轉導肽－人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物的製作方法

2023-05-30 04:27:01

專利名稱：轉導肽－人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有藥用價值的融合蛋白，具體為轉導肽-人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白，編碼該融合蛋白的核酸分子。本發明也涉及含有該融合蛋白的藥物組合物。
背景技術：
概述粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colonystimulating factor，GM-CSF)是主要的造血生長因子之一，可刺激早期多能造血幹細胞和粒-單系祖細胞的增殖與分化；增強成熟中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核-巨噬細胞功能；協同刺激紅系、巨核系及高增殖潛能祖細胞(HPP-CFC)生長；延長巨噬細胞存活時間及提高其抗腫瘤能力；同時，GM-CSF還能刺激內皮細胞生長，阻止多種細胞凋亡，在造血調控和免疫調節中發揮重要作用。GM-CSF還可以促進樹突狀細胞(DC)等APC分化、成熟和活化及上調CD86的表達以激發對腫瘤的免疫應答；促進Th、Tc、NK在腫瘤部位浸潤，從而殺傷腫瘤。
作為一個多潛能的造血生長因子，它的主要臨床應用是促進骨髓造血，目前在臨床上rhGM-CSF已成功地用於治療惡性腫瘤放、化療後所致的白細胞減少症，以及用於骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細胞低下的免疫缺陷性疾病的治療等。近些年的研究發現，GM-CSF不僅能夠作用於造血幹、祖細胞促進骨髓造血，而且還作用於目前已知體內功能最強的抗原提呈細胞-樹突狀細胞，以促進免疫應答，調節免疫反應[[2，3]。另外，GM-CSF還作用於角質細胞、成纖維細胞、黏膜細胞等。近年來許多文獻報導，rhGM-CSF不但能夠用於防治白細胞減少症，而且在創傷癒合、抗病毒、抗真菌等治療中也有著很好的療效，具有重要的臨床應用價值。
GM-CSF的性質GM-CSF是一種酸性糖蛋白。hGM-CSF基因定位於5號染色體長臂(5q21-32)，基因長度為2.5kb，有4個外顯子和3個內含子。hGM-CSF是一種由127個胺基酸組成的糖蛋白，根據其糖基化程度不同，分為9個以上不同的類型，分子量14kD-32kD。其二級結構由兩個反向平行的β摺疊和4個反向平行的α螺旋組成，N端第一螺旋是GM-CSF受體β亞基的識別區。四個半胱氨酸殘基形成兩個鏈內二硫鍵(C54，C96)和(C88，C121)，對GM-CSF的穩定性和生物活性起重要作用。
目前已知，GM-CSF的生物學功能乃是通過表達於細胞膜上的特異性受體而介導。GM-CSF通過與受體結合，激活靶細胞上Na+/H+轉換載體活性，提高細胞內pH數值，從而引導細胞增值分化。
GM-CSF的靶細胞主要有骨髓不同發育階段的造血細胞、中性粒細胞、單核巨噬細胞、嗜酸粒細胞、內皮細胞、急性髓性白血病細胞等。
GM-CSF的表達體系利用重組克隆的方法在大腸桿菌、酵母菌和哺乳動物細胞系統中成功表達了GM-CSF。在大腸桿菌中的表達方式主要為兩種(1)包涵體形式，GM-CSF在大腸桿菌中表達最常見的是形成不溶性的包涵體，經提取包涵體、變性裂解、復性、純化等步驟得到GM-CSF。(2)分泌型表達，即利用外膜蛋白信號肽(OmpA)基因，將GM-CSF基因克隆到OmpA基因後面，用定位突變的方法去除二者間的連接序列，得到成熟的GM-CSF，但表達量不高，每升發酵液僅20mg左右。
GM-CSF在酵母系統中的表達，是將GM-CSF基因克隆到α-因子信號肽基因下遊，用定位突變的方法去除GM-CSF與α-因子信號肽間的連接序列，在ADHZ，PGK等啟動子調控下，於酵母中表達並分泌到胞外，表達量可高達每升發酵液50-60mg。
GM-CSF在哺乳動物細胞體系如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和猴COS-1細胞中進行了表達，但表達量甚微。
