單個顆粒的冷凍乳酸菌培養物的製作方法
2023-05-30 05:42:06
專利名稱：單個顆粒的冷凍乳酸菌培養物的製作方法
技術領域：
本發明涉及市售相關包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物，該包裝具有至少重50g的冷凍物質，其中所述冷凍物質以單個顆粒的形式存在，特徵在於，當貯藏在低於培養物起始融解溫度(Tm』)如-46℃下7-14天時，所述冷凍培養物的單個顆粒並不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒。
背景技術：
微生物涉及包括大多數乳製品在內的食品及飼料產品的製造。細菌培養物，特別是一般分類為乳酸菌的細菌培養物是製造所有發酵乳製品、乾酪和黃油所必不可少的。這樣的細菌培養物可稱為起子培養物，它們通過執行許多功能以賦予各種乳製品之獨特性質。
乳製品起子培養物一般由乳酸菌組成。在本發明上下文中，措辭「乳酸菌」(LAB)指一組革蘭氏陽性的、過氧化氫酶陰性的、非運動性的、不形成孢子的、微需氧的或厭氧的細菌，其發酵糖產生有機酸，包括作為主要產物的乳酸、甲酸和丙酸。在本發明上下文中乳酸菌包括厚壁菌(Firmicutes)門中的許多細菌屬。肉桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳球形菌屬(Lactosphaera)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)、漫遊球菌屬(Vagococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)被認為是LAB。同樣，屬於放線菌(Actinobacteria)門產乳酸的革蘭氏陽性菌，例如氣球菌屬(Aerococcus)、細桿菌屬(Microbacterium)和丙酸菌屬(Propionibacterium)以及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)在本發明上下文中也被認為是LAB。工業上最有用的乳酸菌存在於乳球菌(Lactococcusspp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、乳桿菌(Lactobacillus spp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、雙歧桿菌(Bifdobacteriumspp.)和片球菌(Pediococcus spp.)中。除用於乳品加工業之外，乳酸菌培養物也可廣泛用於肉類加工業及許多其它加工業。
市售起子培養物可作為冷凍培養物來經銷。高濃縮冷凍培養物在市場上十分受歡迎，因為這樣的培養物能直接接種到發酵培養基(如乳品或肉類)中，無需居間轉移。換句話說，這樣的高濃縮冷凍培養物所包含的細菌量足夠最終用戶製造生產用起子培養物所需。在此「生產用起子」定義為在食品加工廠用於發酵培養基接種的繁殖用起子培養物。高濃縮培養物可稱為槽內直接凝固(direct vat set)(DVS)-培養物。為了在最終用戶處包含足夠量用作為DVS-培養物的細菌，濃縮的冷凍培養物一般至少重50g，並且含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克的活細菌。
在使用冷凍培養物實踐中，關鍵在於要方便培養物的實際操作。雖然培養物「整體」冷凍難以操作，但是對於生產者和消費者來說，已發現培養物顆粒冷凍是十分容易操作的。
因此，高濃縮顆粒冷凍培養物，即已成形的所謂冷凍的槽內直接凝固(F-DVS)-培養物十分暢銷。
出現了許多與冷凍培養物活性有關的出版物。
Chavarri等.(1988)描述了冷凍的純乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)培養物的活性可通過添加5％乳糖或5％蔗糖而得到改善。
Cárcoba等.(2000)描述了冷凍的純乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcuslactis subsp.lactis)培養物的活性可通過添加不同的低溫防護劑例如糖類(乳糖、蔗糖和海藻糖)、穀氨酸和明膠而得到改善。
US 4.140.800(Kline)描述了凍幹培養物的活性可通過添加不同的低溫保護劑而得到改善。也討論了添加了乳糖、蔗糖或麥芽糖的冷凍培養物的活性。
WO 00/39281(Kringelum等.)描述了非冷凍的液體起子培養物的活性可通過添加不同的低溫保護劑而得到改善，以及WO 2004/065584 A1(Bisgaard-Frantzen)描述了高濃縮冷凍起子培養物的活性可通過添加不同的低溫保護劑而得到改善。
只有WO 2004/065584A1描述了顆粒狀冷凍培養物，其它上述出版物則沒有涉及貯藏過程中顆粒狀冷凍培養物的物理穩定性。
發明概要市售顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物通常以合適的包裝(如2L四角紙盒)提供。一般貯藏在約-46℃的貯藏溫度下，冷凍物質以相對小重量的單個顆粒形式存在。
在本發明之前，本發明人認為就貯藏上述市售相關顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物來說，並不存在明顯的困難。
然而，基於不同的研究，本發明人確定當許多市售相關培養物在約-46℃下貯藏7天或更久時，單個顆粒粘在一起並形成較大的凝塊。在工業生產中，調節顆粒凝塊造成了處理上的困難。比如當培養物凝結成塊時，顯然從培養物包裝中就很難給予適當的用量。甚至還很難以便利的方法將凝結成塊的培養物從包裝中取出。
