多級pcr反應系統及其應用的製作方法
2023-05-29 17:49:41 1
多級pcr反應系統及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種多級PCR反應系統及其應用。具體地，本發明公開了一種多級PCR反應器，所述反應器包括二個或多個可封閉的PCR反應管或腔或隔室，並且在至少兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道，所述連接通道用於讓攜帶所需量的PCR擴增產物的固體顆粒從上遊隔室轉移至下遊隔室，實行無交叉幹擾的多級可控PCR反應。本發明的反應器，使極其靈敏、但卻又長期無法廣泛實際應用的多級PCR反應體系成為一項能在多種廣泛領域實際應用的常規技術。
【專利說明】多級PCR反應系統及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物和檢測領域，具體地，本發明涉及新穎的多級PCR系統及其應用。【背景技術】
[0002]PCR是涉及通過多個循環，指數擴增某種多核苷酸序列的技術。PCR技術是眾所周知的，並且已經被廣泛使用。
[0003]PCR技術一般包括以下步驟:變性多核苷酸，然後將至少一對引物寡核苷酸退火到變性的多核苷酸上(使引物與變性的多核苷酸模板雜交)。退火步驟之後，具有聚合酶活性的酶，使用最初的變性多核苷酸作為合成模板，催化合成一條新的摻入了引物寡核苷酸的多核苷酸鏈。這一系列步驟(變性、引物退火和引物延伸)構成一個PCR循環。
[0004]隨著循環的重複，新合成的多核苷酸的量指數增加，因為由較早循環新合成的多核苷酸可用作後續循環的合成模板。
[0005]DNA的變性一般發生在約90-95°C，引物一般在約40_60°C退火至變性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步驟一般在約70-75°C進行。因此，在PCR循環中，必須改變反應混合物(反應體系)的溫度，在多循環PCR實驗中要多次改變。
[0006]PCR技術具有廣泛的生物學應用，包括例如，DNA序列分析、探針產生、克隆核酸序列、定位誘變、檢測基因突變、診斷病毒感染、分子「指紋分析」和監測生物液體和其他來源中的汙染微生物。
[0007]多重PCR (multiplex PCR，又稱多重引物PCR或複合PCR)，是在同一 PCR反應體系裡加入兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同。
[0008]多重PCR技術已被廣泛應用於核酸診斷的許多領域，包括基因敲除分析、突變和多態性分析、定量分析及RNA檢測等。在感染性疾病領域，多重PCR技術已經顯示出它的價值，成為識別病毒、細菌、真菌和寄生蟲的有效方法。利用一次多重PCR反應，可同時檢測、鑑別出多種病原體，在臨床混合感染的鑑別診斷上具有其獨特的優勢和很高的實用價值。
[0009]然而,在實際應用中，無論的常規PCR反應還是多重PCR反應體系,如果環境或操作過程中引入極少量外源性DNA汙染，就可能出現假陽性結果。為了防止汙染，一些實驗不得不在高度潔淨的操作設備或操作室進行。
[0010]在PCR反應過程中，各種試驗條件控制不當很容易導致擴增失敗，降低其靈敏度和特異性。
[0011]此外，現有PCR技術能夠檢測的靈敏度還難以令人滿意，尤其是在對含量極低的核酸樣品(如僅含1-10個拷貝目標序列的樣品)。在活檢、屍檢樣品中檢測病原體(如HPV)時，因無關核酸物質的存在，檢測靈敏度一直難以提高。
[0012]綜上所述，目前還缺乏在封閉反應體系中，對PCR擴增產物簡便有效地進行定量或半定量轉移的方法。
[0013]因此本領域迫切需要開發一種靈敏度高、特異性好、抗幹擾能力強的HPV型別的鑑定方法。
【發明內容】
[0014]本發明的目的就是提供一種靈敏度高、特異性好、抗幹擾能力強的PCR反應設備和方法。
[0015]本發明的第一方面，提供了一種多級PCR反應管，所述反應管包括二個或多個可封閉的PCR反應腔或隔室(10) (compartment)，並且在至少兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用於讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒(50)從一個隔室(或上遊隔室)轉移至另一隔室(或下遊隔室)。
[0016]在另一優選例中，所述的反應管包括η個隔室，其中η為2-5000的任一正整數；較佳地，η為2-500的任一正整數。
[0017]在另一優選例中，所述的反應管包括M個多級組，各多級組分別具有2、3、4或5個相互連通的隔室，其中M為1-1000的任一正整數。