上述三種體系表達的GM-CSF，其主要區別是N-位點及O-位點的糖基化。大腸桿菌表達的GM-CSF(E.coli-GM)，N-位點和O-位點均未糖基化，分子量為14.6kD；酵母表達的GM-CSF(Yeast-GM)，僅N-位點糖基化，而O-位點未糖基化，分子量15.6-30kD；哺乳動物細胞表達的GM-CSF(CHO-GM)，N-位點和O-位點均被糖基化，分子量18-24kD。體外實驗表明糖基化與非糖基化GM-CSF在生物學活性方面無明顯差異。
臨床應用方面，Dorr比較了E.coil-GM和Yeast-GM的毒副作用，結果E.coil-GM組出現液體滯留，呼吸困難，發燒，肌痛/骨痛/關節痛和斑疹的平均頻率分別為18.4％，55.2％，40.7％，28.5％和12.5％，Yeast-GM組相對應分別為8.3％，13.4％，21.7％，16％和14.3％。表明Yeast-GM毒副作用較輕。Hussein等將E.coil-GM，Yeast-GM和CHO-GM分別用於自體骨髓移植後的乳腺癌或黑色素瘤病人，結果在升高白細胞和中性粒細胞的恢復方面，E.coli-GM和Yeast-GM明顯高於CHO-GM，而CD34+細胞數量，CHO-GM組最高，Yeast-GM組又高於E.coil-GM。其作用機理仍需進一步探討。
GM-CSF的生物學作用GM-CSF主要有以下的生物學作用能在造血幹細胞和祖細胞水平有效刺激粒細胞和單核-巨噬細胞系增殖、分化和成熟。體外半固體培養中可有效刺激正常髓系多向造血祖細胞、粒/巨噬細胞和嗜酸粒細胞克隆形成。還具爆式促進因子(BPA)的活性，與GM-CSF協同促進爆式紅系集落形成單位形成。GM-CSF也能促進巨核系細胞生長和血小板的生成。還刺激某些白血病細胞(HL 60和KG 1)增殖生長，誘導HL 60細胞向成熟方向分化。骨髓內皮細胞是造血微環境的基質細胞之一，對造血有重要調控作用，外源性GM-CSF可刺激其增殖。GM-CSF不僅可刺激未成熟前體細胞的增殖，還可提高成熟血細胞的功能，延長其生存期，在調節成熟血細胞功能中似乎起中心作用。GM-CSF對中性粒細胞的作用主要表現為增加蛋白質合成，延長生存期；促進ADCC作用；改變細胞表面受體表達，抑制其在炎症區的移動；上調細胞表面黏附蛋白表達，誘導胞漿內脫顆粒作用；增強氧化代謝，增加超氧化物產生；加速Ca2+流，誘導遊走，增加LTB4合成。還可增強單核巨噬細胞的吞噬、細胞毒和殺傷腫瘤細胞的作用，促進細胞因子的表達、黏附及氧化代謝。對嗜酸粒細胞主要是增強細胞毒作用及白三烯合成、組胺釋放。此外，多種非造血起源的腫瘤細胞系對GM-CSF也有敏感反應。
GM-CSF是一種具有廣譜效應的多肽生長因子，它通過結合特定的高親和力受體起作用。在調節造血和白細胞功能中有重要作用，能刺激骨髓祖細胞增殖和分化，刺激中性、嗜酸性粒細胞、MΦ及DC增殖和成熟；也可促進巨核細胞生長。對紅細胞生長有輔助調節作用，有促紅細胞、網織紅細胞作用，提高單核巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬功能，增加粒細胞數目，提高黏附分子表達及ADCC殺瘤作用，減少感染機會，提高免疫力，尤其具有增強機體腫瘤免疫的功能。
臨床應用GM-CSF是諸多造血因子中重要一員，自90年代應用於臨床以來，特別是腫瘤放療、化療所致的白細胞減少、骨髓移植、骨髓異常增生症候群、再生障礙性貧血等治療取得了一定療效。近年來的臨床應用中又發現對放、化療所致黏膜炎、真菌感染、病毒性肝炎、糖尿病合併脂肪漸進性壞死的不愈性小腿潰瘍和肺泡蛋白沉積症等亦有較好的療效。
1、腫瘤放化療所致的造血功能障礙腫瘤化療的療效很大程度取決於化療藥物的劑量強度、密度，而兩者增加常造成骨髓抑制、免疫功能損害，以致化療失敗。骨髓抑制粒細胞減少，又繼發細菌和真菌感染甚至導致病人死亡。十多年的臨床實踐已證明應用GM-CSF，G-CSF可有效預防和治療化療所致粒細胞減少，縮短中性粒細胞減少時間，降低感染的發生。
GM-CSF可刺激造血的增殖，主要是通過與效應細胞(正常增殖骨髓幹細胞、中性粒細胞、單核粒細胞、巨噬細胞等)表面的GM-CSF受體結合而發揮其生物學效應。它除刺激幹細胞、祖細胞的分化、增殖外，還有類似巨核細胞克隆刺激因子的活性，增加白細胞介素-3(1L-3)對巨核細胞克隆形成效用，協同促紅細胞生成素刺激紅細胞增殖[劉魏，馮魏健，王玉華等.GM-CSF與化療同步應用的臨床觀察.中國腫瘤生物治療雜誌，2000；7(3)181]。