進一步的研究確定「出問題的」培養物的特徵可能在於顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物的Tm』值(冰開始融解，如Roos(1995)所定義的)低於約-46℃的貯藏溫度。該Tm』值是食品工業及其它工業所使用的標準物理化學術語。Tm』通常用Roos(1991)描述的差示掃描量熱法(DSC)技術測定。其與食品(在此為冷凍LAB培養物)開始融解的溫度有關。有關詳情請見作為參考文獻的教科書「Food Chemistry」Fennema(1996)和「PhaseTransition in Foods」Roos(1995)。
不受理論所限，相信當冷凍培養物具有低於其貯藏溫度如約-46℃的Tm』值時，出現初相轉變(融解)，造成了單個顆粒粘在一起並形成較大的凝塊。
總之，本發明人的工作已確定了迄今尚未認識到的貯藏問題，這些問題與某些類型市售相關高濃縮顆粒狀冷凍乳酸菌培養物的物理性質相關。一旦確定了此問題，本發明人就能開始嘗試解決該問題。
不依賴於任何可能的理論解釋，本發明人確定通過添加某些相關的添加劑化合物到出問題的顆粒狀冷凍培養物中，就能獲得在-46℃下貯藏7-14天後不會形成單個顆粒凝塊的顆粒狀冷凍培養物。這樣的培養物特徵在於，冷凍培養物的單個顆粒並不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，甚至在約-46℃下長期貯藏後亦然。
大體說來，相關的添加劑化合物特徵在於，它們能增加冷凍培養物Tm』值至高於貯藏溫度如-46℃的值，例如將-70至-46℃的Tm』值增加到-45至-15℃。
在此指導性的例子描述的是合適的添加劑化合物的優選例子。所述化合物包括海藻糖、麥芽糖糊精、環糊精、噴膠(spray gum)、魚膠粉和麥芽糖醇。基於本領域技術人員的常識，完全能確定其它能增加冷凍培養物Tm』值至高於貯藏溫度如-46℃的值的相關添加劑化合物。
如上所述，為了包含足夠的細菌，市售相關高濃縮冷凍培養物一般重至少50g且活細菌量至少為109個菌落形成單位(CRU)/克。Chavarri(1988)和Carcoba(2000)文章中所描述的培養物並不涉及顆粒狀冷凍培養物的物理穩定性，而且在其上下文中市售相關高濃縮冷凍培養物並不考慮冷凍細菌的活性，因為它們量很少且包含的是克數明顯較小的冷凍培養物，此外所述培養物也不是顆粒狀冷凍的培養物。同樣，Chavarri(1988)和Carcoba(2000)所描述的培養物根本就不涉及顆粒狀冷凍培養物的物理穩定性，反而涉及的是冷凍細菌的活性。
因此，本發明第一方面涉及市售相關包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物，該包裝具有至少重50g的冷凍物質，其中冷凍物質以單個顆粒的形式存在，含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌，並包含佔冷凍物質0.5％-13％w/w量的添加劑化合物。
所述添加劑化合物選自一化學物組，其通過使用佔冷凍物質10％w/w量的添加劑化合物能增加冷凍乳酸菌(LAB)培養物的Tm』(冰融解開始溫度)，所含有的添加劑化合物能將Tm』值從-70℃至-46℃增加到-45至-15℃(通過DSC測定)。
此外，所述冷凍乳酸菌(LAB)培養物特徵在於，當貯藏在約-46℃下7-14天時，該冷凍培養物的單個顆粒並不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，在此是通過下列測試來測定的冷凍培養物的單個顆粒在液氮中顆粒狀冷凍，將100個單個顆粒(約5-100g的顆粒)倒入培養皿中，從而形成了鬆散的、單個顆粒的薄層，該薄層特徵在於，大多數顆粒與其相鄰的一個或多個顆粒直接接觸，在約-46℃下放置7-14天並檢查顆粒是否仍然鬆散或顆粒是否凝結成塊或粘在一起，其中對於冷凍培養物的單個顆粒基本上保持為單個顆粒的判斷標準是至少100個單個顆粒中的80個保持為鬆散的單個顆粒。
然而，包含能利用蔗糖的LAB的冷凍乳酸菌(LAB)培養物，且其中所包含的低溫保護劑化合物選自佔冷凍物質2％-13％w/w量的蔗糖；和佔冷凍物質4％-6％w/w量的海藻糖；以及佔冷凍物質12％-14％w/w量的海藻糖/蔗糖混合物的培養物，均明確地從本發明第一方面中排除。
在第一方面結尾處所描述的「放棄」涉及PCT申請WO 2004/065584A1。該申請是在2004年1月19日提交的。在本申請優先權提交之時，PCT申請WO 2004/065584A1尚未公開。
WO 2004/065584A1涉及在冷凍培養物貯藏過程中改善其活性。其沒有描述本發明的「顆粒粘性」問題。大體上，主權利要求1涉及「包含能利用蔗糖的LAB的冷凍乳酸菌(LAB)培養物，具有至少重50g的冷凍物質並含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌，其特徵在於，所述冷凍培養物包含佔冷凍物質0.5％-80％w/w量的低溫保護劑。」雖然WO 2004/065584A1中描述了具有低溫保護劑的顆粒狀冷凍的培養物，但是可將本領域技術人員不可避免地得到的落入WO 2004/065584A1範圍的結果排除在外，因為WO 2004/065584A1僅明確要求保護能利用蔗糖的培養物。
關於本發明的冷凍培養物，所述添加劑化合物應當優選在它們凍結之前能添加到活細菌中。
因此，本發明第二方面涉及製造在此描述的本發明第一方面和實施方案的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物的方法，包括如下步驟(i)添加添加劑化合物到活細菌中以使至少50g的物質含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克物質的活細菌，所添加的添加劑化合物佔所述物質的0.5％-13％w/w量，(ii)冷凍所述物質以獲得顆粒狀冷凍的物質，和(iii)以合適的方式包裝所述冷凍物質以獲得包裝的在此描述的本發明第一方面和實施方案的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物。