[0018]在另一優選例中，M為 192、96、48、24、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或 I。
[0019]在另一優選例中，所述的PCR反應管的隔室呈直鏈構型、支鏈構型、或環形構型。較佳地，呈「一」字構型、「V」字構型、或「□」或「〇」字等構型。
[0020]在另一優選例中，所述的各隔室為串聯設置。
[0021]在另一優選例中，所述的隔室呈矩陣排列，所述矩陣為aXb矩陣，其中a為2_100的正整數，b為2-100的正整數。
[0022]在另一優選例中，所述的矩陣為6X8、6X16、8X12、12X16矩陣。
[0023]在另一優選例中，所述的隔室具有腔蓋(20)，並且對於相互連通的多個隔室而言，當各自的腔蓋全部蓋上後，就構成一個封閉空間。
[0024]在另一優選例中，所述腔蓋為密封蓋。
[0025]在另一優選例中，所述腔蓋與隔室是一體化的；更佳地，上述腔蓋通過連接件 (22)與隔室腔體連接。
[0026]在另一優選例中，所述的腔蓋與隔室腔體是分離的。
[0027]在另一優選例中，所述多個或全部腔蓋是一體的。
[0028]在另一優選例中，所述連接通道位於反應腔或隔室上部。
[0029]在另一優選例中，所述的連接通道高於隔室中預定的液相PCR反應體系的液面。
[0030]在另一優選例中，所述的連接通道入口的下沿距離隔室上沿的距離Hl與隔室上沿與隔室底部的垂直高度H之比滿足:H1/H< 1/2，較佳地< 1/3，更佳地< 1/4，較佳地(1/5。
[0031]在另一優選例中，所述PCR反應管具有2個或3個互相連通的PCR隔室。
[0032]在另一優選例中，所述單個PCR隔室的容積約為10-10000微升，較佳地20-2000微升，更佳地30-1000微升，最佳地40-500微升。
[0033]在另一優選例中，所述連接通道的內徑為0.l_20mm，較佳地為0.2_10mm，更佳地為 0.2_5mm。
[0034]在另一優選例中，所述連接通道的長度為0.1-lOOmm，較佳地0.2_50mm。
[0035]在另一優選例中，所述連接通道是封閉的。[0036]在另一優選例中，當所述上遊隔室蓋上腔蓋後，所述連接通道在上遊隔室的入口隔室上部，並且位於腔蓋下沿下方，從而使得攜帶PCR擴增產物的固體顆粒被抬升從而離開位於隔室下方的反應體系後，進入所述入口，經過連接通道，再通過所述連接通道在下遊隔室的出口，進入下遊隔室。
[0037]在另一優選例中，所述的上遊隔室設有引導板，用於引導攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從上遊隔室進入連接通道入口。
[0038]在本發明的第二方面，提供了一種進行多級PCR反應的系統，所述系統包括:
[0039]本發明第一方面中所述的多級PCR反應管，以及
[0040]固體顆粒，所述固體顆粒位於所述多級PCR反應管的至少一個上遊隔室中，並且在所述上遊隔室內進行PCR反應時，所述固體顆粒能吸附在擴增過程中形成的擴增產物。[0041 ] 在另一優選例中，所述的固體顆粒是磁性微球。
[0042]在另一優選例中，所述固體顆粒的平均粒徑為0.01~IOmm,較佳地為0.最佳地為0.2-2mm。
[0043]在另一優選例中，所述固體顆粒的核酸吸附力受到顆粒表面積和表面性質等因素的影響。通常，每個顆粒可攜帶整個PCR反應體系中PCR擴增產物的約1/200-1/10，較佳地約 1/100-1/15，更佳地 1/50-1/20。
[0044]在另一優選例中,所述的磁性微球為核殼結構。
[0045]在另一優選例中，所述的磁性微球是表面未修飾的、表面修飾的、或表面帶有塗層。
[0046]在本發明的第三方面，提供了一種多級PCR反應方法，所述方法包括步驟:
[0047](a)提供本發明第一方面所述的多級PCR反應管；
[0048](b)在所述多級PCR反應管的PCR反應隔室中加入進行PCR反應所需的試劑，形成液相PCR反應體系，並且在一個或多個上遊隔室中加入PCR模板材料和用於吸附擴增產物的固體顆粒，但在下遊隔室中不加入PCR模板材料，並且各隔室內的液相PCR反應體系互不連通且互不接觸；
[0049](c)封閉所述多級PCR反應管的上遊隔室和下遊隔室，從而對於相互連通的多個隔室而言，當各自的腔蓋全部蓋上後，構成一個封閉空間；
[0050](d)在上遊隔室Rl中進行PCR反應，形成第一 PCR擴增產物以及吸附有所述第一PCR擴增產物的固體顆粒；
[0051](e)抬升所述吸附PCR擴增產物的固體顆粒，離開位於所述上遊隔室下方的液相PCR反應體系後，進入所述連接通道的入口，經過連接通道，進入位於所述上遊隔室下遊的另一下遊隔室R2，作為所述下遊隔室中的PCR模板材料；
