蛋白質的製作方法

2023-05-29 15:19:41 2

專利名稱：蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的(變體)脂肪分解酶和一個或多個編碼一個或多個新脂肪分解酶的多核苷酸。本發明還涉及產生脂肪分解酶的方法及其應用。本發明還涉及改良食品的製備，尤其是改良烘焙產品的製備。具體地，本發明涉及脂肪分解酶，所述酶能夠賦予包括烘焙產品在內的食品產品改良的特徵。
背景技術：
在食品和/或飼料工業中使用的脂肪分解酶(E. C. 3. 1. 1. χ)的有益用途已知多年。例如，在EP 0 585 988中主張向生麵團中加入脂酶可改善保鮮效果，並且提出獲自少根根黴菌(Miizopus arrhizus)的脂酶在與起酥油/脂肪(shortening/fat)聯用時， 添加至生麵團時能夠改善所得麵包的質量。W094/04035中教導可通過在生麵團中添加脂酶但向所述生麵團添加任何脂肪或油即獲得改善的麵包柔軟性。Castello,P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki表明外源性脂酶可以改變麵包體積。小麥粉中脂酶作用的底物是1. 5-3%內源性小麥脂質，所述內源性小麥脂質是極性與非極性脂質的複雜混合物。極性脂質可分為糖脂和磷脂。這些脂質由兩個脂肪酸所酯化的甘油和極性基團構成。所述極性基團促成這些脂質的表面活性。對這些脂質中的脂肪酸之一的酶切導致表面活性高出很多的脂質。已知諸如DATEM的具有高表面活性的乳化劑在添加到生麵團中時產生顯著作用。脂肪分解酶可從存在於食品中的脂質水解一種或多種脂肪酸，這可以在食品中產生有效的乳化劑分子，從而提供具有商業價值的功能性。提供最顯著的乳化特性的分子是部分水解產物，諸如溶血磷脂(lyso-phospholipid)、溶血糖脂(lyso-glycolipid)和甘油單酯(mono-glyceride)分子。極性脂質水解產物，即溶血磷脂和溶血糖脂尤其有利。在製作麵包時，這種原位產生的乳化劑可起到與乳化劑Hf^BDATEM)等價的作用。但是，也發現脂肪分解酶的活性導致游離脂肪酸的蓄積，這會在食品中產生不良作用。脂肪分解酶的這一固有活性限制了其功能。對麵包體積的負面影響往往以劑量過大(overdosing)來解釋。劑量過大可導致麵筋彈力下降，這使生麵團過硬，並因此使麵包體積縮小。另外，或可選地，這些脂酶能降解添加到生麵團中的起酥油、油脂和乳脂，導致生麵團和烘焙產品有不良風味。劑量過大和不良風味歸因於麵團中游離脂肪酸(尤其是短鏈脂肪酸)的蓄積。原料或食品產品中高水平游離脂肪酸(FFA)的存在普遍被認為是質量缺陷，食品生產商和消費者往往在食品規範中規定了 FFA的最高水平。過量FFA水平所產生的作用會導致感官和/或功能上的缺陷。在W02005/087918中鑑定了來自鐮刀菌(Fusarium)物種，例如異孢鐮刀菌 (Fusarium heterosporum) CBS 782. 83的新型真菌脂肪分解酶，並且發現其在某些應用中其具有優越的性質。這些酶在漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)中表達並且顯示主要水解出生麵團中糖脂和磷脂sn-Ι位置的脂肪酸。一些真菌脂肪分解酶的問題是所述酶的表達可能受限並因此可能具有高生產成本。例如，適合工業規模活性的大量酶表達可能受到限制。工業上感興趣於發現表達增強的新脂肪分解酶，特別是這能夠在沒有功能性和/或活性受損的情況下實現時。發明概述已經意外地發現，與製備出本發明新變體脂肪分解酶的野生型酶相比，本發明新變體脂肪分解酶顯示了提高的表達。值得注意的是，所述提高的表達是在不損害酶功能性和/或活性和/或應用性的情況下實現的。此外，與野生型酶相比，新的變體脂肪分解酶還可以顯示改善的功能性和/或活性。本發明人已經發現，通過改變(取代或插入)位於脂肪分解酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環中的一個或多個表面胺基酸，以用(與原胺基酸相比)更親水的胺基酸代替所述表面胺基酸，或者引入親水胺基酸，或者引入糖基化位點，隨後，與野生型酶相比， 可顯著且驚人地提高所述變體酶的表達和/或功能性和/或活性。優選地，為了引入一個或多個糖基化位點，用Asn、Ser和/或Thr (或其組合)代替所述表面胺基酸。可選地，或者此外，可以通過插入選自Asn、Ser和/或Thr的一個或多個胺基酸修飾活性位點遠側的外環，以引入一個或多個糖基化位點。脂肪分解酶通常在脂肪和水之間(即親水環境和疏水環境之間)的界面起作用，因此，脂肪分解酶在某些應用中的性能非常依賴於該界面以及水活性。不希望受理論約束，通過在遠離酶活性位點的位置(即酶活性位點遠側的環中) 改變脂肪分解酶表面的親水性，可控制酶在脂肪/水界面內的朝向，從而使所述活性位點朝向酶的底物，即脂肪。因此，可修飾脂肪分解酶以優化酶在界面內的朝向，從而提高酶活性。此外，或者可選擇地，通過引入糖基化位點可增強酶的摺疊以及從宿主生物的表達和/ 或分泌，由此增強變體酶的表達。此外或者可選地，本發明人還發現了驚人地顯著提高脂肪分解酶的表達和/或功能和/或活性的多種特異修飾。這些可包括加入糖基化位點和/或穩定酶的C-末端區域。 在一些實施方式中，特異的修飾提高了表達，但不損害脂肪分解酶的功能性和/或活性。因此，與野生型(KLMl)酶相比，一些所述特異修飾提高了表達，而不損害變體酶的應用性能， 所述野生型(KLMl)酶的前原序列(propresequence)在本文中示為SEQ ID No. 2 (其成熟形式為SEQ ID No. 2的胺基酸31-305)。因此，一方面，本發明提供了製備變體脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達核苷酸序列，所述核苷酸序列與編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90%的同一性，或者通過一個或數個核酸的添加、刪除或取代而不同於編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列，並且在對應於所編碼的胺基酸序列中的位置包含至少一個以下修飾a)與原真菌月旨肪分解酶相比，在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點(或一個額外的糖基化位點)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個胺基酸，所述胺基酸更加親水(與原胺基酸相比)；或c)在33、63、78、190、 305,306或320位中的一個或多個位置的取代或插入或者在311-312或307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各胺基酸位置均對應於與SEQ ID No. 2比對時所述胺基酸序列的位置；其中當所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90%的同一性或者通過一個或數個核酸的添加、刪除或取代而不同於編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列時，所述修飾不是在63位的取代並且所述刪除不在311-312位(其中比對時所述胺基酸位置編號為SEQ ID No. 2所示)。所述方法可以通過在多肽的表面位置取代或插入一個或多個胺基酸而在所述表面位置引入至少一個胺基酸，其中所述取代或插入時用(與原胺基酸相比)更親水的胺基酸。