本發明第三方面涉及通過本發明第二方面的製造顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物的方法獲得的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物。
本發明第四方面涉及上述顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物在製造食品或飼料產品方法中的應用。
定義在詳細討論本發明具體實施方案之前，提供了與本發明主要方面相關的特定術語定義。
術語「能利用蔗糖的LAB」指能發酵蔗糖產生酸的LAB。其與PCT申請號WO 2004/065584A1中的定義相同。
術語培養「物質」指培養相關物質，包括活細菌和低溫保護劑。並不包括可能存在的包裝。因此，培養物的物質重量不包括可能存在的包裝的重量。
術語「包裝(packing)」或「包裝(package)」應作廣義理解。其指顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物應當包裝以便提供給用戶，其可包裝在瓶、四角紙盒容器等中。
術語「添加劑化合物」在本發明上下文中可以是一種特定的添加劑化合物或可以是兩種或更多種不同的添加劑化合物。因此，培養物中添加劑化合物的w/w％應當理解為添加劑化合物量之和。優選地，該術語涉及發酵後添加到培養物中的化合物。因此，其可以是不以顯著量存在於培養物發酵液自身中的化合物。
術語「顆粒狀冷凍的」和「顆粒狀冷凍培養物」指通過利用能產生冷凍培養物顆粒或微粒的方法凍結的培養物。顆粒狀冷凍培養物可方便地通過將培養物逐滴地添加到液氮中形成凍結的培養物顆粒而製得。一般地，但不是必要的，該處理在常用的工業凍幹裝置塔盤上進行。
術語「顆粒(pellets)」或「微粒(granula)」指通過冷凍液體形成的小固體，平均尺寸為0.1-10mm。
本發明的實施方案描述如下，僅作為舉例。
圖1從該圖中可見冰融解開始發生的溫度Tm』與添加的二糖量之間的相關性。有關詳情見實施例3。打點線表示為貯藏溫度，-46℃。
圖2許多培養物冰融解開始的溫度(Tm』)(Y-軸)作為麥芽糖糊精(Glucidex 12)濃度(％w/w)(X-軸)的函數。培養物名稱後跟隨「A」表示已將甘油添加到培養物中，跟隨B表示在顆粒凍結前沒有將甘油添加到培養物中。
發明詳述Tm』值如上所述，Tm』值是已知的標準物理化學術語，描述的是冰融解開始發生時的溫度。在本發明上下文中，Tm』指冷凍LAB培養物開始發生融解時的溫度。
優選地，通過利用DSC方法測定Tm』值，該方法描述於本文實施例1中名為「Tm的測定」的段落。
顆粒凝結測試根據本發明第一方面的解釋，該測試要分析的是顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物是否這樣的培養物，即該培養物特徵在於當貯藏在約-46℃下(在當前情況下預調至-50℃的冷凍機具有-46℃的樣品溫度)7-14天時，在測試中冷凍培養物的單個顆粒並不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，包括如下冷凍培養物的單個顆粒在液氮中顆粒狀冷凍，將100個單個顆粒(約5-100g的顆粒)倒入培養皿中，從而形成了鬆散的、單個顆粒的薄層，該薄層特徵在於，大多數顆粒與其相鄰的一個或多個顆粒直接接觸，在約-46℃下放置7-14天並檢查顆粒是否仍然鬆散或顆粒是否凝結成塊或粘在一起，其中對於冷凍培養物的單個顆粒基本上保持為單個顆粒的判斷標準是至少100個單個顆粒中的80個保持為鬆散的單個顆粒。優選至少100個單個顆粒中的90個保持為鬆散的單個顆粒，更優選至少100個單個顆粒中的95個保持為鬆散的單個顆粒。
可目測檢查並計數保持為鬆散單個顆粒的單個顆粒。以一貫的方法進行目測是落在本領域技術人員能力範圍之內的，所得到的結果在正常的技術偏差限度內應當是一致且可重複的。本文的實施例1提供了更多的技術細節。
顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物優選地，術語「冷凍乳酸菌(LAB)培養物」在此指不包含所添加的添加劑化合物的培養物，如在此描述的具有-70至-46℃的Tm』值的培養物。該培養物可以顆粒或微粒的形式凍結，形成「顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物」。顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物可通過將培養物逐滴添加到液氮中形成凍結的培養物顆粒或微粒而方便地製得。
培養物的LAB可以是任意的LAB，特別是根據國際IDF標準146A1998「Identification of Characteristic Microorganisms」使用適當的API檢測試劑盒(bioMérieux SA，Lyon，France)測定的不利用蔗糖的市售相關LAB。對於大多數LAB屬使用API試劑盒「rapid ID 32STREP」和「50CHLMedium」確定蔗糖利用情況。