[0052](f)在所述下遊隔室R2中進行PCR反應，形成第二 PCR擴增產物。
[0053]在另一優選例中，所述的PCR反應包括高溫PCR、低溫PCR、雙引物PCR反應、多引物PCR反應、RT-PCR反應、DNA聚合酶PCR反應、RNA聚合酶PCR反應。
[0054]在另一優選例中，所述的進行PCR反應所需的試劑選自下組:PCR引物、緩衝液、dNTP、聚合酶、鎂離子等。
[0055]在另一優選例中，位於所述上遊隔室中的PCR引物或引物對、與位於所述下遊隔室中PCR引物或弓丨物對是不同的、或相同的。[0056]在另一優選例中，所述方法包括:
[0057](g)當所述多級PCR反應管具有下遊隔室Ri時，其中i為≥2的正整數，
[0058]則在下遊隔室Ri中進行PCR反應，形成吸附有第i級PCR擴增產物的固體顆粒；和
[0059]將所述吸附有第i級PCR擴增產物的固體顆粒通過另一連接通道轉移至次一級的下遊隔室Ri+1，並在所述下遊隔室Ri+1中進行PCR反應，從而形成第i+1級PCR擴增產物和任選的形成吸附有第i+1級PCR擴增產物的固體顆粒；
[0060](h)任選地重複步驟(g) 一次或多次。
[0061]在另一優選例中，所述方法還包括步驟:對所述第二 PCR擴增產物進行檢測；或對多級PCR的擴增產物的進行檢測。
[0062]在另一優選例中，所述的檢測包括探針雜交、測序、和/或電泳。
[0063]在另一優選例中，在所述下遊隔室Ri中也放置用於吸附擴增產物的固體顆粒。
[0064]在另一優選例中，所述的PCR模板材料包括:生物組織樣品、器官樣品、穿刺樣品、細胞樣品、核酸抽提物、血液、血清、體液、唾液、毛髮、糞便樣品、羊水樣品、尿液、分泌物(包括宮頸分泌物、陰道分泌物等)、培養液、食品樣品、疫苗、土壤樣品、水樣、空氣樣品。
[0065]在另一優選例中，所述的PCR模板材料源自人體、動物、植物、微生物，或源自人工合成的核酸。
[0066]在本發明的第四方面，提供了一種PCR擴增設備，所述的設備包括:
[0067]用於放置PCR反應管的反應孔，其中所述PCR反應管具有上遊隔室和下遊隔室，以及連接所述上遊隔室和下遊隔室的連接通道；
[0068]用於控制所述反應孔溫度的控溫裝置，從而使得反應管的隔室內能夠進行預定的PCR反應；和
[0069]用於控制攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從上遊隔室通過所述連接通道轉移至下遊隔室的控制裝置。
[0070]在另一優選例中，所述的PCR反應管是本發明第一方面中所述的多級PCR反應管。
[0071]在另一優選例中，所述的固體顆粒是磁性微球，而所述的控制裝置是磁鐵或電磁鐵。
[0072]在另一優選例中，所述的反應孔呈矩陣排列，所述矩陣為a×b矩陣，其中a為2-100的正整數，b為2-100的正整數。
[0073]應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0074]圖1顯示了現有技術中PCR反應管的示意圖。
[0075]圖2顯示了本發明一種多級PCR反應管(已加入液相PCR反應體系)的示意圖。
[0076]圖3顯示了本發明一種多級PCR反應管(未加入液相PCR反應體系)的示意圖。
[0077]圖4顯示了本發明另一種多級PCR反應管(三聯體)的示意圖。【具體實施方式】
[0078]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次開發了一種靈敏度高、特異性好、抗幹擾能力強的多級PCR反應管、設備、系統和方法。實驗表明，使用本發明的多級PCR反應管不僅可以使得檢測靈敏度達到1-2個拷貝，而且具備優異的抗汙染抗幹擾能力。此外，本發明的設備還可在封閉反應體系內實現PCR擴增產物的定量或半定量轉移。在此基礎上完成了本發明。
[0079]多級PCR反應管
[0080]如本文所用，術語「本發明反應管」、「多級PCR反應管」、「PCR多級反應管」、「多級PCR反應管」、「級聯PCR反應管」可互換使用，指具有至少二個相對獨立的、PCR反應隔室的PCR反應管，並且在所述PCR反應隔室之間設有允許攜帶PCR擴增產物的固體顆粒通過的轉移通道。
[0081]在本發明中，對於通過轉移通道進行連通的任何兩個PCR反應隔室，可將其中先進行PCR反應的反應隔室稱為「上遊隔室」、「上遊反應隔室」或「上遊PCR反應隔室」，而將另一 PCR反應隔室稱為「下遊隔室」、「下遊反應隔室」或「下遊PCR反應隔室」。
