石房蛤毒素人工抗原和抗體及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-29 21:28:36

專利名稱：石房蛤毒素人工抗原和抗體及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫分析技術領域，具體涉及到一種石房蛤毒素人工抗原和抗體及其製備方法和ELISA檢測試劑盒的製備和應用。
背景技術：
目前，麻痺性貝類毒素(Paralytic shellfish poison,PSP)已成為世界上分布範圍最廣、發生頻率最高、危害程度最大的一類海洋生物毒素，它通過影響鈉離子通道而抑制神經的傳導。而石房蛤毒素(Mxitoxin，STX)為麻痺性貝類毒素的主要成分之一，是四氫嘌呤的一種衍生物，其外部形態是呈白色、吸溼性很強的固體，溶於水，微溶於甲醇和乙醇。 STX及天然衍生物所構成的PSP有很高的致死率，STX對成年人輕度中毒量為110 μ g，致死劑量為 540 ~ IOOOyg, LD50 為 9 μ g/kg (小鼠，ip)。貝類毒素的分析方法主要有小鼠生物測試法、HPLC法及免疫方法等。小鼠生物測試法是是國際上都能接受的唯一的方法。該方法在檢測樣本總毒性方面相當成功，但此種方法不能確知毒素的組成及含量，且重複性差，靈敏度不高。近幾年發展起來的HPLC法及其聯用技術，具有靈敏、高效的特點，能夠提供更多的毒素信息，是PSP毒素檢測的主要手段，但存在成本高，費時，需要較高的儀器設備及分析技術等缺點。而酶聯免疫吸附測定技術(ELISA)具有簡便、快速、靈敏、成本低廉等特點，ELISA法與傳統的動物生物法及色譜方法相比較，更快速經濟，可以滿足大批量樣品的快速篩查需要。國內對麻痺性貝毒中的膝溝藻毒素(gonyautoxin，GTX)研究的比較多，暨南大學的向軍儉製備了抗麻痺性貝毒素GTX2，3的單克隆抗體，同時也比較了間接競爭和直接競爭ELISA方法的靈敏度和檢出限。但對STX的酶聯免疫吸附法研究還沒有開展。

發明內容
本發明的目的在於提供一種石房蛤毒素人工抗原和抗體及其製備方法和ELISA 檢測試劑盒的製備和應用，將製備的抗體用於石房蛤毒素的檢測，以彌補現有技術的不足。製備抗體的關鍵是製備人工免疫抗原，因為石房蛤毒素是一種相對分子質量只有 299的小分子半抗原，沒有抗原性，不能刺激動物體產生相應的抗體，需要和某種大分子的物質偶聯形成完全抗原，小分子的半抗原就成為新的偶聯物的抗原決定簇，這樣小分子物質就具有了抗原性。而製備人工抗原要選擇合適的載體蛋白，本發明選擇碳化二亞胺法， 載體蛋白選用卵清白蛋白(OVA)，將石房蛤毒素上的氨基與卵清白蛋白(OVA)上的羧基相連，採用梯度法透析後得到高純度的石房蛤毒素免疫抗原STX-0VA。同時本發明還選擇用牛血清白蛋白(BSA)來製備包被抗原STX-BSA，在製備ELISA試劑盒時需要用包被抗原包被酶標板。本發明的技術方案如下一、免疫抗原STX-0VA，其結構式為
權利要求
1. 一種石房蛤毒素人工抗原，為石房蛤毒素人工抗原STX-0VA，其結構式為
2.如權利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原的製備方法，其特徵在於是將石房蛤毒素上的氨基與卵清白蛋白OVA上的羧基相連得到石房蛤毒素人工抗原，包括以下步驟(1)將石房蛤毒素STX溶於二甲基亞碸DMSO中，配成0.1 μ g/ μ L的STX母液；將水溶性碳化二亞胺EDC和N-羥基琥珀醯亞胺NHS用0. OlM ρΗ7. 5磷酸鹽緩衝液PBS，分別配製成lmg/mL相應工作液；(2)取100μ L STX母液，加入20 μ L EDC工作液和12 μ L NHS工作液，室溫震蕩反應 3h製成最初反應液；(3)用0.OlM pH7. 5的PBS緩衝液將卵清白蛋白配成lmg/mL的卵清白蛋白工作液；(4)將步驟O)中的最初反應液加入到IOOyL卵清白蛋白工作液中，震蕩反應12h獲得最終反應液；(5)將上述的最終反應液轉移到透析卡中，用300mL0.01M pH7. 5的PBS緩衝液和DMSO 的混合液透析72h，每1 換液1次，透析完後取出反應物即製得石房蛤毒素人工抗原。