優選地，LAB是選自雙歧桿菌(Bifdobacterium spp.)、短桿菌(Brevibacterium spp.)、丙酸桿菌(Propionibacterium spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)包括乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳桿菌(Lactobacillus spp.)包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、片球菌(Pediococcus spp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)、酒球菌(Oenococcus spp.)和真菌包括青黴菌(Pencillium spp.)、隱球菌(Cryptococcus spp.)、Debraryomyces spp.、Klyveromyces spp.和酵母菌(Saccharomyces spp.)所組成的組。
即使這些屬中某些種被描述為能利用蔗糖突變體，但其不能利用蔗糖已分離或能持續地得到分離。無論這樣的突變體是否分離或獲得，它們依然是本發明的一方面。
工業上最有用的乳酸菌存在於乳球菌(Lactococcus spp.)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcus spp.)、乳桿菌(Lactobacillusspp.)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)和片球菌(Pediococcus spp.)中。
術語「混合乳酸菌(LAB)培養物」指包含兩種或更多種不同LAB的混合培養物。術語「純乳酸菌(LAB)培養物」指僅包含一種LAB的純培養物。
在此描述的培養物可以是嗜溫培養物，由具有約為30℃最適生長溫度的嗜溫細菌組成。「嗜溫培養物」是包含兩種或更多種不同的嗜溫LAB的培養物。
屬於嗜溫群的典型微生物包括乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、腸繫膜明串珠菌乳脂亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis和乾酪乳桿菌乾酪亞種(Lactobacillus casei subsp.casei)。嗜熱乳酸菌包括例如嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。
在此描述的培養物可包含不能利用蔗糖的LAB。所謂的氧-培養物(O-culture)用來製造不帶孔洞的乾酪(切達乾酪、柴郡乾酪、羊奶乾酪)且一般包括一種或多種選自乳酸乳桿菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳桿菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)的微生物。通常氧-培養物被認為是不利用蔗糖的。
高濃縮顆粒狀冷凍乳酸菌培養物在此描述的冷凍培養物在食品工業中可稱為高濃縮顆粒狀冷凍乳酸菌培養物。為了包含足夠的細菌，這樣的培養物應當相對大(具有足夠的重量)以及具有相對高的活細菌濃度。顯然如果要求相對多的細菌，那麼活細菌的重量和/或濃度就要增加。
優選地，在此描述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物具有至少100g重的冷凍物質，更優選地具有至少250g重的冷凍物質，還優選地具有至少500g重的冷凍物質，以及最優選地具有至少900g重的冷凍物質。優選地，冷凍物質的重量小於500kg。
優選地，在此描述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物含有至少5×109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌，更優選地含有至少1010個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌，以及最優選地含有至少2×1010個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌。
用於LAB的發酵和合適的發酵培養基為本領域所公知，並且本領域技術人員能選擇與特定LAB相關的合適的培養基和發酵條件。在本文的實施例部分中給出了合適的培養基和發酵。
為了得到足夠量的細菌，在本發明上下文中優選在合適的大發酵罐中進行相對大規模的發酵。發酵罐優選至少50L，更優選至少90L，還優選500L或更大的。
在合適的發酵後，優選通過除去發酵培養基的液體(上清液)(如通過離心)分離獲得活細菌。所分離的活細菌可稱為分離生物量。該分離的活細菌應優選含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌，更優選含有至少5×109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌，以及最優選含有至少1010個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌。
在添加劑化合物(見以下)添加到濃縮培養物中後。培養物可方便地通過將混合物逐滴地添加到液氮中形成凍結的混合物顆粒或微粒而凍結。一種可行的冷凍方法描述於DE2805676和FR2393251中。
然後以合適的方式包裝顆粒狀冷凍培養物以便提供給用戶。
添加劑化合物如上所述，優選地相關的添加劑化合物特徵在於，它們能增加冷凍培養物的Tm』值至高於貯藏溫度如-46℃的值，例如使Tm』值達到-45℃至-15℃，更優選地使Tm』值達到-43℃至-15℃，以及還優選地使Tm』值達到-39℃至-15℃。
本文實施例2舉例說明了一種用於鑑定相關添加劑化合物的快速實驗策略。添加不同的相關化合物(10％W/W)到具有低於-46℃的Tm』值的「模式」冷凍培養物(在實施例2中，「模式」培養物具有-54℃的Tm』值)中，並在添加前後通過DSC測定Tm』值。