[0082]參見圖2和圖3。圖中示出的本發明多級PCR反應管包括二個可封閉的PCR反應腔或隔室(10) (compartment)。各隔室10設有腔蓋(20)。較佳地，所述腔蓋通過連接件
(22)與隔室本體連為一體。
[0083]此外，在兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用於讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒(50)從通過一個隔室(即上遊隔室)轉移至另一隔室(即下遊隔室)。
[0084]當所述隔室豎直放置時，所述的連接通道可以是水平的或傾斜的。通常，連接通道的傾斜角度(連接通道與水平線的夾角)為0-30度，較佳地為0-15度，更佳地為0-10度。
[0085]當連接通道呈現一定傾斜角度時，來自上遊隔室的、攜帶PCR擴增產物的固體顆粒可方便地藉助重力，從連接通道的入口端滾向或滑向連接通道的出口端，從而進入下遊隔室。
[0086]在本發明中，所述連接通道的內徑和長度沒有特別限制，只要能夠讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒通過即可。
[0087]典型地，連接通道的內徑為0.1-20臟，較佳地為0.2-10mm，更佳地為0.2_5mm。
[0088]典型地，連接通道的長度為0.1-1OOmm,較佳地0.2_50mm。
[0089]在本發明中，連接通道可以是已封閉的或可封閉的。例如，當多級PCR反應管的腔蓋與隔室腔體是分離式時，可將腔蓋製成一體式的上蓋，該上蓋不僅具有對應於隔室腔體的腔蓋，而且還具有對應於連接通道的密封蓋。這樣，當蓋上所述上蓋時，不僅封閉了各隔室，還封閉了相應的連接通道，從而形成封閉的反應空間。
[0090]在本發明中，一體式的上蓋特別適用於當隔室具有aXb矩陣結構的情況。
[0091]本發明多級PCR反應管的隔室大小沒有特別限制。通常，單個PCR隔室的容積約為10-10000微升，較佳地20-2000微升，更佳地30-1000微升，最佳地40-500微升。
[0092]本發明多級PCR反應管的 隔室形狀沒有特別限制，可以是圓柱形、圓錐形、或其他類似形狀。
[0093]本發明多級PCR反應管的材質沒有特別限制，可以是塑料、玻璃或可透過磁場的其他材料。優選塑料，例如聚丙烯塑料等。
[0094]攜帶PCR擴增產物的固體顆粒
[0095]在本發明中，在隔室中進行PCR反應之中或之後，形成的PCR擴增產物中的一部分會吸附或粘附於置於所述隔室的固體顆粒表面，從而形成攜帶PCR擴增產物的固體顆粒。當所述固體顆粒從上遊隔室轉移下遊隔室時，所攜帶的PCR擴增產物就可作為下遊隔室中的PCR模板。
[0096]在本發明中，固體顆粒的形狀沒有特別限制，可以是球形、卵圓形、圓柱形、錐形、立方形或其他形狀。固體顆粒可以是實心的、空心的、網格狀的或其他結構，只要該固體顆粒可以吸附或攜帶PCR擴增產物。
[0097]固體顆粒的材質沒有特別限制，然而優選的固體顆粒是磁性顆粒，如磁性微球。在本發明中，所述的磁性顆粒包括已具有磁性的顆粒以及在磁場作用下具有磁性的顆粒。
[0098]在另一優選例中，所述的磁性微球為核殼結構。
[0099]在另一優選例中，所述的磁性微球是表面未修飾的或表面修飾的、表面帶有塗層。
[0100]在本發明中，所述固體顆粒的大小沒有特別限制。通常，固體顆粒的平均粒徑為
0.01~IOmm,較佳地為0.最佳地為0.2_2mm。
[0101]所述固體顆粒的核酸吸附力受到顆粒表面積和表面性質等因素的影響。技術人員可以購得或用常規方法製備各種不同的能攜帶PCR擴增產物的固體顆粒。
[0102]一種優選的固體顆粒是表面親水性的或帶有羥基等親水性基團的顆粒。這樣，不僅能夠吸附核酸分子，還可在轉移時攜帶部分反應混合液，從而將一定量的PCR擴增產物轉移至下遊隔室。
[0103]當顆粒大小和材質確定後，通過常規方法，可以測定出每個固體顆粒所攜帶的PCR產物的數量。通常，每個顆粒可攜帶整個PCR反應體系中PCR擴增產物的約1/200-1/10，較佳地約1/100-1/15，更佳地1/50-1/20。按體積計，通常一個顆粒可攜帶0.1_2微升的反應液體，這取決於顆粒的大小以及表面特性。
[0104]取決於需要以及固體顆粒的大小，可以在上遊隔室中放置一個或多個固體顆粒。此外，可以在下遊隔室中放置或不放置一個或多個固體顆粒。
[0105]當一個隔室中有多個顆粒時，這些顆粒可以轉移至一個或多個下遊隔室。
[0106]多級PCR反應
[0107]在本發明中，對於通過轉移通道連通的上遊反應隔室和下遊PCR反應隔室而言，通常在所述上遊PCR反應隔室進行了 PCR反應(「第一級PCR反應」)之後或之中，置於反應體系中固體顆粒會吸附一部分擴增產物。將所述吸附有一部分PCR擴增產物的固體顆粒，通過所述轉移通道從上遊反應隔室轉移至下遊隔室，就可在下遊隔室內作為後續PCR反應的模板，從而進行下一級的PCR反應。
