)對瓜果腐黴(Pythium aphanidermatum);立枯絲核病菌(Rh izoctonia solani Kiihn);辣椒疫黴病菌(Pytophthora capsici Leonian);辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici);辣椒枯萎病菌(Fusaium oxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans)等都有比較明顯的生長抑制作用，所述的深綠木黴主要是通過重寄生作用抑制或殺滅病原菌，即通過分泌多種複合抗生物質或者能降解病原菌細胞壁的多種酶達到抑制靶標病原菌生長的效果。實施例5 產芥子酶的深綠木黴(Trichederma atroviride)固體菌劑(實施例3提供)的使用土壤施足底肥，再均勻施入事先破碎成5-8釐米長短蕓薹屬植物組織或殘體或相應餅肥，每畝用量乾物重400-500公斤，將固體菌劑均勻撒到土壤表層，隨後進行土壤旋耕，再給土壤澆水至土壤持水量的70%左右，然後覆蓋塑料薄膜，塑料薄膜四邊要深埋入土中確保密封不漏氣，平均土溫高於15度時保持10-13天，平均土溫低於15度時保持20-25 天，燻蒸結束後揭開塑料膜自然晾曬2-3天後即可栽種。固體菌劑用量為30-40公斤。採用這種方法可完全殺死土壤中的各種病原生物和雜草種子，對土壤進行徹底消毒，加入深綠木黴在夏季使得燻蒸時間縮短3-5天，冬天縮短5-7天。所述的蕓薹屬植物組織是指芥菜、油菜、大白菜、甘藍的植物組織，或芥菜、油菜、大白菜、甘藍的殘體，或由它們製備的餅柏。實施例6 :固體菌劑(由實施例3提供)加入到用菜柏作為燻蒸材料的土壤中對辣椒疫黴病的防效(盆栽試驗)
病原菌辣椒疫黴由本實驗室收藏或者到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心也可獲得。化學燻蒸劑棉隆，由南通壟鑫農藥有限公司提供。菜柏隴油7號油菜的菜柏。實驗在溫室進行，土壤為水稻田土自然風乾後過5mm篩後與草炭以5 I (V/V)比例混合備用，病原菌為辣椒疫黴遊動孢子液，接種濃度為100個孢子/g土。設以下處理1、 空白對照，土壤不作任何處理。2、病原菌，土壤只接種辣椒疫黴孢子液。3、棉隆+病原菌， 棉隆用量為O. 01% (W/W)。4、菜柏+病原菌，菜柏用量為O. I % (W/W)。5、固體菌劑+菜柏 +病原菌，菜柏用量為O. 1% (W/W)，固體菌劑接種濃度為IXlO6個孢子/克土。將每個處理的土壤混合物裝入塑膠袋中密封，置於人工氣候箱中培養。人工氣候箱條件為12h，35°C，相對溼度80%，另外1211，181，相對溼度80%。土壤溼度70%。培養10天後，打開塑膠袋口自然攤晾24小時後裝盆，移栽4葉期辣椒苗，每盆栽I棵，每個處理10棵，分別在移栽後的
7、15、21天觀察辣椒發病情況，統計發病率。本實驗重複做2次。表I盆栽條件下不同燻蒸方法對辣椒疫病發病率的影響)
權利要求
1.一種產芥子酶的深綠木黴(TricAeofezma airoririofe)菌株,其特徵在於所述深綠木黴菌株的保藏號為CGMCC No. 5609，該菌株在PDA平板上30°C培養4天即可覆蓋直徑90mm的平板，菌絲體表面疏鬆、平坦，初為白色；在培養的第3天明顯可見有孢子產生， 最初為淡綠色，以後逐漸增多，呈現深綠色，產孢叢束排列成同心的輪紋，培養基背面棕黃色。
2.一種保藏號為CGMCC No. 5609的產芥子酶的深綠木黴菌株的應用，其特徵在於將所述深綠木黴以固體菌劑的形式施用到含有蕓薹屬(Brassica )植物組織為燻蒸材料的土壤中，通過生物燻蒸殺滅土壤中的病蟲害，防治作物土傳病害。
3.根據權利要求2所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用，其特徵在於所述深綠木黴的固體菌劑是這樣獲得的將深綠木黴的保藏菌株置入試管斜面培養基PDA中進行試管斜面活化後，再置入裝有液體培養基PDB的容量為250ml的三角瓶，裝液量為80ml/250ml ;將三角瓶置於搖床培養3-4天，搖床的轉速160r/min，培養期的環境溫度為28±2°C ;結束後以5%接種量V/W接入固體培養基，在28 ±2°C環境中繼續培養6-8天，每隔2_3天翻拌一次，至產孢；最後自然風乾或30°C烘乾後粉碎過10-20目篩，獲得固體菌劑，固體菌劑中的含菌量為Wcfu/g。
4.根據權利要求3所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用，其特徵在於所述的試管斜面培養基PDA是這樣獲得的稱取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時，然後用兩層紗布過濾，再加葡萄糖20克，瓊脂20克，溶化後補足水至1000毫升；所述的液體培養基PDB是這樣獲得的稱取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時，然後用兩層紗布過濾，再加葡萄糖20克，溶化後補足水至1000毫升；所述的固體培養基是由質量配比為I :1 1的麩皮草炭稻草粉復配均勻混合後獲得。
5.根據權利要求2所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用，其特徵在於所述的以固體菌劑形式加入到含有蕓薹屬植物組織的土壤中進行生物燻蒸防治植物土傳病害是指在蕓薹屬植物組織均勻撒到土壤表層後，將固體菌劑均勻撒在植物組織表面，隨後進行土壤旋耕，澆水後覆蓋塑料膜，固體菌劑用量為30-40公斤/畝。
6.根據權利要求2所述產芥子酶的深綠木黴菌株的應用，其特徵在於所述的蕓薹屬植物組織是指芥菜、油菜、大白菜、甘藍的植物組織，或芥菜、油菜、大白菜、甘藍的殘體，或由它們製備的餅柏。
全文摘要
本發明涉及一種產芥子酶的深綠木黴菌株及其應用，深綠木黴菌株的保藏號為CGMCCNo.5609，使用中，是將所述深綠木黴以固體菌劑的形式施用到含有蕓薹屬植物組織為燻蒸材料的土壤中，通過生物燻蒸殺滅土壤中的病蟲害，防治作物土傳病害。
文檔編號C12N1/14GK102604842SQ20121006820
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者常志州, 張建英, 徐躍定, 殷蒙, 馬豔 申請人:江蘇省農業科學院