2、加快骨髓移植後造血功能的重建骨髓移植是當前血液系統惡性腫瘤治療的主要手段，近年來對實體瘤如乳腺癌、黑色素瘤、肺癌也取得了一定的成功。一般說來，骨髓移植後需三周中性粒細胞才能恢復，此期間極易發生感染，死於感染者約佔10％-15％。大劑量化療，骨髓移植應用GM-CSF能加速骨髓造血功能重建，升高周圍白細胞，減少細菌感染[趙忠信.重組人粒細胞-巨細胞集落刺激因子的臨床新用途.中國腫瘤生物治療雜誌，zooo；7(1)71]。
3、治療骨髓異常綜合症(MDS)和再生障礙性貧血(SAM)文獻報告GM-CSF可有效的恢復MDS病人粒系再生能力，可使白細胞升高5-70倍，用藥物48h開始上升，一周達到穩定，但也有人認為從GM-CSF促進白細胞分化、成熟上看，GM-CSF可誘導MDS潛在白血病細胞增殖，也是臨床醫生擔心的問題。
再生障礙性貧血是一種異源性疾病，自從上個世紀90年代GM-CSF應用於臨床有很多有關GM-CSF治療「再障」的報導，可使外周血白細胞數增加5-20倍，中性粒細胞數增加5-373倍，其他如單核細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞、血小板等也都有不同程度的升高。儘管如此，由於不同原因所致的再障，其治療結果也不盡相同，有的甚至效果較差。用GM-CSF治療「再障」仍是一個需要進一步研究的課題[TroussardX，Macro M，Vie B，et al.Human recombinantganulocyte-macrophage colony stimulating factor(hrGM-CSF)improves double hemibody irradiation(DHBI)tolerance inpatients with stage U1 multiple myelomaa pilot study.Br JHaematal，1995；89191]。
4、愛滋病(AIDS)所致的白細胞減少的治療白細胞減少是愛滋病的主要並發病，當白細胞減少，常易導致嚴重感染，威脅AIDS病人的生命安全，應用GM-CSF不但能增加AIDS病人外周血中性粒細胞數量，而且也能增加其功能。由於中性粒細胞可產生抗體依賴性細胞介導的細胞毒(ADCC)，對AIDS的HIV有拮抗作用。最近文獻報告GM-CSF與Eidovudin幹擾素治療，使粒細胞迅速恢復，但也有人報告GM-CSF可使HIV產抗原(病毒複製)水平升高，故確切療效尚需深人研究。
5、增強免疫，抗腫瘤作用單核細胞是人體免疫系統中關鍵的細胞之一，除具有吞噬細胞功能外，還有調節宿主免疫系統的重要作用，此作用是由於GM-CSF促使單核巨噬細胞的ADCC作用和合成釋放抗腫瘤因子。英國Christie醫院應用GM-CSF治療晚期惡性腫瘤20例，7例腫瘤穩定70天，1例脂肪肉瘤縮小50％，並持續6個月[張守岌，宋希林.粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子在腫瘤應用進展腫瘤防治雜誌，2000；7(5)518]。
6、惡性腫瘤放、化療所致黏膜炎症、潰瘍的預防和治療作用口腔黏膜潰瘍是惡性腫瘤放、化療過程中不可避免的併發症，而這種併發症不但影響治療的繼續進行，而且易導致細菌、真菌等微生物的感染，加重病情。目前臨床上對這種併發症的處理還沒有什麼好的治療手段，常規的治療措施是積極抗感染、補充維生素及加強營養等，但這些辦法幾乎沒有多少臨床效果。
rhGM-CSF不僅能夠促進骨髓造血，而且對口腔黏膜潰瘍也有著很好的防治作用。1994年Reynos等採用rhGM-CSF加生理鹽水漱口的方法對大劑量化療、異基因骨髓移植和自體外周血幹細胞移植所導致的口腔黏膜潰瘍進行了研究，證明rhGM-CSF對防治口腔黏膜潰瘍有著很好的效果。rhGM-CSF無論是採用皮下注射，還是採用溶於生理鹽水漱口的方式，它均能有效地促進潰瘍癒合，這也許在臨床上是一個很好的選擇。
7、對真菌感染的治療目前，真菌感染已成為腫瘤患者的主要死亡原因之一。有文獻報導，對於持續發熱並伴有白細胞低下的患者，經抗生素治療1周後，系統性真菌感染的發生率約為33％，而對於骨髓移植患者，侵人性真菌感染的發生率也高達15％-30％。這些現象已經明確地顯示，真菌感染對惡性腫瘤患者的預後產生了嚴重的影響。
