用於高產l-乳酸的米根黴原生質體的製備與再生方法
2023-05-29 18:24:21
專利名稱：用於高產l-乳酸的米根黴原生質體的製備與再生方法
技術領域：
本發明屬於細胞工程中真菌原生質體製備與再生技術領域，具體涉及米根黴原生 質體製備與再生技術。
背景技術：
乳酸是一種重要的多用途有機酸，為三大有機酸之一，尤其是L-乳酸，以其獨特 的構型優勢，展示了廣泛的應用前景。L-乳酸廣泛存在於植物與生物體內，在食品、醫藥、飼 料、化工等領域有重要的應用。近年來，隨著聚乳酸的發展和應用，L-乳酸的需求量越來越 大。米根黴菌發酵營養要求低，可直接利用澱粉無須糖化處理；耐低PH值，產物為高光學純 度的L-乳酸，菌體大，容易分離，利於製得高品質產品且節省發酵成本。但是，目前米根黴 產L-乳酸方法仍然存在發酵強度不高的缺點。主要原因是在利用米根黴發酵生產L-乳 酸的過程中，目標產物L-乳酸積累的抑制作用限制其生產強度和濃度進一步提高。通過微 生物育種選育高產L-乳酸的米根黴菌株是進一步的研究方向。傳統的菌株改良技術是採 用物理、化學或生物學誘變方法處理出發菌株，以隨機方式選育得到性能優異的變異菌株， 其缺點是誘變劑所誘發的遺傳性狀的改變是隨機的，篩選正向突變的工作量較大。原生質 體技術，特別是原生質體融合，不僅可以在親緣關係較遠的雙親間進行遺傳物質的重組，還 可以在種內進行基因的重組，並且種內基因的重組更容易進行。將米根黴通過不同方法誘 變得到的耐酸突變株進行原生質體融合雜交，得到可以緩解產物抑制的L-乳酸高產耐酸 融合菌株。原生質體製備和再生是進行融合的前提條件和關鍵技術。因此，米根黴原生質 體的製備與再生技術具有重要的理論與實用價值。
發明內容
為了進行高產L-乳酸菌米根黴原生質體的製備及再生，本發明提供一種操作簡 便、成本低的用於高產L-乳酸的米根黴原生質體的製備與再生方法。本發明的具體操作步驟如下
用於高產L-乳酸的米根黴原生質體的製備與再生方法包括下列操作步驟
A、製備米根黴孢子懸液
挑取米根黴AS3. 8190%辦0/7狀oryzae AS3. 819)菌絲一環，接種在由50mL馬鈴薯葡萄 糖瓊脂(PDA)培養基製成的固體斜面上，在溫度32°C、培養72 h，得到含有成熟米根黴孢子 的菌絲，加入30 mL無菌蒸餾水洗孢子，得到含有孢子團塊的孢子液，將該孢子液振蕩打碎 孢子團塊，過濾，取濾液進行倍比稀釋，顯微鏡下計數，得到成熟米根黴孢子濃度在1 X IO6 個/mL的米根黴孢子懸液；
B、製備種子培養液
將2 mL米根黴孢子懸液接種至20 mL種子培養基中，控制搖床轉速200 r/min，溫度 32°C培養18 h，得到種子培養液；
所述種子培養基由下列重量配比的物質組成葡萄糖100 g/L，硫酸銨4 g/L，磷酸二
3氫鉀0.2 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，硫酸鋅0.44 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L ；
C、製備菌絲懸液
取5 mL種子培養液，溫度25°C、轉速4000 r/min、離心分離10 min，將菌絲與培養基分 離；棄上清液，用4 mL濃度0.6 mol/L的氯化鈉溶液洗滌菌絲2次；棄上清液，用1 mL濃度 6 mol/L的氯化鈉緩衝液重懸，得到菌絲懸液；
D、酶解細胞壁
取ImL菌絲懸液，加入ImL濃度1. 5%的混合酶液，溫度35°C輕微振蕩酶解2 h ；加入 ImL滲透壓穩定劑終止酶解反應，得酶解溶液；
所述濃度1.5%混合酶液由下列重量配比的物質組成纖維素酶15g/L、蝸牛酶15 g/ L、溶壁酶15 g/L、溶劑為0.6 mol / L的氯化鈉緩衝溶液，配置好後於4000 r/min，離心 15 min，收集上清液，用直徑為0.45 μ m的超微微孔濾膜過濾除菌； 所述滲透壓穩定劑為濃度0. 6 mol/L的氯化鈉緩衝液；
E、原生質體分離
過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液於溫度4°C、轉速500r/min、離心分離 15min ；棄上清液，用1 2mL濃度0. 6mol/L的氯化鈉溶液洗滌1次，收集原生質體重懸於 ImL濃度0. 6 mol/L的氯化鈉溶液中保存，得到原生質體懸液；
F、原生質體再生
將原生質體懸液用濃度0.6 mol/L的氯化鈉溶液梯度稀釋100倍，取稀釋液0. 1 mL分 別塗布於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板；溫度32°C、保 持相對溼度大於60%、光照培養12 h，直至長出直徑0. 5 Imm白色再生菌落；