在另一個實施方式中，本發明提供了產生變體脂肪分解酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID No. 1具有至少90%的同一性，或者通過一個或數個核酸的添加、刪除或取代而不同於SEQ ID No. 1，並且在對應於所編碼胺基酸序列中的位置包含至少一個以下修飾a)在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個親水胺基酸；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個或多個位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各胺基酸位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。本發明還提供了產生脂肪分解酶的方法，所述方法包括在宿主生物中表達包含 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列；或者與其具有至少98% (優選至少99%，合適地為至少99. 5%，如至少99. 8% )同一性的核苷酸序列；或者通過一個或數個核苷酸的添加、刪除或取代而不同於SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No.沈的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼簡併性而與SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列相關。本發明還提供了製備脂肪分解酶的方法，所述方法包括用編碼對極性脂質內的酯鍵具有水解活性的多肽的重組核酸轉化宿主細胞，其中所述核酸包括含SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或 SEQID No.洸的核苷酸序列；或者與 SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18、 SEQ ID No. 20或SEQ ID No.沈具有至少98% (優選至少99%，合適地為至少99. 5%，如至少99. 8% )同一性的核苷酸序列；或者通過一個或數個核苷酸的添加、刪除或取代而不同於 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20或SEQ ID No.洸的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼簡併性而與 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 26 的核苷酸序列相關，所述宿主細胞能夠表達編碼所述多肽的核苷酸序列；在表達所述核酸的條件下培養所轉化的宿主細胞並收集所述脂肪分解酶。本發明提供了本發明核酸的增化表達，並因此提供了變體多肽的改良生產方法。在進一步的方面，本發明提供了通過本發明方法獲得的多肽(前原多肽或成熟的脂肪分解酶)。
在再進一步的方面，本發明提供了包含編碼脂肪分解酶的核苷酸序列的核酸，並且所述核苷酸序列在對應於所編碼胺基酸序列中的位置包含至少一個以下修飾a)在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個親水胺基酸的；或c)在33、63、78、 190,305,306或320位中的一個或多個位置的取代或插入或者在311-312或307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各胺基酸位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置， 其中當所述核苷酸序列編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列時，所述修飾不是在63位的取代，並且所述刪除不在311-312位(其中比對時胺基酸位置編號為SEQ ID No. 2所示)。在另一方面，本發明提供了包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列與SEQ ID No. 1具有至少90%的同一性，或者通過一個或數個核苷酸的添加、刪除或取代而不同於 SEQ ID No. 1，並且在對應於所編碼的胺基酸序列中的位置包含至少一個以下修飾a)在所述胺基酸序列中至少一個糖基化位點的引入；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側的外環內的位置的至少一個親水胺基酸的引入；或c)在 33、63、78、190、305、306或320位中的一個或多個位置的取代或插入，或者在311-312或 307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各胺基酸位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。本發明進一步提供了編碼對極性脂質內的酯鍵具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或 SEQID No. 26 的核苷酸序列；或者與 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或 SEQID No. 26 具有至少 98% (優選至少99%，合適地為至少99.5%，如至少99.8% )同一性的核苷酸序列；或者通過一個或數個核苷酸的添加、刪除或取代而不同於SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、 SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或SEQ ID No.沈的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼簡併性而與SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18、 SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列相關。在一個實施方式中，所述優選的核苷酸序列為SEQ ID No. 8 (突變體5)所示的核苷酸序列，或者通過遺傳密碼的簡併性而與SEQ ID No. 8相關的核苷酸序列。在再一方面，本發明提供了由本發明核酸或核苷酸序列編碼的變體多肽。本發明另一方面提供了變體多肽，所述變體多肽對極性脂質中的酯鍵具有水解活性，並且包含與SEQ ID No. 2的胺基酸33-296具有至少90%同一性，或者通過一個或數個胺基酸的添加、刪除或取代而不同於SEQ ID No. 2的胺基酸33-296的胺基酸序列，並且與 SEQ ID No. 2中所示的序列相比所述變體多肽已被修飾從而a)在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個親水胺基酸；或c)在33、63、78或190位中的至少一個或多個位置取代或插入胺基酸，其中各胺基酸位置均對應於SEQ ID No. 2中所示胺基酸序列的位置。
