篩選好氧反硝化菌的方法
2023-08-01 13:18:26 1
專利名稱：篩選好氧反硝化菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種高效篩選好氧反硝化菌的方法。
背景技術：
一般認為，進行硝酸鹽呼吸的反硝化細菌都是兼性厭氧微生物，因為只有在無氧條件下，才能誘導出反硝化作用所需要的硝酸鹽還原酶A和亞硝酸鹽還原酶。然而，近幾年人們不斷地發現好氧條件下總氮的損失，因此，對好氧反硝化的研究逐漸引起研究者的重視。目前，對好氧反硝化現象形成的原因尚沒有定論，國內外大多數研究者都從製造局部厭氧或微環境厭氧來研究好氧反硝化技術，其操作控制複雜，系統運行不穩定。水體中的氮會造成水體富營養化，所以氮的去除已引起研究者們的普遍關注。然而，傳統生物脫氮技術，因硝化菌與反硝化菌對氧的需求截然相反，而使硝化反硝化兩個過程在時間和空間上難以統一，並具有以下弊端(1)工程造價高，操作控制複雜；(2)硝化過程中產生的酸度需要投加鹼中和，不僅增加了處理費用，而且還可能造成二次汙染；(3)系統抗衝擊能力差，高濃度NH4+、NO2-都會抑制硝化菌生長。
發明內容
本發明的目的是採用篩選好氧反硝化菌的方法，從生物學角度實現好氧反硝化現象，該技術是實現短程同步硝化反硝化的先決條件，對比傳統生物脫氮技術，具有絕對優勢。本發明按照下述步驟進行a、好氧反硝化菌富集採取馴化厭氧脫氮汙泥的方法富集生物菌群；b、細菌分離純化將馴化後得到的活性汙泥內的生物菌群採用平板稀釋法與平板劃線法分離和純化；c、好氧反硝化菌初篩對分離、純化後得到的純菌進行初篩，得到對TN去除率達50％以上的菌株；d、好氧反硝化菌復篩對初篩後的菌株進行復篩，得到好氧反硝化菌。本發明好氧反硝化技術的實現，不僅能克服傳統生物脫氮技術的弊端，還具有以下優勢(1)能夠實現同一反應器內脫氮、除COD；(2)在反饋作用的調節下縮短停留時間；(3)減小曝氣量；(4)反硝化過程產生的鹼度能夠中和硝化過程產生的酸度，減小鹼度消耗；(5)有助於實現短程同步硝化反硝化。好氧反硝化技術以上特點可以大大減小汙水處理費用，提高處理能力和效率。
圖1為好氧反硝化菌富集裝置圖，圖2為好氧反硝化菌復篩裝置圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式按照下述步驟進行a、好氧反硝化菌富集採取馴化厭氧脫氮汙泥的方法富集生物菌群，微生物與環境、微生物與微生物間的相互作用是複雜微妙的，突然改變環境條件(從厭氧/缺氧→好氧)不僅起不到富集的作用，還會破壞原來的生態平衡，對原有菌群也是一種破壞，所以採取馴化厭氧脫氮汙泥的手段(馴化裝置如圖1所示)，逐漸改變環境條件，即逐漸增大曝氣量、曝氣時間、進水硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度，達到所要篩選菌株的環境條件，給生物菌群一個適應的過程，最終使目的菌群—好氧反硝化菌成為優勢菌群，來達到富集的目的；b、細菌分離純化將馴化後得到的活性汙泥內的生物菌群採用平板稀釋法與平板劃線法分離和純化；c、好氧反硝化菌初篩對分離、純化後得到的純菌進行初篩，得到對TN去除率達50％以上的菌株；d、好氧反硝化菌復篩對初篩後的菌株進行復篩，得到好氧反硝化菌。