現在臨床上常用的抗真菌製劑主要有兩性黴素、制黴菌素、克黴哇、氟康哇、酮康哩等，這些藥物都有著一定的抗真菌作用，但是它們同時均有著一個嚴重的副反應—骨髓抑制，以致許多患者不得不終止治療。GM-CSF是一種具有多項潛能的造血生長因子，它不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟，恢復因腫瘤化療所致的骨髓抑制，而且對機體免疫機能的調節也起著一定的作用。鑑於此，GM-CSF在治療真菌感染中能夠發揮良好的作用。Peter等[Peters BG，AdkinsDR，Harrison BR，et al.Antifungal effects of yeast derivedrhuGM-GSF in patients receiving high dose chemotherapy givenwith or without autologous stem cell transplantation；Aretrospective analysis.Bone Marrow Transulant.1996.18(1)93]對145例進行自體幹細胞移植患者的真菌感染情況進行了回顧性分析，發現採用rhGM-CSF治療的70例患者中有2例存在真菌感染，發生率為2.9％；而在對照組，75例患者中有9例發生真菌感染，發生率為12％。經過統計學處理，P值為0.023，兩者之間存在明顯差異。rhGM-CSF對真菌感染確實有著良好的療效，它能夠增強抗真菌藥物的作用。
8、病毒肝炎的治療傳統HBV，HCV都以幹擾素為主要治療手段，但臨床越來越感到不很理想，不少病例因治療中出現骨髓抑制而不得不停止治療。近年來研究發現，GM-CSF可激活T細胞、內皮細胞，增強抗原遞呈細胞(APC)的功能，增加細胞MHC，協同刺激分子(CM)參與機體免疫調節，增強抗病毒藥物的療效。目前GM-CSF已用於慢性肝炎的治療。GM-CSF提高a-INF對慢性B型肝炎抗病毒治療效果，其機理可能與升高血液單核細胞數量提高抗原遞呈能力有關[邵春忠，劉文彥，陳小霞等.粒細胞巨噬細胞集落刺激因子與α-幹擾素聯合治療慢性B型肝炎的療效觀察.中華實驗和臨床病毒學雜誌，2001；15(1)86]。
9、GM-CSF在新生兒期的應用新生兒由於自身免疫的特點，感染的發病率和病死率高，傳統的治療模式主要包括抗生素的使用及輸注各種血製品(包括血漿、粒細胞、靜脈用丙種球蛋白)，後者療效好，但潛在副作用大。應用CSF可增強吞噬細胞系統功能，提高機體免疫力，為新生兒感染的預防和治療開闢了一條新的途徑。但目前還處於初步階段，尚需進一步的基礎研究和臨床實驗來探討[張擁軍，徐英美.粒細胞-粒巨噬細胞集落刺激因子在新生兒期的應用.國外醫學兒科學分冊，2001；28(2)99]。
GM-CSF毒副作用絕大部分病人對臨床使用的rGM-CSF劑量都能很好耐受。雙盲、隨機和平行性的比較研究發現，rGM-CSF治療組病人腹瀉、視力疲勞、皮疹和感覺不適的發生率較高，其它副作用的類型和發生率與安慰劑對照組比較無明顯差異。開放性試驗表明，使用rGM-CSF的患者，大多都有類似流感的症狀，表現為肌肉疼痛，骨痛，疲勞和頭痛，部分病人發熱，小部分病人有毛細血管滲出症狀，出現液體儲留，浮腫，心包和胸膜液體滲出，導致停藥。亦有報導在皮下注射部位出現皮疹，個別病人有中央靜脈導管血栓形成和呼吸窘迫，因而，目前主張對有既往肺病史的患者，使用rGM-CSF應特別注意。
劑量和用法用酵母來源的rGM-CSF治療自體骨髓移植術後骨髓細胞的重建，美國推薦骨髓輸注後2-4h使用，250ug/m2，每日2h靜滴，連續使用21d。用rGM-CSF治療骨髓移植失敗的病人，美國主張250ug/m2/d，2h靜滴，連續14d，如有必要，間隔7d後再按上法使用，第三療程rGM-CSF的劑量可增加到500ug/m2/d，rGM-CSF 500ug/m2/d為臨床使用的最大劑量，如病人病情無改善，不要再加大劑量。rGM-CSF的藥動學特性與給藥途徑有關。靜脈內給rGM-CSF，血漿rGM-CSF迅速下降，分布半衰期為5-15min，消除半衰期為1.5-2h。皮下給rGM-CSF後2h，rGM-CSF血藥濃度達峰值，以後逐漸下降，為3h。靜脈注射rGM-CSF 15ug/kg，可維持有效濃度1ug/L 8-22h，皮下注射等量rGM-CSF，可維持有效濃度16h。