另一方面，本發明提供了對極性脂質中的酯鍵具有水解活性，並且包含SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25的胺基酸33-296 (或胺基酸31-30 所示胺基酸序列的多肽。再一方面，本發明提供了前原多肽，當在宿主生物中進行翻譯後加工時其產生了對極性脂質中的酯鍵具有水解活性的多肽，其中所述前原多肽包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25所示的胺基酸序列。一方面，本發明還提供了對極性脂質中的酯鍵具有水解活性的多肽，所述多肽可得自於包含 SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21 或 SEQ ID No. 25 所示胺基酸序列的前原多肽。根據宿主生物，前原序列常常經歷翻譯後修飾。對於本發明的酶，所述生物較常除去前原序列的 N-末端區，即除去 SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、 SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 15,SEQ ID No. 17,SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 21 或SEQ ID No. 25 的胺基酸1-30的所有或部分。在一些實施方式中，所述宿主生物可以除去比SEQ ID No. 9、 SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、 SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25的胺基酸1_30所示的那些略多的胺基酸， 例如除去胺基酸1-31、1-32或1-33。在一些情況下，所述宿主細胞可以引入可選的N-末端序列，所述序列可涵蓋胺基酸1-30所示胺基酸的所有或部分或者可以包含完全不同的 N-末端序列(例如EAEA或EA)。在一些情況下，通過宿主生物由前原序列產生的成熟酶在其N-末端可以為異基因(heterogen)。在一些實施方式中，所述翻譯後修飾可以表示在前原序列的C-末端區中的修飾。例如，在成熟形式中，可以從SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No.21或SEQ ID No. 25除去胺基酸306-348的所有或部分。在一些實施方式中，宿主生物可以除去比 SEQ ID No. 9,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. IUSEQ ID No. 13,SEQ ID No. 15,SEQ ID No. 17,SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 21 或 SEQ ID No. 25 的胺基酸 306-348 所示的那些略多的胺基酸，例如除去胺基酸305-348或304-348或303-348。在一些情況下， 通過宿主生物由前原序列產生的成熟酶在其C-末端可以為異基因。認為本發明包括可以從前原多肽獲得的所有成熟形式的蛋白，所述前原多肽包含SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25所示的胺基酸序列，尤其是從宿主生物裡氏木黴(Trichoderma reesei)獲得的那些。本發明還提供了本發明核酸增強脂肪分解酶從宿主生物的表達的用途。合適地， 宿主生物可以為真菌，優選木黴(Trichoderma)，優選裡氏木黴。合適地，與野生型核酸(即沒有任何本發明修飾的核酸)相比，所述表達增強約2倍至約25倍。本發明進一步提供了製備食品的方法，所述方法包括向所述食品的一個或多個成分加入本發明的多肽。再一方面，本發明提供了製備烘焙產品的方法，所述方法包括向生麵團中加入本發明的多肽並烘焙所述生麵團以製備烘焙產品。本發明進一步提供了製備溶血磷脂的方法，所述方法包括用本發明的多肽處理磷脂以產生溶血磷脂。在再一實施方式中，本發明提供了製備溶血糖脂的方法，所述方法包括用本發明的多肽處理糖脂以產生溶血糖脂。本發明進一步提供了植物油或食用油的酶促脫膠方法，所述方法包括用本發明的多肽處理食用油或植物油以水解其中存在的大部分極性脂質。再一方面，本發明提供了通過本發明的方法獲得的食品或烘焙產品。本發明的各方面描述在權利要求書和以下評述中。可用於本發明核苷酸序列的其它方面包括包含本發明的序列的構建體；包含用於本發明的序列的載體；包含用於本發明的序列的質粒；包含用於本發明的序列的轉化細胞；包含用於本發明的序列的轉化組織；包含用於本發明的序列的轉化器官；包含用於本發明的序列的轉化宿主；包含用於本發明的序列的轉化生物。本發明還包括表達用於本發明的核苷酸序列的方法，所述方法利用所述核苷酸序列，例如在宿主細胞中的表達；包括用於轉移所述核苷酸序列的方法。本發明還包括分離(例如從宿主細胞中分離)所述核苷酸序列的方法。涉及用於本發明胺基酸序列的其它方面包括編碼用於本發明的胺基酸序列的構建體；編碼用於本發明的胺基酸序列的載體；編碼用於本發明的胺基酸序列的質粒；表達用於本發明的胺基酸序列的轉化細胞；表達用於本發明的胺基酸序列的轉化組織；表達用於本發明的胺基酸序列的轉化器官；表達用於本發明的胺基酸序列的轉化宿主；表達用於本發明的胺基酸序列的轉化生物。本發明還包括純化用於本發明的胺基酸序列的方法，所述方法利用所述胺基酸序列，例如在宿主細胞中的表達；包括轉移所述胺基酸序列的方法， 然後純化所述序列。為了便於參考，本發明的這些和進一步的方面在以下適當分標題下進行討論。然而，各部分的教導並不必然局限於各具體的部分。發明詳述對本文所用胺基酸位置的所有引用都通過參考胺基酸序列SEQ ID No. 2而進行。 換句話說，當考慮胺基酸位置編號時，通過與SEQ ID No. 2的胺基酸序列比對，並且通過參考利用SEQ ID No. 2作為參考序列的比對序列的位置編號可以確定胺基酸位置編號(參見，例如顯示SEQ ID No. 2(在圖22中稱為KLM1)與本文教導的其它序列的比對的圖22)。合適地，本發明使用的宿主生物可以為真菌，優選來自木黴屬，更優選來自裡氏木黴種。在一個實施方式中，在修飾前所述真菌脂肪分解酶不包含任何糖基化位點。換句話說，本發明的方法可以用於向原始或天然不包含任何糖基化位點的脂肪分解酶中引入至少一個糖基化位點。合適地，本發明的變體多肽可以包含至少兩個，合適地為至少三個糖基化位點。優選地，本發明的核苷酸序列或者在本發明的方法中使用的核苷酸序列分別與 SEQ ID No. 1或與SEQ ID No. 24，或者與SEQ ID No. 24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者與SEQ ID No. 24的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID No. 24的第113-9 位中所示的核苷酸序列相比具有至少90%同一性(優選至少95%，更優選至少98%，合適的為至少99%，例如至少99. 5%同一性)，但與SEQ ID No. 1或與SEQ ID No. 24,或者與SEQ ID No. 24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者與SEQ ID No. 24的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID No. 24的第113-9 位中所示的核苷酸序列分別相比包含至少一個修飾，或者具有與上述任一序列的區別在於一個或數個核苷酸的添加、刪除或取代的核苷酸序列。