所述馴化厭氧脫氮汙泥的方法是這樣實現的(1)從SBR法處理高濃度氨氮廢水工藝或傳統厭氧脫氮汙泥工藝中取活性汙泥；(2)馴化初始，僅以FM配水作為進水，每隔2～3d，增加DM配水培養液在配水中的含量，直到配水全部為DM培養液，馴化一個月後得到在DO值大於5mg/L的條件下，對500mg/L的TN可去除率達60％以上的活性汙泥；所述FM配水由1.0g/L牛肉膏、5.0g/L蛋白腖和1.0g/LKNO3組成；所述DM配水由7.9g/LNa2HPO4·7H2O、1.5g/LKH2PO4、0.3g/LNH4Cl、0.1g/LMgSO4·7H2O、4.7g/L琥珀酸鈉、2ml微量元素溶液和氧化態氮組成；所述氧化態氮為KNO3和/或NaNO2；所述微量元素溶液由50.0g/L EDTA、2.2g/L ZnSO4、5.5g/LCaCl2、5.06g/L MnCl2·4H2O、5.0g/L FeSO4·7H2O、1.1g/L(NH4)6Mo7O2·4H2O、1.57g/L CuSO4·5H2O和1.61g/L CoCl2·6 H2O組成；所述進水的化學需氧量(COD)控制在4500～5500mg/L，總氮(TN)在450～550mg/L。所述好氧反硝化菌初篩的方法是這樣實現的將分離純化後得到的純菌斜面，用滅菌後的DM培養液洗到裝有100mL DM培養液的250mL三角瓶中，並在三角瓶內加入滅過菌的玻璃株，用9層紗布包好瓶口，放入空氣振蕩器，在溫度為30℃、轉速為160rpm的條件下培養24h，得到對TN去除率達50％以上的菌株。所述好氧反硝化菌復篩的方法是這樣實現的(1)好氧反硝化菌復篩裝置(見圖2)的反應器中裝入1000mLDM培養基後密封，與氧氣罐組裝，打開進氣口和排氣口，以3L/min的流量通入氧氣3min；(2)關閉排氣口，通入氬氣，當反應器內壓力為正壓時停止通入氬氣，關閉進氣口，對培養液進行培養；(3)採用氮元素軌跡跟蹤測定法監測培養液中NO3--N、NO2--N和DO的變化。
具體實施方式
二本實施方式是這樣實現的a、好氧反硝化菌富集(1)從SBR法處理高濃度氨氮廢水工藝或傳統厭氧脫氮汙泥工藝中取活性汙泥；(2)馴化初始，僅以FM配水作為進水，每隔2～3d，增加DM配水培養液在配水中的含量，直到配水全部為DM培養液，進水的COD控制在5000mg/L，總氮(TN)在500mg/L，並且在馴化過程中，維持汙泥在原溶解氧(DO)濃度2～3d後，在改變配水的同時，也將DO增加0.5～1mg/L，以上做法的目的一是避免突然破壞生物菌群的營養環境對菌群造成傷害，二是逐漸達到好氧反硝化菌適宜的條件，使該類菌在汙泥馴化過程中得到富集，採用上述方法馴化一個月後可完成汙泥馴化，此時活性汙泥由馴化初始的深黑色、散狀轉變為馴化末期的淺灰色、絮狀，呈好氧汙泥狀態。馴化後活性汙泥在DO值大於5mg/L的條件下，對500mg/L的TN可去除60％以上，COD降解率可達到80％以上，並具備一定的抗衝擊負荷能力，汙泥活性強，並在具有較高濃度的好氧反硝化菌群。採取馴化厭氧脫氮汙泥的方法富集生物菌群，微生物與環境、微生物與微生物間的相互作用是複雜微妙的，突然改變環境條件(從厭氧/缺氧→好氧)不僅起不到富集的作用，還會破壞原來的生態平衡，對原有菌群也是一種破壞，所以採取馴化厭氧脫氮汙泥的手段，逐漸改變環境條件，即逐漸增大曝氣量、曝氣時間、進水硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度，達到所要篩選菌株的環境條件，給生物菌群一個適應的過程，最終使目的菌群—好氧反硝化菌成為優勢菌群，來達到富集的目的。
b、細菌分離純化將馴化後得到的活性汙泥內的生物菌群採用平板稀釋法與平板劃線法分離和純化。