GM-CSF的給藥途徑包括靜脈和皮下注射。皮下注射方法可以減小GM-CSF的劑量。目前GM-CSF的使用必需是靜脈注射和皮下注射給藥方式，長期採用注射途徑給病人(除血透病人)帶來痛苦和不便，如果改用非創傷性給藥方式如皮膚或黏膜穿透給藥，易被病人接受，而且通過皮膚進入體內還可以提高安全性及延長藥物的半衰期。為解決以上問題，本發明利用能高效攜帶蛋白質分子穿透生物膜包括皮膚、黏膜、血腦屏障的小分子轉導肽(Protein Transduction Domain，PTD)，將原核表達的重組GM-CSF通過非創傷性給藥方式進入體內，從而達到治療貧血的目的。
轉導肽是一種能高效穿過生物膜的蛋白轉導結構域，它能將與其共價連接的多肽、蛋白質及DNA等分子跨膜導入幾乎所有的組織和細胞，還可以穿過血腦屏障。1988年Green發現HIV的Tat蛋白能夠高效地自由進出細胞。1994年Fawell將TAT的36 Aa的區域化學交聯到異源蛋白上後，交聯蛋白也可轉導入細胞內。Schwarze SR等人將TAT的PTD區域短肽與大分子半乳糖苷酶在原核細胞中融合表達後，將融合蛋白在小鼠體內注射，發現有活性的酶分子在體內的各組織中都有表達，尤為重要的是可以通過血腦屏障。除TAT肽外，來自果蠅觸角足同源異型轉錄因子Antp的43-58位的多肽序列，來自瘡疹單病毒DNA結合蛋白VP22的267-300序列均具有與TAT肽完全相似的轉導功能和轉導機制，它們被統稱為PTD。

發明內容
本發明一個方面涉及轉導肽-人源GM-CSF融合蛋白。本發明中，用於轉導所述人源GM-CSF的轉導肽可以選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。優選的，所述轉導肽具有SEQID NO.2(YGRKKRRQRRR)所述的胺基酸序列或其功能性片段。實際上，只要能夠轉導本發明所述人源GM-CSF的轉導肽均適用於本發明。
本發明中，所述融合蛋白的人源GM-CSF含有SEQ ID NO4(APARSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPTCLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITFESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE)的胺基酸序列或其功能性片段。優選的，人源粒細胞集落刺激因子由SEQ ID NO4組成。本發明的轉導肽-人源GM-CSF融合蛋白具有SEQ ID NO6的序列(YGRKKRRQRRR GGS APARSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPTCLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITFESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE)。
本發明的再一方面涉及含有上述編碼本發明轉導肽-人源GM-CSF融合蛋白的核苷酸的核酸分子，所述核酸分子優選為SEQ ID NO5(TAC GGCCGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGT GGTACC gcaccggcacgtagcccgag cccgagcacg cagccgtggg agcatgtgaa tgccatccaggaggcccgtc gtctgctgaa cctgagccgt gacaccgcgg cggagatgaatgaaaccgtg gaagtcatca gcgaaatgtt tgacctgcag gagccgacctgcctgcagac ccgcctggag ctgtacaagc agggcctgcg tggcagcctgaccaagctga agggcccgct gaccatgatg gccagccact acaagcagcactgcccgccg accccggaaa ccagctgtgc aacccagacc atcacctttgaaagcttcaa agagaacctg aaggactttc tgctggtcat cccgtttgactgctgggagc cggtccagga gtaa)所示的核苷酸序列。