在一個實施方式中，當所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90%同一性，或者所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列區別於一個或數個核苷酸的添加、刪除或取代時，所述修飾不是在第63位的取代(例如其不是取代K63N)，並且所述刪除不在第311-312位。編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23中所示的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列在本文中如SEQ ID No 24或其部分(例如SEQ ID No. 24的第23-106位中所示的核苷酸序列；或者SEQ ID No. M的第113-1063位中所示的核苷酸序列，或者SEQ ID No. 24的第113-9 位中所示的核苷酸序列)所示。在一個實施方式中，優選本發明的修飾對應於在多肽表面位置和所述酶活性位點的遠側外環中的位置引入至少一個糖基化位點。優選地，所述核苷酸序列經修飾，從而使位於所述多肽的表面位置和所述酶活性位點的遠側外環中的位置的一個或多個胺基酸被比原胺基酸更親水的胺基酸取代。可選地，所述核苷酸序列可以被修飾，從而使一個或多個親水胺基酸插入到所述多肽的表面位置和所述酶活性位點的遠側外環中的位置。在一個優選的實施方式中，所述核苷酸經修飾，從而在所編碼的胺基酸中取代或插入一個或多個胺基酸以產生一個或多個共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中)(xx 可為除Pro外的任何胺基酸。在一個實施方式中，修飾核苷酸序列，從而在所編碼的胺基酸序列中引入一個或多個Asn、Ser或Thr。換句話說，本發明的核苷酸序列包含對應於向所編碼的蛋白中引入一個或多個Asn、Ser或Ilir的修飾。合適地，在本發明的方法或核酸中，可以引入至少兩個，合適地為至少三個糖基化位點。本發明的核苷酸序列和本發明方法中的核苷酸序列可以進一步修飾，以與原脂肪分解酶相比，例如與包含SEQ ID No. 2或其胺基酸33-296(或31-305)的脂肪分解酶相比， 強化蛋白的C-末端加工。合適地，所述核苷酸序列或多肽可以包含C-末端加工，優選地以使所述多肽更穩定。在本申請中，認為所述多肽的C-末端是自第306位胺基酸之前，其中所述位置對應於比對時SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。合適地，如本發明所教導地，所述C-末端加工包含以下一個或多個在第306或 320位的取代或插入，或者在C-末端中的一個或多個KEX2位置的刪除，其中各個位置對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。合適地，所述C-末端加工可以包含至少一個C-末端KEX2位點的去除。不希望受理論限制，KEX2位點的去除引起蛋白水解加工的停止或蛋白水解加工速率的降低以及改良蛋白的穩定性而不使其活性受損。一個KEX2位點可見於第 306位(與SEQ ID No. 2比對時)。另一個KEX2位點可見於第311-312位(當與SEQ ID No. 2比對時)。優選地，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列被修飾，從而在第33、 63,78,190和305位中的一個或多個位置具有取代，其中所述胺基酸被N取代。合適地，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第63、78、190和305位中的一個或多個位置具有取代，其中所述胺基酸被N取代。在一個實施方式中，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第190、191和192位引入糖基化位點(從而使所述糖基化位點包含共有序列 Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何胺基酸)。在另一個實施方式中，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第33、34和35位引入糖基化位點(從而使所述糖基化位點包含共有序列 Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何胺基酸)。在另一個實施方式中，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第63、64和65位引入糖基化位點(從而使所述糖基化位點包含共有序列 Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何胺基酸)。在另一個實施方式中，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的用途的核苷酸序列可以被修飾，從而在第78、79和80位引入糖基化位點(從而使所述糖基化位點包含共有序列Asn-Xxx-Ser或者Asn-Xxx-Thr，其中Xxx為除Pro外的任何胺基酸)。所述糖基化位點可以通過單個胺基酸的修飾(例如插入或取代)而引入。可選地， 為了引入糖基化位點，可以對多於一個胺基酸(例如2個或3個胺基酸)進行修飾(例如插入或取代)。合適地，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第190位具有取代，其中所述胺基酸被N取代。在一個實施方式中，優選地，本發明的核苷酸序列包含本文SEQ ID No. 8所示核苷酸序列的全部序列或部分(或者通過遺傳密碼的簡併性與SEQ ID No. 8相關的核苷酸序列)。本發明還進一步提供了由該核苷酸序列編碼的多肽。在一個實施方式中，本發明的變體多肽或用於本發明的變體多肽包含SEQ ID No. 9的胺基酸33-296(或31-304或31-30 中所示的胺基酸序列。合適地，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第306位具有取代，其中所述胺基酸被除K或R或A以外的任意胺基酸取代，優選所述306 位的取代是被胺基酸S取代。合適地，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而在第320位具有取代，其中所述胺基酸被除T以外的任意胺基酸取代，優選所述320位的取代是被胺基酸E取代。本發明的變體多肽，無論是由本發明的核酸編碼的變體多肽，還是通過本發明的方法產生的變體多肽，優選具有磷脂酶活性或者半乳糖酯酶活性。在一些實施方式中，優選對變體多肽或其編碼核酸進行的修飾是在變體多肽上加入至少一個糖基化位點(或者多個糖基化位點)和/或涉及C-末端加工以穩定所述變體多肽C-末端的修飾。合適地，所述多肽在第33、63、78、190位，合適地在第63、78或190位的一個或多個位置包含取代。合適地，可以使用N進行所述取代。在一個實施方式中，本發明的變體多肽可以在第306位包含至少一個取代。優選地，使用除K或R之外的任何胺基酸進行第306位的取代。優選地，使用除K或R或A之外的任何胺基酸進行第306位的取代。