一種納米溶膠－凝膠膜電極、其製備方法及應用的製作方法

2023-05-30 11:45:51

專利名稱：一種納米溶膠－凝膠膜電極、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基本電器元件領域，具體的說，本發明提供了一種含有納米超薄溶膠-凝膠膜的電極及其製備方法。本發明還提供了該電極在製作電化學免疫傳感器和檢測疾病標誌物的電化學儀器方面的應用。
背景技術：
電化學免疫傳感器是一種基於電化學測試手段和生物免疫識別反應的抗原測定新方法，其中涉及的關鍵步驟是將抗體固定在電極表面，以形成高活性的識別位點。近來，金電極表面自組裝方法顯示了巨大的潛力，結合共價固定反應可構建有序絕緣的單分子抗體絕緣膜，適合於電容免疫分析法的應用。但該方法利用共價鍵結合抗體分子，易於導致蛋白質結構的改變及抗體活力下降；同時該方法固定生物分子過程複雜，將增加分析誤差。因此尋找簡便易行，並能有效保持抗體分子活性的固定方法成為相關領域研究的重點。
溶膠-凝膠作為一種以無機多孔材料為載體的新型材料，具有較好的物理剛性和化學惰性，對光、化學、熱和生物降解的穩定性高，包埋的生物分子可保持較高的生物活性和特異性；同時，溶膠-凝膠的孔徑大小可調，可通過調節其大小提高生物化學反應的選擇性；加之包埋過程條件溫和，適用範圍廣泛。因此，該方法在目前生物傳感器的研製中廣受重視。
近年來，基於溶膠凝膠體系構建生物傳感器的成功使得人們開始嘗試利用該體系包埋抗體分子構建免疫傳感器。1997年Alisa Bronshtein小組(BronshteinA，Aharonson N，Avnir D，Turniansky A，Altstein M.Chem.Mater.1997，9，2632)及1998年Joesph Wang 小組(Wang J，Pamidi PVA，Rogers KR.Anal.Chem.1998，70，1171)分別報導利用SiO2溶膠包埋抗體製備免疫傳感器，採用了光學法、電流法檢測目標抗原。結果表明小分子抗原可通過納米材料的孔洞與包埋在凝膠體系內部抗體實現免疫反應。但利用以上免疫分析方法仍然存在檢測目標分子需要進行光學標記或酶標記、操作過程複雜、靈敏度不高等局限性。電容免疫分析法作為一種高靈敏度、無標記免疫分析方法，已成功應用於基於自組裝技術構建的免疫傳感器，但迄今仍未有文獻報導應用於溶膠凝膠電容型免疫傳感器。原因在於利用溶膠凝膠法固定抗體分子時通常製得的SiO2生物膜較厚(μm級)(Jiang DC，Tang J，Liu BH，Yang PY，Shen XR，Kong JL，Biosens.Bioelectron.，2003，18，1183-1191)，使得電極表面嫁接層d值大於自組裝構建單分子層厚度，而電極電容將主要由該層電容決定，因此這部分電容將掩蓋抗原抗體結合產生的生物膜厚度改變所引起的電容變化。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種納米溶膠-凝膠膜電極，該電極中的凝膠體系超薄絕緣並可用於固定生物分子，通過電容變化檢測待測物中可與生物分子相互作用的物質的含量。
本發明的另一個目的是提供一種上述電極的製備方法。
本發明的再一個目的是提供上述電極的應用。
對於溶膠凝膠體系，納米材料的表面積和其成膜厚度相關。通常表面積越大，凝膠膜越薄。在各種溶膠凝膠體系中，γ-Al2O3具有較高的比表面積，可有效降低成膜厚度，因此有望應用於電容型溶膠凝膠免疫傳感器的構建。在發明人以前的工作中，該溶膠凝膠已成功包埋HRP生物分子和介體硫堇製備安培型過氧化氫生物傳感器過程用於檢測苯酚分子，取得較高的靈敏度(Liu ZJ，Liu BH，KongJL，Deng JQ.Anal.Chem.2000，72，4707)。因此本發明選用這種凝膠體系包埋免疫分析通用模型--免疫球蛋白抗體，構建免疫傳感器來證實以上膜越薄，測得的電容變化越靈敏的設想。在此基礎上，利用該體系包埋肝纖維化標誌物的抗體以用於相關抗原分子的檢測。