上述高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基由下列重量配比的物質組成馬鈴薯200 g/ L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L，氯化鈉35. 1 g/L。本發明所述方法製備的米根黴原生質體大小均一，形態近似圓形，原生質體製備 數較高。微生物生理狀態是原生質體化的重要影響因素之一。絲狀真菌由於其結構的特 點，原生質體的分離有其獨特之處，早期形成的原生質體來自菌絲尖端，這些原生質體往往 缺少細胞核，再生較困難；後期形成的原生質體來自遠區細胞，形成的原生質體不均一。因 此本發明採用孢子接種，在孢子生長為菌絲(即種子培養)的對數生長期(18 h)選擇年輕菌 絲和頂端菌絲製備原生質體，為較高的原生質體化提供保證。本發明所述方法菌絲細胞的原生質體化較高，獲得的原生質體活力較高。水解酶 的選擇對菌絲細胞壁的酶解效果影響很大，從而影響後期原生質體的製備質量。同時原生 質體因為酶解脫去了細胞壁，對外界環境特別是對滲透壓會變得非常敏感。因此滲透壓穩 定劑的種類及其濃度的選擇對菌絲體原生質體的形成，尤其是對再生率的提高非常重要。 必須在一定濃度的高滲溶液中進行酶解、破壁，才能形成和保持穩定的原生質體，從而獲得 高製備數，並提高後期的再生率。本發明選用0.6mol/L的氯化鈉作為滲透壓穩定劑，水解 酶由蝸牛酶、纖維素酶、溶壁酶按一定比例混合而成。有力的保障了較多原生質體製備數及 較高的再生率。本發明所述方法採用高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養基作為再生平 板，提高了原生質體的再生率。本發明所述方法製備的米根黴原生質體製備數最高能達到 2. 74 X IO6個/mL,再生率最高為6. 8%。與超聲波法原生質體製備方法相比較，本發明所述方法易於操作，對設備要求低，同時酶解時間及再生周期短，有效提高了原生質體製備及再生的效率。本發明所述米根黴原生質體製備及再生方法原生質體製備數高，再生率較高，是 米根黴原生質體製備及再生的可靠方法，並為黴菌原生質體製備及再生提供技術參考。本 發明為原生質體的製備與再生提供了一種具有實際意義操作方法。利用本發明製備的原生 質體完全滿足原生質體融合的要求，為進一步的採用原生質體融合技術提高米根黴發酵生 產L-乳酸的發酵強度提供了基礎。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步地描述。實施例
用於高產L-乳酸的米根黴原生質體的製備與再生方法的操作步驟如下
A、製備米根黴孢子懸液
用接種環挑取保藏的米根黴AS3. 819 (.Rhizopus oryzae AS3. 819)菌絲一環，接種至 裝在100 mL三角瓶裡由50mL PDA培養基製成的固體斜面上，在32°C恆溫培養箱中培養72 h，得到含有成熟米根黴孢子的菌絲一瓶，加入30 mL無菌蒸餾水洗孢子，得到含有孢子團塊 的孢子液，將該孢子液倒入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩打碎孢子團塊，用4層無菌高 級擦鏡紙過濾，取濾液進行倍比稀釋，顯微鏡下計數，使孢子終濃度為1 X IO6個孢子/mL，得 到成熟米根黴孢子濃度在1 X IO6個/mL的孢子懸液；
上述PDA培養基由下列重量配比的物質組成馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20
g/L ；
B、製備種子培養液
將A中得到的米根黴孢子懸液2 mL接種至裝有20 mL種子培養基的100 mL三角瓶中， 控制搖床轉速200r/min，溫度32°C培養18h，得到種子培養液；
上述種子培養基由下列重量配比的物質組成葡萄糖100g/L，硫酸銨4g/L，磷酸二氫 鉀0. 2g/L，硫酸鎂0. 25g/L，硫酸鋅0. 44g/L，硫酸亞鐵0. 01 g/L ；
C、製備菌絲懸液
取B中製得的種子培養液5mL於10 mL離心管中，然後25°C，4000 r/min，離心10 min， 將菌絲與培養基分離；棄上清液，用4mL的0. 6 mol/L的氯化鈉溶液洗滌2次；棄上清液，用 ImL的0. 6 mol/L的氯化鈉緩衝液重懸，得到菌絲懸液；
D、酶解細胞壁
取C中製得的菌絲懸液lmL，加入1. 5%混合酶液(纖維素酶+蝸牛酶+溶壁酶)lmL，35°C 輕微振蕩酶解池。酶解結束後，加入ImL的滲透壓穩定劑終止酶解反應。得酶解溶液；
上述混合酶液由下列重量配比的物質組成纖維素酶15g/L、蝸牛酶15g/L、溶壁酶 15g/L、溶劑為0. 6mol/L的氯化鈉緩衝溶液，配置後於轉速4000r/min、離心分離15 min，收 集上清液，用直徑為0. 45 μ m的超微微孔濾膜過濾除菌； 上述滲透壓穩定劑為0. 6 mol/L的氯化鈉緩衝液；
E、原生質體分離
用4層無菌高級擦鏡紙過濾D中得到的酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液於溫 度4°C、轉速500r/min、離心分離15min ；棄上清液，用1 2mL濃度0. 6mol/L的氯化鈉溶液洗滌1次，收集原生質體重懸於1 mL濃度0.6 mol/L的氯化鈉溶液中保存，得到原生質 體懸液；
F、原生質體再生