在一個實施方式中，優選地使用不帶電荷和/或親水性胺基酸進行第306位的取代。合適地，可以使用胺基酸S進行第306位的取代。在一個實施方式中，本發明的核苷酸序列或者用於本發明的核苷酸序列可以被修飾，從而使所編碼胺基酸序列中的以下位置得到修飾R306S+G33N ；R306S+K63N ；R306S+G78N ；R306S+A190N ；R306S+K63N+G78N+A190N ；R306S+AKR311-312 ；R306S+K63N+G78N+A190N+Δ 311-312 ；R306S+K63N+G78N+A190N+Δ 307-319 ；R306S + Κ63Ν + G78N+A190N + Δ307-319 + Τ320Ε;或者R306S + Κ63Ν + G78N + A190N + Δ307-319 + R305N本領域技術人員將容易地預測，當骨架不是KLMlwt (如本文SEQ ID No. 2所示) 時，儘管可選骨架中的起始胺基酸不同，表中所示胺基酸在與SEQ ID No. 2比對時位於相同的位置。為了避免爭議，本文中使用的符號「 Δ 」表示該符號後所列的那些胺基酸的刪除。在一些實施方式中，在所述多肽的表面位置或者所述酶活性位點(催化三聯體) 的遠側外環內的位置引入至少一個胺基酸(其與原胺基酸相比更親水)優選是在所述多肽的表面位置或者所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個糖基化位點(或者一個額外的糖基化位點)的。換句話說，加入糖基化位點使所述酶在已經加入的糖基化位點區域內更親水。另一方面，本發明提供了本發明的變體多肽酶在製造食品，例如生麵團、烘焙產品、蛋、基於蛋的產品、麵條產品、奶酪產品、玉米餅產品、動物飼料產品、植物油或食用油中的應用。有利地，向所述食品中加入本發明的酶可以產生改良的乳化性，並且游離脂肪酸的聚集降低。另一方面，本發明提供了本發明的變體多肽在製造生麵團和/或烘焙產品中的用途，包括向生麵團加入所述脂肪分解酶，和(任選地)烘焙所述生麵團以製備烘焙產品，用於下述中的一個或多個降低生麵團粘性；改善生麵團的加工性；降低烘焙產品在烘焙中的起泡；改善麵包體積和/或鬆軟度；延長烘焙產品和/或生麵團的壽命；改善烘焙產品和 /或生麵團的保鮮作用；改善烘焙產品的碎屑結構；降低烘焙產品的孔異質性；改善烘焙產品的孔均質性；降低烘焙產品的平均孔徑；改良烘焙產品的味道和/或香味，改善烘焙產品的外皮顏色。
另一方面，本發明提供了本發明的變體多肽在製造基於蛋的產品中的用途，用以改善結構、降低平均粒徑、降低平均顆粒分布、改善熱穩定性、改善微波性能和/或穩定性。在本發明的另一個方面，提供了處理蛋或基於蛋的產品的方法，所述方法包括向所述蛋或基於蛋的產品中加入本發明的變體多肽酶。在本發明的另一個方面，提供了製備麵條或者生面片或者基於麵條的產品的方法，其中所述方法包括向所述麵條或者生面片或者基於麵條的產品中加入本發明的變體多肽酶。在本發明的一個方面，提供了本發明的變體多肽酶在製造麵條或基於麵條的產品中的用途，用於下述中的一個或多個改善顏色/黃色、穩定顏色性質、降低亮度、降低脂肪含量、改善結構和口感(bite)(咀嚼性)、降低水活性、降低斷裂、提高中心硬度和改善在加工中的形狀保持度。在本發明的另一方面，提供了製備玉米餅或玉米餅片的方法，所述方法包括向玉米餅或玉米餅片中加入本發明的變體多肽酶。本發明的另一方面提供了本發明的變體多肽酶在製造玉米餅或生玉米餅片的用途，用以改善玉米餅的可軋制性、提高玉米餅的柔韌性、改善玉米餅和/或生玉米餅片的保鮮作用、改善玉米餅和/或生玉米餅片中的柔軟性和/或降低異味。可以通過與乳化劑(例如DATEM)組合來改善玉米餅和/或麵條中脂肪分解酶的功能性。在本發明的另一個方面，提供了處理乳(milk)、奶酪用乳、奶酪或基於奶酪的產品的方法，所述方法包括向所述奶酪或基於奶酪的產品中加入本發明的變體多肽酶。本發明再進一步提供了本發明的變體多肽酶在製造奶酪或基於奶酪的產品中的用途，用以改善味道、結構和/或穩定性，降低奶酪中的溢油作用(oiling-off effect)和 /或提高奶酪生產中的奶酪產率。在本發明的另一方面，提供了處理動物飼料的方法，所述方法包括向所述動物飼料中加入本發明的變體多肽酶。本發明進一步提供了本發明的變體多肽酶在製造動物飼料中的用途，用以增強以下一個或多個飼料利用性和/或轉換效率、體重增重、消化性氮攝取、乾物質的可代謝性和可口性。在本發明的進一步的方面，提供了本發明的變體多肽酶在製備溶血磷脂的方法中的用途，例如通過用所述酶處理磷脂(如卵磷脂)以產生部分水解產物，即溶血磷脂。在本發明的另一方面，提供了製備溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的方法，所述方法包括用本發明的變體多肽酶處理磷脂(如卵磷脂)。在本發明的另一方面，提供了本發明的變體多肽酶在製備溶血糖脂(例如雙半乳糖基甘油單酯(DGMG)或單半乳糖基甘油單酯(MGMG))的方法中的用途，其中通過利用本發明的脂肪分解酶處理糖脂(例如雙半乳糖基甘油二酯(DGDG)或單半乳糖基甘油二酯 (MGDG))以產生部分水解產物，即溶血糖脂。在另一方面，本發明提供了製備溶血糖脂(例如雙半乳糖基甘油單酯(DGMG)或單半乳糖基甘油單酯(MGMG))的方法，所述方法包括利用本發明的變體多肽酶處理糖脂(例如雙半乳糖基甘油二酯(DGDG)或單半乳糖基甘油二酯(MGDG))。
本發明還提供了植物油或食用油的酶促脫膠方法，所述方法包括用本發明的變體多肽酶處理食用油或植物油以水解大部分的極性脂質(例如磷脂和/或糖脂)。為了避免疑問，本領域技術人員可知曉適合進行食用油的酶促脫膠的方法(例如參見EP 0 869 167)。在實施本發明時，可以合適地使用已知方法，前提是用本發明的酶代替已知酶。在本發明的另一方面提供了本發明的變體多肽酶在植物油或食用油的製造中的用途，用以降低植物油或食用油中磷脂的量同時保持油中甘油三酯的含量和/或防止或降低游離脂肪酸的蓄積。在另一方面，本發明提供了本發明的變體多肽酶在包括處理磷脂以水解脂肪醯基基團的方法中的應用。在另一方面，本發明提供了本發明的變體多肽酶在用以降低食用油中的磷脂含量的方法中的應用，所述方法包括用本發明的真菌脂肪分解酶處理所述油以水解大部分的磷月旨，和從所述油分離含水解磷脂的水相。優選地，本發明的變體脂肪分解酶水解極性脂質(例如糖脂和/或磷脂)。換句話說，本發明的變體脂肪分解酶優選具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E. C. 3. 1. 1. 4)活性和/ 或磷脂酶Al (E. C. 3. 1. 1. 32)活性)和/或半乳糖脂酶或糖脂酶(E. C. 3. 1. 1. 26)活性。本發明的變體脂肪分解酶可以額外地水解甘油三酯。換句話說，本發明的變體脂肪分解酶可以額外的具有甘油三酯脂酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)。本文使用的術語「糖脂酶活性，，包括「半乳糖脂酶活性」。術語糖脂和半乳糖脂可以在本文中交互使用，並且包括水解D⑶G和MGDG，其分別被水解成DGMG或MGMG。本文使用的術語「極性脂質」表示磷脂和/或糖脂。優選地，本文使用的術語「極性脂質」表示磷脂和糖脂兩者。合適地，本發明的變體脂肪分解酶可以具有磷脂酶活性(例如磷脂酶A2(E. C. 3. 1. 1. 4)活性和/或磷脂酶Al (E. C. 3. 1. 1. 32)活性)和/或半乳糖脂酶或糖脂酶 (E. C. 3. 1. 1. 26)活性。利用下文描述的試驗可以測定酶的糖脂酶活性、磷脂酶活性和/或甘油三酯脂酶活性。半乳糖脂酶活性的測定(糖脂酶活性試驗)底物將0.6% 雙半乳糖基甘油二酯(Sigma D 4651) ,0. 4 % Triton-X 100 (Sigma X-100)和 5mM CaCl2 溶解在 0. 05M HEPES 緩衝液(pH 7)中。試驗過程將400 μ 1底物加入到1. 5ml Eppendorf試管中，並在37°C的Eppendorf熱混合儀中放置5分鐘。在時間T = O分鐘時，加入50μ1酶溶液。同時對以水替代酶的空白進行分析。使樣品在37°C的Eppendorf熱混合儀中以10*100rpm混合10分鐘。在時間T = 10 分鐘時，將所述Eppendorf試管在另一個99°C的熱混合儀中放置10分鐘以終止反應。利用來自WAKO GmbH的NEFA C試劑盒分析樣品中的游離脂肪酸。以在試驗條件下每分鐘產生脂肪酸的微摩爾數計算酶活性GLU (pH 7)。磷脂酶活性的測定(磷脂酶活性試驗)