[0108]應理解，在本發明中，雖然會在至少兩個上遊PCR反應隔室進行PCR反應，然而，在某些PCR反應隔室也可不進行任何反應，或不進行PCR反應。例如，僅進行探針雜交、測序、電泳或其他檢測反應。
[0109]在本發明中，對於進行PCR反應所需的試劑沒有特別限制，可以採用本領域常規的各種不同的PCR反應所需的試劑。代表性的試劑包括(但並不限於):聚合酶；dNTP、緩衝液、鎂離子等。[0110]在另一優選例中，所述PCR引物的長度為12-100bp，較佳地15_50bp，更佳地18~30bpo
[0111]在另一優選例中，所述反應體系包括以下組分:10X擴增緩衝液、4種dNTP混合物、各類DNA聚合酶、Mg2+。
[0112]在另一優選例中，所述反應體系的各組分含量如下:10X擴增緩衝液5~20μ 1、4 種 dNTP 混合物 50 ~500 μ 1、PCR 引物 10 ~100 μ 1、模板 DNA0.1 ~2 μ g、Taq DNA 聚合酶 I ~5 μ 1、Mg2+0.5 ~3mmol/L、水 50 ~200 μ I。
[0113]在本發明中，各隔室內的PCR引物可相同或不同。例如，對於通過兩個連接通道連通的三個PCR反應隔室而言，第一 PCR引物對、第二 PCR引物對和第三PCR引物對分別位於不同的PCR隔室內。一種代表性的三級PCR反應管(三聯體)如圖4所示。
[0114]現結合圖2，描述本發明的代表性的多級PCR方法。該方法包括:
[0115]先在所述多級PCR反應管的PCR反應隔室中加入進行PCR反應所需的試劑，形成液相PCR反應體系31和32，並且在上遊隔室中加入PCR模板材料和用於吸附擴增產物的固體顆粒(如磁性顆粒)，但在下遊隔室中不加入PCR模板材料，並且兩個隔室內的液相PCR反應體系31和32互不連通且互不接觸；
[0116]封閉所述多級PCR反應管的上遊隔室和下遊隔室，構成一個封閉空間；
[0117]在上遊隔室Rl中進行PCR反應，形成第一 PCR擴增產物以及吸附有所述第一 PCR擴增產物的固體顆粒50 ；
[0118]抬升(如通過磁力或磁場)所述吸附PCR擴增產物的固體顆粒50，離開位於所述上遊隔室下方的液相PCR反應體系 後，進入所述連接通道的入口，經過連接通道，進入位於所述上遊隔室下遊的另一下遊隔室R2，作為所述下遊隔室中的PCR模板材料；
[0119]在所述下遊隔室R2中進行PCR反應，形成第二 PCR擴增產物；
[0120]如果需要，可重複上述步驟:將下遊隔室Ri (i為≤2的正整數)中形成的吸附有第i級PCR擴增產物的固體顆粒，通過另一連接通道轉移至次一級的下遊隔室Ri+1，並在所述下遊隔室Ri+1中進行PCR反應，從而形成第i+Ι級PCR擴增產物。
[0121]以檢測HPV為例，一種擴增HPV的基因組DNA以便用於鑑別人乳頭瘤病毒HPV型別的方法，包括步驟:
[0122](a)在封閉的第一級PCR反應腔或隔室中，以HPV基因組DNA為模板，通過HPV特異性的第一引物對進行擴增，從而獲得第一擴增產物Pi ；
[0123](b)將第一擴增產物從第一級PCR隔室轉移至第二級PCR隔室中，作為第二級PCR的模板，並在封閉的第二級PCR隔室中，通過HPV特異性的第二引物對進行擴增，從而獲得第二擴增產物P2 ；
[0124](c)任選地，將上一步驟的擴增產物Pi從第i級PCR隔室轉移至第i+Ι級PCR隔室中，作為第i+Ι級PCR的模板，並在封閉的第i+Ι級PCR隔室中，通過HPV特異性的第i +I引物對進行擴增，從而獲得第i+Ι擴增產物pi+1，其中i為> 2的正整數；本步驟可進行一次或多次；
[0125](d)對上一步驟中獲得的所述第二擴增產物P2或所述第i + I擴增產物Pi+1，進行測序，從而獲得HPV的序列；和
[0126](e)將測得的HPV序列與HPV標準序列進行比對，從而鑑別出HPV的型別。[0127]與現有技術的PCR反應管(圖1)相比，本發明的多級PCR反應管可在反應空間處於封閉的情況下，將第一次PCR反應產物吸附於固體顆粒(如磁性微球)，然後方便地將其從上遊隔室轉移至下遊隔室，從而在下遊隔室中將轉移的擴增產物作為模板進行第二次PCR,從而在保持高特異性的情況下，通過兩次或多次PCR反應顯著提高了檢測靈敏度。
[0128]另外，本發明的另一顯著特點是在兩次或多次PCR反應過程中，整個多級PCR反應管或各連通的多級組處於封閉狀態，故有效防止了環境以及操作過程中引入汙染源，也防止了對環境的汙染，因而不必需要潔淨程度極高的操作設備或操作室。