上述核苷酸序列可以插入表達載體中。優選的，本發明所述表達載體為原核或真核表達載體，其中優選為pGEX、pET、pBV220和peDNA。
本發明通過將所述核酸分子導入原核表達載體pET28，pGEX-4T-1等中，通過原核細胞培養獲得與轉導肽融合表達的人源GM-CSF。
方法易於操作、成本低、轉導效率高。蛋白純化在變性條件下進行，使以包涵體形式存在的融合蛋白的純化過程大大簡化。使變性蛋白的天然構象變成相對靈活的鏈狀結構，擺脫空間構象的限制，具備更高的能量，使轉導效率大大提高。當融合蛋白轉入細胞後，重新摺疊，恢復天然構象使GM-CSF發揮其生物學活性，而與其共價連接的蛋白轉導域不影響細胞的正常結構或功能。
本發明又一方面涉及含有本發明所述融合蛋白的藥物組合物，所述藥物組合物用於惡性腫瘤放、化療後所致的白細胞減少症，骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細胞低下的免疫缺陷性疾病的治療，以及創傷癒合、抗病毒、抗真菌等治療。
所述藥物組合物可以含有非注射劑型常用的藥學可接受的載體或賦形劑。優選的，本發明所述劑型為可穿越皮膚、黏膜、角膜、結膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡膜、神經膜、血腦屏障等一切細胞膜及生物膜的劑型。特別是舌下含服、肺吸入、鼻噴劑、肛栓及皮膚吸收等多種方式用藥。
藉助本發明的融合蛋白，可以經非注射途徑將人源GM-CSF輸入機體使臨床用藥更為安全、方便。
實施例實施例1 人外周血單核細胞總RNA的提取健康人抗凝外周血，用淋巴細胞分離液分離出單核細胞。在含20％小牛血清、10-8mol/L TPA和2ug/ul PHA的1640培養液中，在37℃和含50％CO2的飽和溼度條件下培養20h，收集貼壁的單核細胞。採用Promega公司的RNAgentsR Total RNA Isolation System提取總RNA。
實施例2 hGM-CSF cDNA的克隆參考Genebank中hGM-CSF cDNA序列設計引物前面引人了限制性內切酶EcoR I位點和起始密碼子ATG，下遊引物中含天然GM-CSFcDNA 3』端非編碼區中部分序列，後面引入限制性內切酶BamH I位點，其序列為引物15′-G GAATTC ATGGCA CCA GCT CGT TCT CCA-3′(SEQ IDNO7)引物25′-CT GGATCC CGATCGGGATCATGAGAGAG CAGCTC-3′(SEQID NO8)以實施例1得到的RNA作為模板，參照試劑盒廠家推薦方案進行RT-PCR擴增，獲得全長的hGM-CSF cDNA，5′和3′端分別攜帶EcoRI，BamH I位點。
反轉錄與PCR擴增用Perkin ElmerCetus公司生產的反轉錄PCR試劑盒。取提取的細胞總RNA 1-2ug，加入20ul反轉錄體系中，以oligo dT為引物，於42℃作用1h，合成cDNA第一鏈。99℃5min終止逆轉錄反應。將20ul逆轉錄產物加入到100ul的PCR反應體系中，其中含上下遊引物。96℃變性10min後加入Taq DNA聚合酶，進行PCR循環，反應參數為94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環後72℃再延伸7min。
實施例3 重組hG-CSF表達質粒構建與鑑定
hGM-CSF的RT-PCR產物經EcoRI和BamHI雙酶切後，與經同樣酶切回收的表達載體pBV220片段，按4∶1摩爾比連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，篩選陽性重組子pBV hGM-CSF。送上海申工公司測序。
實施例4 pBV hG-CSF在大腸桿菌中的誘導表達將過夜培養的實施例3篩選的陽性單菌落接種於LB液體培養基中(含Amp 60mg/L)，於30℃培養至OD600＝0.45後，迅速升溫至42℃，誘導5h左右，至OD600＞1.2。於4℃下6000g離心10min，收集菌體。SDS-PAGE電泳鑑定rhGM-CSF的表達水平，並鑑定表達形式。