實施例2的「模式」培養物和該實施例2的測試方法優選地用於評估是否特定的目的添加劑化合物其特徵在於，即能增加冷凍培養物的Tm』值至高於-46℃，例如使Tm』值達到-45℃至-15℃，更優選使Tm』值達到-43℃至-15℃，還優選使Tm』值達到-39℃至-15℃。
在實施例2中，可見環糊精增加Tm』至-44℃，麥芽糖醇增加Tm』至-42℃，海藻糖增加Tm』至-38℃，魚膠增加Tm』至-37℃，麥芽糖糊精增加Tm』至-32℃以及噴膠增加Tm』至-31℃。
優選地，添加劑化合物是分子量(MW)在150-100000g/mol，更優選地在250-100000g/mol，還優選地在300-40000g/mol以及最優選地在500-15000g/mol的化合物。
在優選的實施方案中，所述添加劑化合物也是低溫保護劑。
術語「低溫保護劑」指能改善冷凍培養物貯藏穩定性的物質，該貯藏穩定性測自培養物的活性。在本發明上下文中，其可以是一種特定的低溫保護劑或可以是兩種或更多種不同的低溫保護劑。因此，在培養物中的低溫保護劑w/w％應當理解為低溫保護劑量之和。
優選地，低溫保護劑可選自蛋白質或蛋白質水解產物。優選的合適例子包括選自麥芽提取物、脫脂奶粉、乳清粉、酵母提取物、谷蛋白、膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、角蛋白和白蛋白的水解產物所組成的組。
更優選地，低溫保護劑是碳水化合物或涉及核酸生物合成的化合物。優選的合適碳水化合物包括選自戊糖(如核糖、木糖)、己糖(如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(如蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳果糖)、寡糖(如棉子糖)、低聚果糖(Oligofrutoses)(如Actilight、Fribroloses)、多糖(如麥芽糖糊精、黃原膠、果膠、藻酸鹽、微晶纖維素、葡聚糖、PEG)以及糖醇(山梨糖醇、甘露醇)所組成的組。最優選地，所述碳水化合物為分子量(MW)在150-100000g/mol，更優選在250-100000g/mol，還優選在300-40000g/mol以及最優選在500-15000g/mol。
在特別優選的實施方案中，所述添加劑化合物為選自環糊精、麥芽糖醇、魚膠、麥芽糖糊精(優選為麥芽糖糊精DE2至麥芽糖糊精DE 19)、噴膠(如噴膠IRX 51693)、肌苷-5』-一磷酸(IMP)以及肌苷所組成的組。
冷凍培養物包含佔冷凍物質0.5％-13％w/w量的添加劑化合物，優選包含佔冷凍物質1％-12％w/w量的添加劑化合物，更優選包含佔冷凍物質2％-10％w/w量的添加劑化合物，以及還優選包含佔冷凍物質5％-10％w/w量的添加劑化合物。
可通過在合適的溫度下將固體添加劑化合物與生物量混合如30分鐘，以將添加劑化合物，也可以是低溫保護劑，在發酵後添加到分離的活細菌(生物量)中。如果添加劑化合物是例如麥芽糖糊精的，則合適的溫度可以是室溫。或者，添加劑化合物的無菌溶液可與生物量混合。
製備顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物的方法如上所述，本發明第二方面涉及製造本發明第一方面的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物的方法，包括如下步驟(i)添加添加劑化合物到活細菌中以使至少50g的物質含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克物質的活細菌，所添加的添加劑化合物佔所述物質的0.5％-13％w/w量，
(ii)冷凍所述物質以獲得顆粒狀冷凍的物質，和(iii)以合適的方式包裝所述顆粒狀冷凍物質。
如上所述，在此最相關的「出問題的」培養物是顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物，其並不包含在此所述添加的添加劑化合物，具有-70℃至-46℃的Tm』值。
因此，在一個優選的實施方案中，在根據上述步驟(i)添加添加劑化合物之前，測定不含添加劑化合物的冷凍乳酸菌(LAB)培養物的Tm』值並確定其具有-70℃至-46℃或更低的Tm』值。
在根據上述步驟(i)添加添加劑化合物之前，進行顆粒凝結測試(見上)並確定冷凍培養物的單個顆粒在-46℃下貯藏時粘在一起。
優選地，在添加了添加劑化合物後，測定包含添加劑化合物的冷凍的乳酸菌(LAB)培養物的Tm』值，並證實Tm』值高於-46℃，優選在-45℃至-15℃，更優選在-43℃至-15℃，以及還優選在-39℃至-15℃。
最後，在添加了添加劑化合物後，培養物呈顆粒狀冷凍，並進行顆粒凝結測試(見上)確保至少100個單個顆粒中的80個保持為鬆散的、單個顆粒。
冷凍乳酸菌(LAB)培養物的應用根據現有技術，在此描述的冷凍的乳酸菌(LAB)培養物可用於加工製造食品或飼料產品過程。
具體實施例方式
實施例1R604-E(一種市售冷凍氧-培養物，Chr.Hansen A/S，Denmark)在冷凍貯藏過程中傾向於形成粘性顆粒。在本發明研究中，該問題是通過在更詳細地觀察融解溫度並設法通過添加酪蛋白酸鹽、蔗糖或麥芽糖糊精以增加融解溫度而得到處理的。
目的評估通過使用添加劑是否能增加F-DVS R604-E的融點。
評估了使用添加劑增加R604-E融點的效果目測，以及通過DSC對每個所測試的製劑測定Tm』。
i)材料2千克的市售培養物F-DVS R 604-E(Chr.Hansen A/S，Hoersholm，Denmark，批次2441258，產品編號616581)。
ii)用於增加製劑融點的添加劑溶液50％(w/w)蔗糖溶液(Danisco，Denmark).