[0129]在本發明中，雖然整個多級PCR反應管或各連通的多級組處於封閉狀態，但仍可非常簡便地利用固體顆粒在將反應產物(如PCR擴增產物)從上遊隔室定量或半定量地轉移下遊隔室，從而在下遊進行下一級的PCR反應。核酸轉移量的大小，可通過調節固體顆粒的大小和數量來實現。
[0130]PCR擴增設備
[0131]本發明還提供了一種可用於本發明方法的PCR擴增設備。一種優選設備包括:
[0132]用於放置PCR反應管的反應孔，其中所述PCR反應管具有上遊隔室和下遊隔室，以及連接所述上遊隔室和下遊隔室的連接通道；
[0133]用於控制所述反應孔溫度的控溫裝置，從而使得反應管的隔室內能夠進行預定的PCR反應；和
[0134]用於控制攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從上遊隔室通過所述連接通道轉移至下遊隔室的控制裝置。
[0135]通常，所述的固體顆粒是磁性微球，而所述的控制裝置是磁鐵或電磁鐵。該磁體一般位於反應孔的上方，其磁場可以覆蓋反應孔區域的全部或部分，從而將磁性微球一次性或分批從上遊隔室轉移至下遊隔室。
[0136]在另一優選例中，所述的反應孔呈矩陣排列，所述矩陣為aXb矩陣，其中a為
2-100的正整數，b為2-100的正整數，以便與常規的96孔板等配合使用。
[0137]在另一優選例中，所述的設備還設有自動控制磁場的裝置，用於控制磁鐵的移動或控制電磁鐵的開啟/移動，從而實現磁性微球同步和自動可控轉移。
[0138]使用本發明的PCR擴增設備，可以實現大規模、高通量和自動化操作。
[0139]本發明的主要優點包括:
[0140](a) 靈敏度高；
[0141](b)特異性好；
[0142](c)抗幹擾能力強；
[0143](d)操作簡便。
[0144](e)可實現定量和半定量的轉移。
[0145](f)減少或消除對環境的汙染。
[0146]本發明的PCR反應管和系統，使極其靈敏、但卻又長期無法廣泛實際應用的多級PCR反應體系成為一項能在多種廣泛領域實際應用的常規技術。
[0147]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。[0148]實施例1
[0149]多級PCR反應
[0150]在本實施例中，採用圖2所示的二聯體多級PCR反應管，
[0151]引物如下:
[0152]MY09:5』 -CGTCCMARRGGAWACTGATC-3』 (SEQ ID N0.:1)
[0153]MYll:5，-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3』 (SEQ ID N0.:2)
[0154]GP5:5，-TTTGTTACTGTGGTAGATACYAC-3，(SEQ ID N0.:3)
[0155]GP6:5』 -GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3』 (SEQ ID N0.:4)
[0156]其中，在上遊隔室中的引物為MY09/MY11，下遊隔室中的引物為GP6/MY11或GP5/MY9。
[0157]將含HPV(人乳頭狀病毒 )的分泌物用常規方法抽提核酸後，經5倍或10倍系列稀釋後，製得HPV拷貝數約為1、2、5、10、25、50、100、200的樣品。將所述樣品作為模板加入上遊隔室。上遊隔室Rl中分別加入25微升的常規的PCR反應體系(其中包括DNA核酸模板、聚合酶、dNTP、引物、ddH20)和2個直徑約200nm的磁性微球(無修飾的鋼珠)。
[0158]先進行第一次PCR反應，預變性95°C，3分鐘，95°C，30S ;60°C退火30s，72°C延伸I分鐘，共30個循環。然後，75 °C再延伸10分鐘。
[0159]然後通過磁場，將2個磁性微球通過連接通道轉移到下遊隔室，進行第二次PCR反應。條件是95°C，30S ;60°C退火30s，72°C延伸I分鐘，共30個循環。
[0160]對下遊隔室R2中獲得的第二 PCR擴增產物通過測序進行檢測。然後將檢測結果與HPV的標準序列資料庫進行比較，從而得出HPV的存在與否和種類。
[0161]檢測結果表明，該方法可以檢測出微量(樣品中僅含5-10個拷貝)的HPV病毒。此外，不僅靈敏度顯著提高，而且假陰性和假陽性率都顯著低於常規PCR法(減少約10倍，即提高約I個數量級)或HC2方法(減少約50%)。
[0162]實施例2
[0163]多級PCR反應
[0164]重複實施例1，不同點在於:使用的多級PCR反應管包括2個多級組，各多級組分別具有2個相互連通的隔室。4個隔室呈矩形排列。這樣，可同時對兩個樣品進行多級PCR反應。