利用兩種不同的方法測定磷脂酶活性，其結果相當。這兩個方法中的任一個都可以用以測定本發明的磷脂酶活性。優選地，使用PLU測定任意酶的磷脂酶活性。測定磷脂酶活性的「PLU試驗」底物將0.6 % L-α 磷月旨醯膽鹼 95 % Plant (Avanti#441601)、0. 4 % Triton-X 100 (Sigma X-100)和 5mM CaCl2 溶解在 0. 05M HEPES 緩衝液(pH = 7)中。試驗過程將400 μ 1底物加入到1. 5ml Eppendorf試管中，並在37°C的Eppendorf熱混合儀中放置5分鐘。在時間T = O分鐘時，加入50μ1酶溶液。同時對以水替代酶的空白進行分析。使樣品在37°C的Eppendorf熱混合儀中以10*100rpm混合10分鐘。在時間T = 10 分鐘時，將所述Eppendorf試管在另一個99°C的熱混合儀中放置10分鐘以終止反應。 利用來自WAKO GmbH的NEFA C試劑盒分析樣品中的游離脂肪酸。以在試驗條件下每分鐘產生脂肪酸的微摩爾數計算酶活性PLU-7 (pH 7)。測定磷脂酶活性的「TIPU試驗」ITIPU (滴定磷脂酶單位)定義為在試驗條件下每分鐘釋放1 μ mol游離脂肪酸的酶量。磷脂酶Al和A2催化卵磷脂至溶血卵磷脂的轉化，並分別從第1和2位釋放游離脂肪酸。可通過連續滴定在酶作用過程中從卵磷脂釋放的脂肪酸而測定磷脂酶活性，因為鹼的消耗量等於脂肪酸的釋放量。底物在磁性攪拌下將4%卵磷脂、4% Triton-X 100和6mM CaCl2 :12g卵磷脂粉 (Avanti Polar Lipids#44160)和 12g Triton-X 100 (Merck 108643)分散在約 200ml 去礦物質水中。加入3. Oml 0. 6M CaCl2 (p. a. Merck 1.02382)。用去礦物質水將體積調整至 300mL並利用Ultra Thurax對乳液進行勻質化。每天製備新鮮底物。試驗條件製備酶溶液，從而在加入300 μ 1酶時在滴定曲線上產生0. 06和0. 18ml/分鐘之間的斜率。包括活性已知的對照樣品。樣品溶解在去礦物質水中並以300rpm攪拌15分鐘。在用0. 05M NaOH調整pH至7.0之前，將25. OOml底物在37 °C恆溫10-15分鐘。 將300 μ L酶溶液加入至底物，並使用恆定pH滴定儀(Phm 290, MettlerToledo)進行使用 0.05M NaOH的連續滴定。在每個比例(scaling)進行兩個活性測定。8分鐘後終止滴定，並計算5-7分鐘之間滴定曲線的斜率。檢測極限為3TIPU/ml 酶溶液。計算按照以下方式計算磷脂酶活性(TIPU/g酶):
權利要求
1.製備變體脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達核苷酸序列，所述核苷酸序列與編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90%的同一性並且在對應於所編碼胺基酸序列中的位置包含至少一個以下修飾a)與原真菌脂肪分解酶相比在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點(或一個額外的糖基化位點)；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個胺基酸，所述胺基酸更親水(與原胺基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個或多個位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各胺基酸位置均對應於當與SEQ ID No. 2比對時所述胺基酸序列的位置；其中當所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90% 的同一性時，所述修飾不是在63位的取代並且所述刪除不在311-312位。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述真菌脂肪分解酶在修飾前不包含任何糖基化位點。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述核苷酸序列與SEQID No.l，與SEQ ID No. 24，或與SEQ ID No. 24的23-106位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 24的113-1063 位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 24的113-9 位所示的核苷酸序列具有至少90%同一性。
4.產生脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達包含SEQID No. 8,SEQ ID No. 6、 SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18、 SEQ ID No. 20或SEQ ID No. 26的核苷酸序列；或者與其具有至少98%同一性的核苷酸序列；或者通過遺傳密碼的簡併性與SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、 SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 26 的核苷酸序列相關的核酸。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述修飾對應於在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點的遠側外環內的位置引入至少一個糖基化位點。
6.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點的遠側外環內的位置的一個或多個胺基酸被比原胺基酸更親水的胺基酸取代。
7.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而使一個或多個親水性胺基酸被插入在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點的遠側外環內的位置。