3.如權利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的製備方法，其特徵在於STX EDC NHS 反應的摩爾比為1 3 2。
4.如權利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的製備方法，其特徵在於上述的透析是採用梯度透析法，第一次透析的溶液中PBS緩衝液和DMSO的體積比為100 4-5，第二次透析的體積比為100 3-4，第三次透析的體積比為100 2-3，第四次透析的體積比為 100 1-2，第五次透析的體積比為100 0.5-1，以後透析的溶液不加DMS0。
5.權利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原用於製備石房蛤毒素抗體。
6.如權利要求5所述的石房蛤毒素抗體，其特徵在於是用石房蛤毒素人工抗原 STX-OVA作為免疫抗原免疫小鼠，分離純化血清得到的石房蛤毒素多克隆抗體。
7.權利要求6所述的石房蛤毒素抗體的製備步驟如下用STX-OVA免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200 μ L STX-OVA與等體積弗氏完全佐劑，充分乳化後製成乳濁液，腹腔注射小鼠，之後每隔兩周取同量STX-OVA與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，腹腔注射；免疫三次後取尾血測定小鼠血清效價，若效價不高，繼續免疫；待效價大於要求值後取血，室溫放置30min，8000r/min離心20min，取上層血清，用蛋白A抗體離心純化試劑盒純化血清，得到石房蛤毒素多克隆抗體。
8.權利要求6所述的石房蛤毒素多克隆抗體應用於製備石房蛤毒素的酶聯免疫檢測試齊U盒。
9.如權利要求8所述的檢測石房蛤毒素的ELISA試劑盒，其特徵在於所述試劑盒依間接競爭ELISA原理研製而成，包括a、ELISA板條每個試劑盒含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含包被抗原包被的可拆卸的ELISA微孔板條，規格為8孔X 12條；b、洗滌液PBS-T10倍濃縮的pH為7. 4的含0. 1 %體積分數的吐溫20的PBS溶液 200mL ；c、純化的石房蛤毒素多克隆抗體血清5mL；d、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG酶標二抗ImL；e、底物顯色液50mL配製方法為取50 μ L TMB溶液+IOmL底物緩衝液十10 μ L 30%過氧化氫，混勻；底物緩衝液的配製為稱取檸檬酸19. 2g加水至IOOOmL,為甲液；稱取磷酸氫二鈉71. 7g，加水至1000m L，為乙液；取甲液24. 3mL,乙液25. 7mL，加水至IOOmL即為底物緩衝液；f、終止液2M硫酸溶液IOmL；g、石房蛤毒素標準抗原液lmL，濃度為9.65 μ M/L ；h、稀釋液0.OlM pH 為 7. 5 的 PBS 溶液 500mL。
全文摘要
本發明涉及一種石房蛤毒素人工抗原和抗體及其製備方法和應用，是採用碳化二亞胺法，將石房蛤毒素STX上的氨基與載體蛋白卵清白蛋白OVA上的羧基相連，採用梯度法透析後得到高純度的石房蛤毒素免疫抗原STX-OVA。將獲得的人工抗原去製備石房蛤毒素的多克隆抗體，而製備的多克隆抗體可用於製備石房蛤毒素的酶聯免疫檢測試劑盒。本發明成功合成了石房蛤毒素人工抗原STX-OVA和STX-BSA，將製備的免疫抗原免疫BALB/c小鼠，可得到效價高、特異性強的多克隆抗體，利用建立的酶聯免疫分析方法製備的試劑盒可用於石房蛤毒素的快速檢測。
文檔編號C07K14/77GK102206270SQ20111005458
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月8日 優先權日2011年1月27日
發明者劉帥帥, 周德慶, 朱蘭蘭, 柳淑芳, 趙峰 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所