[0165]實施例3
[0166]多級PCR反應
[0167]重複實施例1，不同點在於:使用的多級PCR反應管包括48個多級組，各多級組分別具有2個相互連通的隔室；或使用的多級PCR反應管包括32個多級組，各多級組分別具有3個相互連通的隔室。
[0168]96個隔室呈現矩形排列，與常規的96孔板對應，該多級PCR反應管可放置於96孔板上。這樣，可同時對48個樣品進行二級的多級PCR反應；或可同時對32個樣品進行三級的多級PCR反應。
[0169]實施例4
[0170]三級的多級PCR反應
[0171]重複實施例1，不同點在於:下遊隔室R3中的引物為GP6/GP5。[0172]第一級PCR:同實施例1。
[0173]第二級PCR:同實施例1。
[0174]第三級PCR:將下遊隔室R2中的攜帶第二 PCR擴增產物的磁性顆粒轉移至下遊隔室R3，然後進行第三次PCR，從而獲得第三PCR擴增產物。
[0175]對下遊隔室R3中獲得的第三PCR擴增產物通過測序進行檢測。然後將檢測結果與HPV的標準序列資料庫進行比較，從而得出HPV的存在與否和種類。
[0176]檢測結果表明，該檢測結果可以檢測樣品中僅含1-2個拷貝的HPV病毒分子。此外，不僅靈敏度顯著提高，而且假陰性和假陽性率都顯著低於常規PCR法或HC2方法(減少約 50%)。
[0177]實施例5
[0178]HPV型別鑑定
[0179]5.1.宮頸表皮取樣:
[0180](1)臨床醫生在取檢測樣本時，用取樣刷，刮取病人樣本後，先插入一隻無菌的5ml取樣管內，取樣刷貼管壁輕旋半周，使得小部分病人樣本粘在取樣管內；
[0181](2)確保有足夠樣本進行多級PCR技術檢測HPV後，將取樣刷從5ml取樣管內抽出放入檢測保存液；
[0182](3)在步驟I的5ml取樣管內加入2ml95%乙醇，蓋上蓋子，上下振蕩取樣管數次，使得貼在管壁上的樣本保存在液體內；
[0183](4)將步驟3的取樣管上做好標記，使其與相應檢測實驗一一對應；
[0184](5)將步驟4的取樣管放4°C冰箱保存，待測。
[0185]5.2 多級 PCR
[0186](1)第一級 PCR
[0187]反應體系20 μ L，引物ΜΥ091 μ L，引物MYl 11 μ L，病人樣本DNAl μ L和水2 μ L，總計 25 μ L ;
[0188](2)第二級 PCR
[0189]反應體系20 μ L，引物GP61 μ L，引物MYlll μ L，通過磁珠轉移的第一 PCR產物(約
Iμ L) ,/JC 2 μ L, 25 μ L0
[0190](3)第三級 PCR
[0191]反應體系20 μ L，引物GP51 μ L，引物GP61 μ L，第二次PCR產物(約I μ L)，水2 μ L，總計25 μ L0
[0192]用2%的Agarose檢測第三次PCR反應的結果，陽性產物用於測序。
[0193]5.3用於樣本質量檢測的β血紅蛋白PCR
[0194]反應體系20 μ L，引物B 11 μ L，引物B21yL，病人樣本DNAl μ L，水2 μ L，總計25 μ L0
[0195]B1:5』 -ACACAACTGTGTTCACTAGC(SEQ ID N0.:5)
[0196]Β2:5』 -CAACTTCATCCACGTTCACC(SEQ ID N0.:6)
[0197]5.4 測序
[0198]水13.5 μ L，5倍反應緩衝液3.5 μ L，BigDyel.11 μ L，測序引物I μ，第二次PCR產物I μ L，在PCR儀上進行測序反應。PCR產物用Centr1-S印strip純化柱純化，純化後從PCR管內吸取10 μ L純化產物至測序板，測序引物可從最後一次PCR引物中選擇，上機器測序，然後對測序結果與HPV標準序列(可獲自已公開的公用資料庫)進行分析。所獲DNA序列以100%與基因庫中標準HPV基因型DNA相符作為HPV定型標準(即美國FDA有關HPV定型的最聞金標準)。
[0199]結果
[0200]本發明方法，對3320個檢測樣品的檢測結果表明:
[0201]1319個樣本是非HPV感染的，1352個樣本是高危型HPV感染，377個樣本是低危型HPV感染和272個樣本是混合感染。
[0202]表1 二種方法的結果比較
【權利要求】
1.一種多級PCR反應管，其特徵在於，所述反應管包括二個或多個可封閉的的PCR反應腔或隔室(10)，並且在至少兩個隔室之間設有封閉的或可封閉的連接通道(40)，所述連接通道用於讓攜帶PCR擴增產物的固體顆粒(50)從一個隔室(或上遊隔室)轉移至另一隔室(或下遊隔室)。
2.如權利要求1所述的PCR反應管，其特徵在於，所述的反應管包括η個隔室，其中η為2-5000的任一正整數。