c、好氧反硝化菌初篩將分離純化後得到的純菌斜面，用滅菌後的DM(加入的氧化態氮為1.0g/LKNO3、0.5g/LNaNO2)培養液洗到裝有100mL DM培養液的250mL三角瓶中，並在每個三角瓶內加入幾粒滅過菌的玻璃株(儘量減小厭氧微環境對實驗結果的影響)，用9層紗布包好瓶口(保證好氧條件)，放入空氣振蕩器，在溫度為30℃、轉速為160rpm的條件下培養24h，得到對TN去除率達50％以上的菌株。取培養前後的菌液測量TN濃度，考察其對TN的去除率。在本實驗中，分別考察分離得到的105株菌對TN的去除率，其中去除率在50％以上的菌株有21株，40％～50％的菌株有15株，30％～40％的菌株有10株。一般認為，生物同化作用利用的氮不會超過30％，所以可以認為這46株菌基本在好氧條件下具有反硝化作用。另外，馴化前從活性汙泥中篩選出的17株菌，對TN去除率都較低，最高不過17％。可見，馴化後分離的菌株對TN的去除率有明顯提高，該結果進一步證實馴化可以提高好氧反硝化菌群的濃度。但由於同化作用對結果有幹擾，故應採取復篩的方法進一步確認所篩選菌株是否為好氧反硝化菌。
d、好氧反硝化菌復篩整個反應裝置是密閉的，反應器由2000mL具塞密閉的試劑瓶及管件組成，進出口兩端配有孔徑為0.25μm的濾菌器，反應器裝入1000mLDM培養基後密封，與氧氣罐組裝，打開進氣口和排氣口，以3L/min的流量通入氧氣3min，趕走反應器和管路內的空氣來去除空氣中所含的氮氣，避免氮氣對測量結果的幹擾。關閉排氣口，通入氬氣，通過氣體壓力表的讀數確定反應器內壓力為正壓，停止通入氬氣，關閉進氣口。與此同時，打開磁力攪拌器，目的是使培養液均質並與上部氧氣充分接觸(培養過程中測得DO能夠始終維持在8mg/L～10mg/L)。通入氬氣的目的是製造有壓條件一是使反應器內形成正壓，使氧能夠更充分地溶解到培養液中，確保絕對好氧；二是正壓能夠阻止空氣中的氮氣進入反應器，使取得氣體樣中的氮的量絕對代表反硝化的產物的量。取樣口1用以取氣體樣，來監測培養過程中氮氣生成量(氣相色譜法)，取樣口2用以取培養液樣品，來監測培養液中NO3--N、NO2--N和DO等的變化。實驗用的培養基為DM培養基，受氫體KNO30.8g/L，其他成份不變。本實驗中，對初篩的21株對TN的去除率在50％以上的菌株做了復篩，證實了它們都可以在好氧的條件下進行硝酸鹽呼吸，脫氮率可達95％以上，且反硝化末端產物為氮氣，即這21株菌都是好氧反硝化菌，這進一步佐證馴化汙泥內好氧反硝化的實現，是由於汙泥內部高效的、大量的好氧反硝化菌在起作用。
由以上實驗結果可知，採用此方法篩選好氧反硝化菌是高效的，且各個步驟都發揮著重要的作用，其中汙泥馴化工作起關鍵的作用，而好氧反硝化菌的復篩又起著決定性的作用。
權利要求
1.篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於它按照下述步驟進行a、好氧反硝化菌富集採取馴化厭氧脫氮汙泥的方法富集生物菌群；b、細菌分離純化將馴化後得到的活性汙泥內的生物菌群採用平板稀釋法與平板劃線法分離和純化；c、好氧反硝化菌初篩對分離、純化後得到的純菌進行初篩，得到對TN去除率達50％以上的菌株；d、好氧反硝化菌復篩對初篩後的菌株進行復篩，得到好氧反硝化菌。
2.根據權利要求1所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述馴化厭氧脫氮汙泥的方法是這樣實現的(1)從SBR法處理高濃度氨氮廢水工藝或傳統厭氧脫氮汙泥工藝中取活性汙泥；(2)馴化初始，僅以FM配水作為進水，每隔2～3d，增加DM配水培養液在配水中的含量，直到配水全部為DM培養液，馴化一個月後得到在DO值大於5mg/L的條件下，對500mg/L的TN可去除率達60％以上的活性汙泥。