10％(w/w)酪蛋白酸鈉鹽溶液(Arla，Denmark).
30％(w/w)麥芽糖糊精DE 10溶液(Glucidex 10，Roquette Frères，Lestrem，France).
30％(w/w)麥芽糖糊精DE 2溶液(Glucidex 2，Roquette Frères，Lestrem，France)。
iii)F-DVS R604-E製劑配方將冷凍的濃縮物解凍並根據表1與添加劑混合。
表1.R604-E製劑
*)g乾物質添加劑/g濃縮物目測評估F-DVS R604融點6種F-DVS R-604E製劑在液氮中呈顆粒狀冷凍，並將100個單個顆粒(約20-30g)的顆粒物倒入培養皿中，從而形成了鬆散的、單個顆粒的薄層。
將每種製劑的一個樣品置於預調為-50℃的冷凍機中，樣品的實際溫度為-46℃。貯藏7天後，檢查樣品是否仍然鬆散或是否顆粒已經凝結成塊或看上去有粘性，以及如果在有粘性的情況下能否通過振動自發地再成為鬆散顆粒。
表2.目測冷凍顆粒物並測定Tm』
-＝凝結成塊、結塊或帶粘性。(100個單個顆粒中不到20個保持為鬆散單個顆粒)+＝部分鬆散的顆粒。(100個單個顆粒中不到60個保持為鬆散單個顆粒)++＝幾乎是鬆散的顆粒。(100個單個顆粒中至少80個保持為鬆散單個顆粒)+++＝鬆散的顆粒(100個單個顆粒中至少90個保持為鬆散單個顆粒)Tm』的測定在100μL氧化鋁坩堝中製備樣品並在液氮中凍結。將每種製劑的一個樣品以及F-DVS R604置於-46℃下6天。
在帶有100μL氧化鋁坩堝的Mettler Toledo 822e差示掃描量熱儀(aDSC)上測定相變，溫度程序，放入溫度-90℃，掃描溫度程序5℃/min.-130℃至0℃。
測定Tm』值(冰融解開始，如Roos(1995)所定義的)。結果示於表2中。
我們觀察到使用＞6％蔗糖和6％麥芽糖糊精(2或10)增加了冷凍顆粒的Tm』值。對於酪蛋白酸鈉鹽沒有觀察到任何效果。根據目測，10％蔗糖和兩種不同的麥芽糖糊精顯示出抗形成粘性顆粒傾向的積極效果。
實施例2目的進行篩選研究以確定何種添加劑能增加冷凍培養物的融點。測試了如下添加劑海藻糖、麥芽糖糊精12、環糊精、噴膠、PEG、魚膠、麥芽糖醇、氯化鈉、甘油i)材料F-DVS R 604-E(批次2471755，產品編號616581)，詳細資料請見實施例1。
ii)用於製劑以增加融點的添加劑溶液50％(w/w)海藻糖30％(w/w)麥芽糖糊精DE 12(Glucidex 12，Roquette Frères，Lestrem，France)30％(w/w)環糊精30％(w/w)噴膠(CNI的IRX 51693)30％(w/w)PEG(PEG 6000，Merck，Germany)30％(w/w)魚膠粉200(SKW Biosystems，France)30％(w/w)麥芽糖醇30％(w/w)氯化鈉
30％(w/w)甘油iii)F-DVS R604-E製劑配方將冷凍的F-DVS R604-E濃縮物解凍並與佔最終製劑10％(W/W)的不同添加劑混合。
Tm』的測定在100μL氧化鋁坩堝中製備樣品並在液氮中凍結。在Mettler Toledo822e差示掃描量熱儀記錄9種製劑的相變曲線並與參考樣品(無添加劑的R604E)比較。樣品在-90℃下放入DSC，並運行在溫度程序放入溫度-90℃；溫度掃描7℃/min從-130℃至0℃下。
結果獲得相變曲線，利用Roos(1991)所述的方法測定了Tm』值，並在下表3中給出表3.觀測到的Tm』(℃)
參考樣品的Tm』為-54℃(冰融解的開始)。
如下添加劑增加了Tm』PEG(-53℃)，，環糊精(-44℃)，麥芽糖醇(-42℃)，海藻糖(-38℃)，
魚膠(-37℃)，麥芽糖糊精12(-32℃)，噴膠(-31℃)甘油和氯化鈉並沒有增加冷凍培養物顆粒的融點。
實施例3該試驗主要評估了添加劑量和在DSC上測定的Tm』增加之間的關係。
i)材料F-DVS CH N 19(批次2421868)(市售冷凍的LD-培養物，Chr.HansenA/S，Denmark)。
表4.利用蔗糖和海藻糖作為添加劑的CH N19製劑
ii)用於製劑以增加融點的添加劑溶液每克生物量的蔗糖濃度在3％(w/w)至13％(w/w)之間。僅測試5％(w/w)水平的海藻糖。所有的蔗糖濃度從添加到生物量的50％(w/w)蔗糖溶製備。
海藻糖濃度從40％(w/w)溶液製備。
Tm』的測定將冷凍的F-DVS R604-E濃縮物解凍並與表4中所顯示的不同添加劑混合。然後將樣品轉移到100μL氧化鋁坩堝中並在液氮中凍結，在分析前貯藏在-46℃下。在DSC上對8種製劑記錄相變曲線並與參考樣品(無添加劑的R604E)比較。樣品在-90℃下放入DSC，並利用溫度程序運行放入溫度-90℃溫度掃描5℃/min.-130℃至0℃下。