3.如權利要求1所述的PCR反應管，其特徵在於，所述的反應管包括M個多級組，各多級組分別具有2、3、4或5個相互連通的隔室，其中M為1-1000的任一正整數。
4.如權利要求1所述的PCR反應管，其特徵在於，所述的PCR反應管的隔室呈直鏈構型、支鏈構型、或環形構型；和/或 所述的隔室呈矩陣排列，所述矩陣為aXb矩陣，其中a為2-100的正整數，b為2-100的正整數。
5.如權利要求1所述的PCR反應管，其特徵在於，所述的隔室具有腔蓋(20)，並且對於相互連通的多個隔室而言，當各自的腔蓋全部蓋上後，就構成一個封閉空間。
6.如權利要求1所述的PCR反應管，其特徵在於，所述連接通道位於反應腔或隔室上部。
7.如權利要求6所述的PCR反應管，其特徵在於，當所述上遊隔室蓋上腔蓋後，所述連接通道在上遊隔室的入口隔室上部，並且位於腔蓋下沿下方，從而使得攜帶PCR擴增產物的固體顆粒被抬升從而離開位於隔室下方的反應體系後，進入所述入口，經過連接通道，再通過所述連接通道在下遊隔室 的出口，進入下遊隔室。
8.一種進行多級PCR反應的系統，所述系統包括: 權利要求1所述的多級PCR反應管，以及 固體顆粒，所述固體顆粒位於所述多級PCR反應管的至少一個上遊隔室中，並且在所述上遊隔室內進行PCR反應時，所述固體顆粒能吸附在擴增過程中形成的擴增產物。
9.如權利要求8所述的系統，其特徵在於，所述的固體顆粒是磁性微球。
10.一種多級PCR反應方法，其特徵在於，所述方法包括步驟: (a)提供權利要求1所述的多級PCR反應管； (b)在所述多級PCR反應管的PCR反應隔室中加入進行PCR反應所需的試劑，形成液相PCR反應體系，並且在一個或多個上遊隔室中加入PCR模板材料和用於吸附擴增產物的固體顆粒，但在下遊隔室中不加入PCR模板材料，並且各隔室內的液相PCR反應體系互不連通且互不接觸； (c)封閉所述多級PCR反應管的上遊隔室和下遊隔室，從而對於相互連通的多個隔室而言，當各自的腔蓋全部蓋上後，構成一個封閉空間； (d)在上遊隔室Rl中進行PCR反應，形成第一PCR擴增產物以及吸附有所述第一 PCR擴增產物的固體顆粒； (e)抬升所述吸附PCR擴增產物的固體顆粒，離開位於所述上遊隔室下方的液相PCR反應體系後，進入所述連接通道的入口，經過連接通道，進入位於所述上遊隔室下遊的另一下遊隔室R2，作為所述下遊隔室中的 PCR模板材料；h (f)在所述下遊隔室R2中進行PCR反應，形成第二PCR擴增產物。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述的PCR反應包括高溫PCR、低溫PCR、雙引物PCR反應、多引物PCR反應、RT-PCR反應、DNA聚合酶PCR反應、RNA聚合酶PCR反應。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括: (g)當所述多級PCR反應管具有下遊隔室Ri時，其中i為≥2的正整數， 則在下遊隔室Ri中進行PCR反應，形成吸附有第i級PCR擴增產物的固體顆粒；和將所述吸附有第i級PCR擴增產物的固體顆粒通過另一連接通道轉移至次一級的下遊隔室R(i+1)，並在所述下遊隔室R(i+1)中進行PCR反應，從而形成第i+Ι級PCR擴增產物和任選的形成吸附有第i+Ι級PCR擴增產物的固體顆粒；和 (h)任選地重複步驟(g)一次或多次。
13.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述的PCR模板材料包括:生物組織樣品、器官樣品、穿刺樣品、細胞樣品、核酸抽提物、血液、血清、體液、唾液、毛髮、糞便樣品、羊水樣品、尿液、分泌物、培養液、食品樣品、疫苗、土壤樣品、水樣、空氣樣品。
14.一種PCR擴增設備，其特徵在於，所述的設備包括: 用於放置PCR反應管的反應孔，其中所述PCR反應管具有上遊隔室和下遊隔室，以及連接所述上遊隔室和下遊隔室的連接通道； 用於控制所述反應孔溫度的控溫裝置，從而使得反應管的隔室內能夠進行預定的PCR反應；和 用於控制攜帶PCR擴增產物的固體顆粒從上遊隔室通過所述連接通道轉移至下遊隔室的控制裝置。
15.如權利要求14所述的設備，其特徵在於，所述的固體顆粒包括磁性微球，而所述的控制裝置是磁鐵或電磁鐵。
16.如權利要求14所述的設備，其特徵在於，所述的反應孔呈矩陣排列，所述矩陣為aXb矩陣，其中a為2-100的正整數，b為2-100的正整數。
【文檔編號】C12M1/38GK103881902SQ201210564539
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2012年12月21日
【發明者】洪國藩 申請人:中國科學院上海生命科學研究院