8.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而在所編碼的胺基酸中取代或插入一個或多個胺基酸以產生一個或多個共有序列Asn-Xxx-Ser或 Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可為除Pro外的任何胺基酸。
9.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被修飾，從而在所編碼的胺基酸序列中引入一個或多個Asn、Ser或Ilir。
10.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，引入至少2個、優選至少3個糖基化位點ο
11.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述核苷酸序列被進一步修飾以與 SEQ ID No. 2相比增強了所述蛋白的C-末端加工。
12.根據權利要求10所述的方法，其中所述C-末端為從306位胺基酸向前，其中所述位置對應於比對時SEQ ID No. 2的胺基酸序列中的位置。
13.根據權利要求10或11所述的方法，其中所述C-末端加工包括以下一個或多個 在306位或320位的取代或插入或者在所述C-末端的一個或多個KEX2位的刪除，其中各位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。
14.根據權利要求10-12中任一項所述的方法，其中所述C-末端加工包括以下一個或多個在306位或320位的取代，或者在311-312或307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。
15.根據前述任一項權利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修飾，從而在33、63、78、 190和305位中的一個或多個位置具有取代，其中所述胺基酸被N取代。
16.根據前述任一項權利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修飾，從而在306位具有取代，其中所述胺基酸被除K或R或A以外的任意胺基酸取代，優選所述306位的取代是被胺基酸S取代。
17.根據前述任一項權利要求所述的方法，所述核苷酸序列被修飾，從而在320位具有取代，其中所述胺基酸被除T以外的任意胺基酸取代，優選所述320位的取代是被胺基酸E 取代。
18.根據前述任一項權利要求所述的方法，其中，所述宿主生物為真菌，優選來自木黴屬(Trichoderma)，更優選來自裡氏木黴(Trichoderma reesei)禾中。
19.通過前述任一項權利要求所述的方法獲得的多肽(前原多肽或脂肪分解酶)。
20.包含核苷酸序列的核酸，其中，所述核苷酸序列編碼脂肪分解酶並且在對應於所編碼的胺基酸序列中的位置包含至少一個以下修飾a)在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個親水胺基酸；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個或多個位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各胺基酸位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置；其中當所述核苷酸序列編碼SEQ ID No. 22或SEQ ID No. 23所示的真菌脂肪分解酶時，所述修飾不是在63位的取代並且所述刪除不在311-312位。
21.根據權利要求20所述的核酸，其中，所述真菌脂肪分解酶在修飾前不包含任何糖基化位點。
22.根據權利要求20或21所述的核酸，其中，所述核苷酸序列與SEQID No. 1，與 SEQ ID No. 24，或與SEQ ID No. 24的23-106位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. 24的 113-1063位所示的核苷酸序列，或與SEQ ID No. M的113-9 位所示的核苷酸序列具有至少90%的同一性。
23.根據權利要求20-22中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含至少一個修飾，所述修飾對應於用比原胺基酸更親水的胺基酸取代位於所述多肽的表面位置和所述酶活性位點的遠側外環中的位置的一個或多個胺基酸。
24.根據權利要求20-23中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含至少一個修飾，所述修飾對應於在所述多肽的表面位置和所述酶活性位點的遠側外環中的位置插入一個或多個更親水的胺基酸。
25.根據權利要求20-24中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含至少一個修飾，所述修飾對應於一個或多個胺基酸的取代或插入以提供一個或多個共有序列 Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可以是所編碼的蛋白中除Pro外的任何胺基酸。
26.根據權利要求20-25中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾對應於在所編碼的蛋白中引入一個或多個Asn、Ser或Hir。
27.根據權利要求20-26中任一項所述的核酸，其包含編碼至少兩個，優選至少三個糖基化位點的密碼子。
28.根據權利要求20-27中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列在所述序列的 C-末端區包含修飾以與SEQ ID No.2相比增強了所述蛋白的C-末端加工。
29.根據權利要求觀所述的核酸，其中，所述C-末端包含編碼第306位胺基酸向前的核苷酸序列，其中所述位置對應於比對時SEQ ID No.2的胺基酸序列中的位置。
30.根據權利要求觀-29中任一項所述的核酸，其中，所述C-末端區的修飾包含一個或多個修飾，所述修飾導致在第306位或320位的取代或插入，或者在所編碼蛋白的C-末端中的一個或多個KEX2位置的刪除，其中各位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。
31.根據權利要求觀-30中任一項所述的核酸，其中，所述修飾包含導致以下一個或多個的修飾在第306位或320位的取代，或在311-312或307-319位的一個或多個位置的刪除，其中各個位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。
32.根據權利要求20-31中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾導致在第63、78、190和305位中的一個或多個位置的取代，其中在所編碼的蛋白中所述胺基酸被N取代。
33.根據權利要求20-32中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾導致在所編碼蛋白的第306位發生取代，其中所述取代是被除K或R或A的任何胺基酸取代，優選所述第306位的取代是被胺基酸S取代。
34.根據權利要求20-33中任一項所述的核酸，其中，所述核苷酸序列包含修飾，所述修飾導致在第320位發生取代，其中所述胺基酸被除T外的任何胺基酸取代，優選第320位被胺基酸E取代。