根據Tm』的這些相變曲線。Tm』和添加的二糖量之間的關係可見於圖1。
根據圖1，可見8％及更多的蔗糖能保證在-46℃下貯藏的冷凍培養物不發生融解。
實施例4在添加麥芽糖糊精(Glucidex 12，購自Roquette Frères，Lestrem，France)前後，分析購自Chr.Hansen A/S，Denmark的市售培養物(HP，HPS，HP-1，LP，LL-2)的初始融點。該產品是以冷凍顆粒物出售的，保證其初始融點高於貯藏溫度，因此應當保持鬆散。
目的本研究的目的在於增加初始融點以高於貯藏溫度，以便獲得鬆散的顆粒。
材料和方法i)材料Glucidex 12(Roquette Frères，Lestrem，France)用作為添加劑化合物。
使用了100g的列於表5中的每種培養物。B表示沒有添加甘油到培養物中，而A表示在顆粒凍結前已添加了10％v/v甘油。
表5.使用的培養物
ii)樣品製劑配方將冷凍的濃縮培養物解凍並與佔最終製劑3.5％至10.1％(W/W)的不同量的Glucidex 12溶液混合。
所述不同的製劑列於表6。
iii)Tm』的測定在100μL氧化鋁坩堝中製備樣品。在Mettlet DSC上對所有的製劑記錄相變曲線。樣品在-90℃下放入DSC。掃描溫度程序7℃/min.-100℃至0℃。
iiii)目測評估F-DVS R604的融點製劑在液氮中呈顆粒狀冷凍，並將100個單個顆粒(約20-30g)顆粒物倒入培養皿中，從而形成了鬆散的、單個顆粒的薄層。將每種製劑的一個樣品置於-46℃下。貯藏14天後，檢查樣品是否仍然鬆散或顆粒是否凝結成塊或看上去有粘性，以及如果在有粘性的情況下能否通過振動自發地再成為鬆散顆粒。
結果添加不同量麥芽糖糊精(Glucidex 12)到不同培養物中的結果如圖1所示。很清楚麥芽糖糊精濃度增加，Tm』也增加。表2中列出了評估粘性/凝結成塊的結果。具有高於-46℃貯藏溫度的Tm』的樣品是鬆散的顆粒，而具有低於-46℃貯藏溫度的Tm』的樣品則粘在一起。
表6樣品製劑、起始融解溫度(Tm』)以及冷凍顆粒目測結果
表格注釋-表示凝結成塊、結塊或帶粘性(100個單個顆粒中不到20個保持為鬆散單個顆粒)。
+++表示鬆散的顆粒(100個單個顆粒中至少90個保持為鬆散單個顆粒)。
結果闡明於表6和圖2中，表明麥芽糖糊精能有效地增加含10％v/v甘油培養物(A-系列)和不含甘油培養物(B-系列)的Tm』。該實驗進一步證明了眾所周知的低溫保護劑(即甘油)在顆粒狀冷凍的培養物貯藏過程中並不能用於增加其物理穩定性。
參考文獻Carcoba，R.等，「Influence of cryoprotectants on the viability and acidifyngactivity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcuslactis subsp.lactis CECT 5180」，Eur Food Res Technol(2000)211，433-437Chavarri，F.J.等，「Cryoprotective agents for frozen concentrated starters fromnon-bitter Streptococcus Lactis strains」，Biotechnology letters，vol 10，1，11-16(1988)DE2805676，(Jespersen等)，1978年8月18日Fennema O.R.(編)Food Chemistry，第3版.Marcel Dekker，1067pp.(ISBN0-8247-9346-3)，1996.
FR2393251，(Jespersen等)，1978年12月29日IDF(1998)，International IDF Standard 146A1998「Identification ofCharacteristic Microorganisms」.
Roos，Y.和M.Karel(1991)Phase transitions of amorphous sucrose and frozensucrose solutions.J.Food Science，56266-267.
ROOS，Y.Phase Transition in Foods.ACADEMIC PRESS，New York，USA.360pp.，(ISBN0-12-595340-2)，1995.