將E中得到的原生質體懸液，用濃度0. 6 mol/L的氯化鈉溶液梯度稀釋100倍，顯微鏡 下計數，並取該稀釋液0. 1 mL分別塗布於PDA平板和高滲PDA平板。溫度32°C、保持相對 溼度大於60%、光照培養12 h，直至長出直徑0.5 1 mm白色再生菌落，計算再生率；
上述PDA培養基由下列重量配比的物質組成馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20
g/L ；
上述高滲PDA培養基由下列重量配比的物質組成馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊 脂 20 g/L、氯化鈉 35. 1 g/L。 上述計算再生率的公式為再生率(％ )=(高滲PDA上的菌落數-PDA上的菌落 數)/顯微鏡計數原生質體數X 100%。
權利要求
1.用於高產L-乳酸的米根黴原生質體的製備與再生方法，其特徵在於包括下列操作 步驟A、製備米根黴孢子懸液挑取米根黴orj^^菌絲一環，接種在由50mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基製成 的固體斜面上，在溫度32°C、培養72 h，得到含有成熟米根黴孢子的菌絲，加入30 mL無菌蒸 餾水洗孢子，得到含有孢子團塊的孢子液，將該孢子液振蕩打碎孢子團塊，過濾，取濾液進 行倍比稀釋，顯微鏡下計數，得到成熟米根黴孢子濃度在1 X IO6個/mL的米根黴孢子懸液；B、製備種子培養液將2 mL米根黴孢子懸液接種至20 mL種子培養基中，控制搖床轉速200 r/min，溫度 32°C培養18 h，得到種子培養液；所述種子培養基由下列重量配比的物質組成葡萄糖100 g/L，硫酸銨4 g/L，磷酸二 氫鉀0.2 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，硫酸鋅0.44 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L ；C、製備菌絲懸液取5 mL種子培養液，溫度25°C、轉速4000 r/min、離心分離10 min，將菌絲與培養基分 離；棄上清液，用4 mL濃度0.6 mol/L的氯化鈉溶液洗滌菌絲2次；棄上清液，用1 mL濃度 6 mol/L的氯化鈉緩衝液重懸，得到菌絲懸液；D、酶解細胞壁取ImL菌絲懸液，加入ImL濃度1. 5%的混合酶液，溫度35°C輕微振蕩酶解2 h ；加入 ImL滲透壓穩定劑終止酶解反應，得酶解溶液；所述濃度1.5%混合酶液由下列重量配比的物質組成纖維素酶15g/L、蝸牛酶15 g/ L、溶壁酶15 g/L、溶劑為0.6 mol / L的氯化鈉緩衝溶液，配置好後於4000 r/min，離心 15 min，收集上清液，用直徑為0.45 μ m的超微微孔濾膜過濾除菌；所述滲透壓穩定劑為濃度0. 6 mol/L的氯化鈉緩衝液；E、原生質體分離過濾酶解溶液，濾去未被酶解的菌絲殘片，濾液於溫度4°C、轉速500r/min、離心分離 15min ；棄上清液，用1 2mL濃度0. 6mol/L的氯化鈉溶液洗滌1次，收集原生質體重懸於 ImL濃度0. 6 mol/L的氯化鈉溶液中保存，得到原生質體懸液；F、原生質體再生將原生質體懸液用濃度0.6 mol/L的氯化鈉溶液梯度稀釋100倍，取稀釋液0.1 mL分 別塗布於馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板和高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板；溫度32°C、保持相對溼度 大於60%、光照培養12 h，直至長出直徑0. 5 Imm白色再生菌落；上述高滲馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基由下列重量配比的物質組成馬鈴薯200 g/L,葡 萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L，氯化鈉35. 1 g/L。
全文摘要
本發明涉及用於高產L-乳酸的米根黴原生質體的製備與再生方法。該方法包括以下操作步驟A、製備米根黴孢子懸液，B、製備種子培養液，C、製備菌絲懸液，D、酶解細胞壁，E、原生質體分離，F、原生質體再生。本發明所製備的米根黴原生質體形態近似圓形，活力較高，米根黴原生質體製備數最高能達到2.74×106個/mL，再生率最高為6.8%。本發明方法易於操作，設備要求低，為黴菌原生質體製備及再生提供技術參考。本發明所述方法原生質體製備速度較快，原生質體再生周期短，再生速度快，可以有效提高原生質體製備效率。利用本發明製備的原生質體完全滿足原生質體融合的要求，為原生質體的製備與再生提供了一種具有實際意義操作方法。
文檔編號C12R1/845GK102061266SQ201010553718
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者吳學鳳, 姜紹通, 潘麗軍, 羅水忠, 邱靜, 鄭志 申請人:合肥工業大學