3.根據權利要求2所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述FM配水由1.0g/L牛肉膏、5.0g/L蛋白腖和1.0g/LKNO3組成。
4.根據權利要求2所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述DM配水由7.9g/L Na2HPO4·7H2O、1.5g/L KH2PO4、0.3g/L NH4Cl、0.1g/LMgSO4·7H2O、4.7g/L琥珀酸鈉、2ml微量元素溶液和氧化態氮組成。
5.根據權利要求4所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述氧化態氮為KNO3和/或NaNO2。
6.根據權利要求4所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述微量元素溶液由50.0g/L EDTA、2.2g/L ZnSO4、5.5g/L CaCl2、5.06g/LMnCl2·4H2O、5.0g/L FeSO4·7H2O、1.1g/L(NH4)6Mo7O2·4H2O、1.57g/LCuSO4·5H2O和1.61g/L CoCl2·6H2O組成。
7.根據權利要求2所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述進水的COD控制在4500～5500mg/L，總氮控制在450～550mg/L。
8.根據權利要求1所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述好氧反硝化菌初篩的方法是這樣實現的將分離純化後得到的純菌斜面，用滅菌後的DM培養液洗到裝有100mL DM培養液的250mL三角瓶中，並在三角瓶內加入滅過菌的玻璃株，用9層紗布包好瓶口，放入空氣振蕩器，在溫度為30℃、轉速為160rpm的條件下培養24h，得到對TN去除率達50％以上的菌株。
9.根據權利要求1所述的篩選好氧反硝化菌的方法，其特徵在於所述好氧反硝化菌復篩的方法是這樣實現的(1)好氧反硝化菌復篩裝置的反應器中裝入1000mLDM培養基後密封，與氧氣罐組裝，打開進氣口和排氣口，以3L/min的流量通入氧氣3min；(2)關閉排氣口，通入氬氣，當反應器內壓力為正壓時停止通入氬氣，關閉進氣口，對培養液進行培養；(3)採用氮元素軌跡跟蹤測定法監測培養液中NO3--N、NO2--N和DO的變化。
全文摘要
篩選好氧反硝化菌的方法，它涉及一種高效篩選好氧反硝化菌的方法。本發明按照下述步驟進行a.採取馴化厭氧脫氮汙泥的方法富集生物菌群；b.將馴化後得到的活性汙泥內的生物菌群採用平板稀釋法與平板劃線法分離和純化；c.對分離、純化後得到的純菌進行初篩，得到對TN去除率達50％以上的菌株；d.對初篩後的菌株進行復篩，得到好氧反硝化菌。本發明好氧反硝化技術的實現，不僅能克服傳統生物脫氮技術的弊端，還具有以下優勢(1)能夠實現同一反應器內脫氮、除COD；(2)在反饋作用的調節下縮短停留時間；(3)減小曝氣量；(4)反硝化過程產生的鹼度能夠中和硝化過程產生的酸度，減小鹼度消耗；(5)有助於實現短程同步硝化反硝化。
文檔編號C12Q1/02GK1594591SQ20041004370
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月12日 優先權日2004年7月12日
發明者馬放, 周丹丹, 任南琪, 楊基先 申請人:哈爾濱工業大學