US 4,140,800(Leo Kline)1979年2月20日WO 00/39281(Kringelum等)2000年7月6日WO 2004/065584A1(Bisgaard-Frantzen等)2004年8月5日(與國際申請號PCT/DK2004/000025同族)
權利要求
1.一種市售相關包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物，所述包裝具有至少重50g的冷凍物質，其中冷凍物質以單個顆粒的形式存在，含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克冷凍物質的活細菌，並包含佔冷凍物質0.5％-13％w/w量的添加劑化合物，其中所述添加劑化合物選自化合物組，通過使用佔冷凍物質10％w/w量的添加劑化合物能增加冷凍乳酸菌(LAB)培養物的Tm』(冰融解開始溫度)至高於-46℃，例如-45至-15℃(通過DSC測定)，所述冷凍乳酸菌(LAB)培養物不含有添加劑化合物，具有-70℃至-46℃的Tm』值，以及其中所述冷凍乳酸菌(LAB)培養物其特徵在於，當貯藏在約-46℃下7-14天時，所述冷凍培養物的單個顆粒並不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒，在此是通過下列測試來測定的冷凍培養物單個顆粒在液氮中顆粒狀冷凍，將100個單個顆粒(約5-100g的顆粒)倒入培養皿中，從而形成了鬆散的、單個顆粒的薄層，該薄層特徵在於，大多數顆粒與其相鄰的一個或多個顆粒直接接觸，在約-46℃下放置7-14天並檢查顆粒是否仍然鬆散或顆粒是否凝結成塊或粘在一起，其中用於冷凍培養物的單個顆粒基本上保持為單個顆粒的判斷標準是至少100個單個顆粒中的80個保持為鬆散的單個顆粒，排除了包含能利用蔗糖的LAB的冷凍乳酸菌(LAB)培養物，其中培養物包含的低溫保護劑化合物選自佔冷凍物質2％-13％w/w量的蔗糖，和佔冷凍物質4％-6％w/w量的海藻糖，以及佔冷凍物質13％w/w量的海藻糖/蔗糖混合物所組成的組。
2.權利要求1所述的顆粒狀冷凍培養物，其中所述培養物是由具有在約30℃最適生長溫度的嗜溫細菌組成的混合的嗜溫培養物。
3.權利要求1或2所述的顆粒狀冷凍培養物，其中所述LAB是選自包括雙歧桿菌(Bifdobacterium spp.)、短桿菌(Brevibacterium spp.)、丙酸桿菌(Propionibacterium spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)包括乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactis subsp.cremoris)、乳桿菌(Lactobacillus spp.)包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、鏈球菌(Streptococcus spp.)、腸球菌(Enterococcusspp.)、片球菌(Pediococcus spp.)、酒球菌(Oenococcus spp.)和真菌包括青黴菌(Pencillium spp.)、隱球菌(Cryptococcus spp.)、Debraryomyces spp.、Klyveromyces spp.和酵母菌(Saccharomyces spp.)的組。
4.前述權利要求任一所述的顆粒狀冷凍培養物，其中根據權利要求1不含有添加劑化合物的所述冷凍乳酸菌(LAB)培養物具有-70℃至-46℃的Tm』值。
5.前述權利要求任一所述的顆粒狀冷凍培養物，其中所述冷凍乳酸菌培養物包含佔冷凍物5％-10％w/w量的添加劑化合物。
6.前述權利要求任一所述的顆粒狀冷凍培養物，其中所述添加劑化合物選自環糊精、麥芽糖醇、海藻糖、魚膠、麥芽糖糊精、酵母提取物和噴膠所組成的組。
7.一種製造權利要求1-6任一所述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物的方法，包括如下步驟(i)添加添加劑化合物到活細菌中以使至少50g的物質含有至少109個菌落形成單位(CFU)/克物質的活細菌，所添加的添加劑化合物佔所述物質的0.5％-13％w/w量；(ii)冷凍所述物質以獲得顆粒狀冷凍物；和(iii)以合適的方式包裝所述冷凍物以獲得包裝的如權利要求1-6任一所述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物。
8.權利要求7所述的方法，其中在根據權利要求7步驟(i)添加添加劑化合物之前，測定不含添加劑化合物的冷凍乳酸菌(LAB)培養物的Tm』值並確定其具有-70℃至-46℃的Tm』值；以及在添加了添加劑化合物後，測定包含添加劑化合物的冷凍乳酸菌(LAB)培養物的Tm』值，並證實Tm』值在-49℃至-15℃，更優選在-39℃至-15℃。
9.一種通過權利要求7或8所述製造冷凍乳酸菌(LAB)培養物的方法獲得的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物。
10.權利要求1-6和9任一所述的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物在製造食品或飼料產品方法中的應用。
全文摘要
一種市售相關包裝的顆粒狀冷凍乳酸菌(LAB)培養物，該包裝具有至少重50g的冷凍物質，其中冷凍物質以單個顆粒的形式存在，特徵在於，當在－46℃下貯藏7－14天時，冷凍培養物的單個顆粒並不粘在一起，因此基本上保持為單個顆粒。
文檔編號C12N1/04GK1922305SQ200580005638
公開日2007年2月28日 申請日期2005年2月24日 優先權日2004年2月24日
發明者裡克·斯達溫斯伯格, 英吉·奈普, 漢斯·比斯哥德－弗蘭森 申請人:科·漢森有限公司