實施例5 rhGM-CSF的復性與純化將上述誘導表達後的菌體超聲破解。12000g離心20min，棄上清。沉澱經洗滌、溶解，將包涵體溶解液上樣到Sephacryl S-200柱(3.6×100cm)，洗脫液為含8mol/L尿素、1mmol/L DTT的TE緩衝液，流速0.5ml/min。上述收集液用TE稀釋至蛋白濃度為100ug/ml以下，尿素濃度保持在1mol/L，加入0.1mmol/L氧化型穀胱甘肽(G-S-S-G)，1mmol/L還原型穀胱甘肽(GSH)，10℃復性2小時。用TE緩衝液平衡QSepharose Fast Flow層析柱(1.5×20cm)。將復性液上樣，待穿過峰過後，分別用含0.3mol/L，0.5mol/L，1.0mol/L NaCl的TE洗脫，流速1ml/min，收集目的峰，對PBS透析。
實施例6 生物活性測定採用小鼠白血病細胞株NFS-60依賴性MTT測定法。將NFS-60在含10ng/ml GM-CSF的完全培養基RPMI-1640中傳代。檢測當天，NFS-60用RPMI-1640洗3遍(1000r/min離心5min)，用含15％血清的培養基調整為5×104/ml。樣品根據測算蛋白濃度稀釋至10ng/ml，hGM-CSF標準品和待測樣品均倍比稀釋。陰性對照不加GM-CSF。細胞在50％CO2，37℃飽和溼度環境下培養72h。加MTT顯色液及溶解液二甲基亞碸，用570nm波長濾光片測OD值。
按下式計算rhGM-CSF活性單位 根據蛋白濃度計算每毫克rhG-CSF的單位數即為比活性(U/mg)。
序列表110中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所120轉導肽-人源粒細胞巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白及其藥物組合物1608210I21133212DNA213編碼PTD的核苷酸序列4001TACGGCCGCA AGAAACGCCG CCAGCGCCGC CGC 33210221111212胺基酸序列213PTD的胺基酸序列4002YGRKKRRQRR R 112103211384212DNA213編碼人源粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的核苷酸序列4003gcaccggcac gtagcccgag cccgagcacg cagccgtggg agcatgtgaa tgccatccaggaggcccgtc gtctgctgaa cctgagccgt gacaccgcgg cggagatgaa tgaaaccgtggaagtcatca gcgaaatgtt tgacctgcag gagccgacct gcctgcagac ccgcctggagctgtacaagc agggcctgcg tggcagcctg accaagctga agggcccgct gaccatgatggccagccact acaagcagca ctgcccgccg accccggaaa ccagctgtgc aacccagaccatcacctttg aaagcttcaa agagaacctg aaggactttc tgctggtcat cccgtttgactgctgggagc cggtccagga gtaa 3842104211127212胺基酸序列213人源粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的胺基酸序列4004APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLELYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQT ITFESFKENL KDFLLVIPFDCWEPVQE 1272105211426