35.編碼對極性脂質中的酯鍵具有水解活性的多肽的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列包含 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16,SEQ ID No. 18,SEQ ID No. 20 或SEQ ID No. 26 ；或者與 SEQ ID No. 8、 SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 16、 SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20或SEQ ID No.洸具有至少98% (優選至少99%，更優選至少99. 5%，更優選至少99. 8% )同一性的核苷酸序列；或者通過遺傳密碼的簡併性與SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 16、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 26 的核苷酸序列相關的核酸。
36.變體多肽，其由權利要求20-35中任一項所述的核酸或核苷酸序列編碼。
37.變體多肽，其對極性脂質中的酯鍵具有水解活性且包含與SEQID No. 2的胺基酸 33-296具有至少90%同一性的胺基酸序列，並且所述胺基酸序列與SEQ ID No. 2所示的序列相比已經被修飾，所述修飾為a)在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點；b)在所述多肽的表面位置和在所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個親水胺基酸；或c)在33、63、78或190位中的至少一個或多個位置的胺基酸取代或插入， 其中各胺基酸位置均對應於SEQ ID No. 2的胺基酸序列的位置。
38.根據權利要求37所述的多肽，其中，位於所述多肽的表面位置和所述酶活性位點的遠側外環中的位置的一個或多個胺基酸被比原胺基酸更親水的胺基酸取代。
39.根據權利要求37或38中任一項所述的多肽，其中，在所述多肽的表面位置和所述酶活性位點的遠側外環中的位置插入一個或多個親水胺基酸。
40.根據權利要求37或38中任一項所述的多肽，其中，取代或插入了一個或多個胺基酸，從而產生一個或多個共有序列Asn-Xxx-Ser或Asn-Xxx-Thr，其中Xxx可為除Pro外的任何胺基酸。
41.根據權利要求37-40中任一項所述的多肽，其中，引入了一個或多個Asn、Ser或Thr。
42.根據權利要求37-41中任一項所述的多肽，其中，在第33、63、78、190位中的一個或多個位置的修飾是用胺基酸N取代所述位置的胺基酸。
43.根據權利要求37-42中任一項所述的多肽，其中，引入了至少兩個，優選至少三個糖基化位點。
44.根據權利要求19、36-45中任一項所述的多肽，其中，所述變體多肽具有磷脂酶活性或者半乳糖脂酶活性。
45.根據權利要求19、36-5中任一項所述的多肽，其中，除了以下修飾外 G33NK63N ； G78N ； A190N ；K63N+G78N+A190N ；所述多肽包含SEQ ID No. 2所示胺基酸序列的胺基酸33-296。
46.前原多肽，其在宿主生物體內進行翻譯後加工時產生對極性脂質中的酯鍵具有水解活性的多肽，其中所述前原多肽包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No.21 或 SEQ ID No. 25所示的胺基酸序列。
47.對極性脂質中的酯鍵具有水解活性的多肽，其中，所述多肽可得自於包含SEQID No. 9、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 17、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 21或SEQ ID No. 25所示的胺基酸序列的前原多肽。
48.權利要求20-35任一項所述核酸的用途，用以增強脂肪分解酶在宿主生物的表達。
49.根據權利要求49的用途，其中，所述宿主生物是真菌，優選木黴(Trichoderma spp.)，優選裡氏木黴。
50.製備食品的方法，所述方法包括添加權利要求19或36-45或47中任一項所述的多肽至所述食品的一種或多種成分中。
51.製備烘焙產品的方法，所述方法包括添加權利要求19或36-45或47中任一項所述的多肽至生麵團中和烘焙所述生麵團以製備所述烘焙產品。
52.根據權利要求50所述的方法，其中，所述食品是以下一種或多種蛋或基於蛋的產品；烘焙產品；麵條；玉米餅；生麵團；糖食；冷凍產品；乳製品，包括奶酪；慕思；生植物奶油；食用油和脂肪；充氣和無氣攪打的產品，水包油乳液和油包水乳液；人造黃油；起酥油； 塗抹物，包括低脂和極低脂肪塗抹物；調味品；蛋黃醬；蘸料，基於奶油的沙司；基於奶油的湯；飲料；調味乳和沙司。
53.製備溶血磷脂的方法，其包括用權利要求19或36-45或47中任一項所述的多肽處理磷脂以產生溶血磷脂。
54.製備溶血糖脂的方法，其包括用權利要求19或36-45或47中任一項所述的多肽處理糖脂以產生溶血糖脂。
55.植物油或食用油的酶促脫膠方法，其包括用權利要求19或36-45或47中任一項所述的多肽處理食用油或植物油以水解其中存在的大部分極性脂質。
56.通過權利要求50或52所述的方法獲得的食品。
57.通過權利要求51所述的方法獲得的烘焙產品。
58.麵包改良組合物或生麵團改良組合物，其包含權利要求19、36-45或47中任一項所述的變體多肽。
59.生麵團或烘焙產品，其包含權利要求M所述的麵包改良組合物或生麵團改良組合物。
60.變體多肽，其一般如本文參考實施例或圖的定義。
61.方法，其一般如本文參考實施例或圖的定義。
全文摘要
本發明涉及製備變體脂肪分解酶的方法，其包括在宿主生物中表達核苷酸序列，所述核苷酸序列與編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列具有至少90％的同一性並且在對應於所編碼胺基酸序列中的位置包含至少一個以下修飾a)與原真菌脂肪分解酶相比在所述胺基酸序列中引入至少一個糖基化位點(或一個額外的糖基化位點)；b)在所述多肽的表面位置和所述酶活性位點(催化三聯體)的遠側外環內的位置引入至少一個胺基酸，所述胺基酸更加親水(與原胺基酸相比)；或c)在33、63、78、190、305、306或320位中的一個或多個位置的取代或插入，或者在311-312或307-319位中的一個或多個位置的刪除，其中各胺基酸位置均對應於與SEQ ID No.2比對時所述胺基酸序列的位置；其中當所述核苷酸序列與編碼SEQ ID No.22或SEQ ID No.23所示的真菌脂肪分解酶序列的核苷酸序列具有至少90％的同一性時，所述修飾不是在63位的取代並且所述刪除不在311-312位。優選地，所述核苷酸序列與SEQ ID No.1具有至少90％同一性。本發明還涉及通過所述方法產生的多肽以及新核酸。
文檔編號C12N9/18GK102459581SQ201080028819
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月23日 優先權日2009年6月25日
發明者安德雷·米亞斯尼科夫, 延斯·弗裡斯貝克·瑟倫森, 理察·R·博特 申請人:丹尼斯科公司