212DNA213編碼PTD-人源粒細胞巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白的核苷酸序列4005tacggccgca agaaacgccg ccagcgccgc cgcggtggta ccgcaccggc acgtagcccgagcccgagca cgcagccgtg ggagcatgtg aatgccatcc aggaggcccg tcgtctgctgaacctgagcc gtgacaccgc ggcggagatg aatgaaaccg tggaagtcat cagcgaaatgtttgacctgc aggagccgac ctgcctgcag acccgcctgg agctgtacaa gcagggcctgcgtggcagcc tgaccaagct gaagggcccg ctgaccatga tggccagcca ctacaagcagcactgcccgc cgaccccgga aaccagctgt gcaacccaga ccatcacctt tgaaagcttcaaagagaacc tgaaggactt tctgctggtc atcccgtttg actgctggga gccggtccaggagtaa 4262106211141212胺基酸序列213轉導肽-人源粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的胺基酸序列4006YGRKKRRQRR RGGSAPARSP SPSTQPWEHV NAIQEARRLL NLSRDTAAEM NETVEVISEMFDLQEPTCLQ TRLELYKQGL RGSLTKLKGP LTMMASHYKQ HCPPTPETSC ATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE 141210721128212DNA213引物40076GAATTCATG GCACCAGCTC GTTCTCCA 28210821134212DNA213引物4008CTGGATCCCG ATCGGGATCA TGAGAGAGCA GCTC 3權利要求
1.一種融合蛋白，其含有轉導肽和人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
2.權利要求1的融合蛋白，其中所述轉導肽選自反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蠅同源異型轉錄因子ANTP和單純皰疹病毒I型VP22轉錄因子的PTD序列或其功能性類似物或片段。
3.權利要求2的融合蛋白，其中所述轉導肽具有SEQ ID NO2的序列或其功能性片段。
4.權利要求1-3中任一項的融合蛋白，其中所述人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子具有SEQ ID NO4的序列。
5.權利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO6的序列。
6.核酸分子，其編碼權利要求1-5中任一項的融合蛋白。
7.權利要求6的核酸分子，其具有SEQ ID NO5的序列。
8.包含權利要求7的核酸分子的表達載體。
9.藥物組合物，其含有權利要求1-5中任一項的融合蛋白。
10.權利要求9的藥物組合物，其劑型為可穿越皮膚、黏膜、角膜、結膜、漿膜、肌膜、血管及淋巴管膜、脈絡膜、神經膜、血腦屏障等一切細胞膜及生物膜的劑型。
11.權利要求9的藥物組合物，其適合於舌下含服、肺吸入、鼻噴劑、肛栓及皮膚吸收用藥。
12.權利要求1-5中任一項的融合蛋白在製備藥物中的應用，所述藥物用於治療惡性腫瘤放化療後所致的白細胞減少症、骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細胞低下的免疫缺陷性疾病，以及創傷癒合、抗病毒、抗真菌治療。
全文摘要
本發明涉及一種轉導肽－人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白以及含有編碼所述融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本發明還涉及含有上述核酸分子的表達載體。本發明還涉及所述融合蛋白在製備藥物中的應用，所述藥物用於惡性腫瘤放、化療後所致的白細胞減少症、骨髓移植、再生障礙性貧血和某些存在白細胞低下的免疫缺陷性疾病的治療，以及創傷癒合、抗病毒、抗真菌等治療。
文檔編號A61K9/00GK101074267SQ20061008245
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者李前, 孫曼霽 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所