在本發明的一個方面，提供了一種納米溶膠-凝膠膜電極，電極上覆蓋的膜為Al2O3凝膠膜，Al2O3凝膠膜中Al2O3與水的摩爾比為1∶50-1∶300；並用長鏈烷基醇封閉使之絕緣；凝膠膜中固定有抗體，並通過測定電極的電容變化檢測待測物中可與抗體結合的物質的含量並用長鏈烷基醇封閉使之絕緣；凝膠中固定有抗體，並通過測定電極的電容變化檢測待測物中可與抗體結合的物質的含量。
本發明的電極上Al2O3凝膠膜的厚度為20-40nm。
本發明中，用於封閉作用的長鏈烷基醇可以是12巰醇、14巰醇、16巰醇或18巰醇等。
可與本發明中的抗體結合的物質包括核酸、蛋白質、脂肪、糖類或微生物等抗原物質。
本發明使用的基礎電極可以是碳電極(包括石墨電極和玻碳電極)、金電極、鉑電極等。
對於電容型免疫傳感器，電極表面生物膜的厚度對於傳感器靈敏度具有至關重要的作用。對於凝膠體系，溶膠中水的含量將直接影響最終凝膠生物膜的厚度。因此本發明分別測定具有不同水含量的Al2O3-Ab，SiO2-Ab生物膜厚度，結果表明，對於Al2O3溶膠體系，Al∶H2O＝1∶50～1∶300時可形成生物膜厚度約為40～20nm，亦可適用於製作檢測生物分子的傳感器。
與此相比，對於SiO2生物膜，通常用於包埋生物分子的SiO2溶膠中Si∶H2O摩爾比為1∶10，該層膜的厚度為350～370nm，而且單純的依靠增加SiO2體系中水的含量不能降低該層膜的厚度。同時，由於進一步增加SiO2中水的含量將使該生物凝膠膜產生一蓬鬆結構，並延長陳化時間，不易於包埋生物分子構建生物傳感器(Jiang DC，Tang J，Liu BH，Yang PY，Shen XR，Kong JL，Biosens.Bioelectron.，2003，18，1183-1191)。本發明的電極上Al2O3凝膠膜厚為20~40nm，與金電極自組裝方法構建的電容型生物膜的厚度相當，又能較好的保持所包埋生物分子的活性，因此可應用於電容免疫分析方法。
構建電容型免疫傳感器的另一關鍵在於使固定有抗體的生物膜處於絕緣狀態。在本發明的一個實施例中，利用[Fe(CN)6]3-/4-作為氧化還原探針監控該絕緣層的形成階段。圖1a為裸金電極在5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環伏安圖。當不加抗體的溶膠直接滴在電極表面，乾燥後的凝膠膜循環伏安圖(圖1b)顯示其電流值小於裸金電極狀態，表明凝膠膜能夠有效的固定在電極表面。混合抗體分子和溶膠在電極表面，乾燥後的電極電流進一步降低，如圖1c所示，證明抗體分子已成功固定在凝膠體系中。循環伏安圖形狀呈現正S形，表現出微電極特徵。為絕緣該層生物膜，可用長鏈烷基醇封閉電極表面沒有被凝膠粒子覆蓋的部分。圖1d為16-巰醇封閉後的金電極循環伏安圖，[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原峰消失，表明電極表面的針孔已被長鏈的巰基化合物遮蓋，形成一層緻密的電絕緣物質。
本發明中電化學工作站為多通道電化學儀CHI1030(CH Instrument，USA)。
本發明的另一方面，提供了一種納米溶膠-凝膠膜電極的製備方法，包括以下步驟(1)製備Al2O3溶膠；(2)將抗體溶液與Al2O3溶膠混合，形成含有抗體的Al2O3溶膠，溶膠中抗體的濃度為10ng/ml-30mg/ml；(3)將上述含抗體的溶膠滴加在清潔後的電極表面，凝膠膜的厚度為20-40nm，Al2O3凝膠膜中Al2O3與水的摩爾比為1∶50-1∶300；(4)用長鏈烷基醇對電極表面的凝膠膜進行封閉。
具體而言，首先，用氧化鋁拋光粉研磨電極，並在超聲波中洗滌，同分乾燥備用；同時，將異丙醇鋁等鋁鹽原料配成均質溶液，經加熱水解等化學反應，生成Al2O3溶膠；將待固定的抗體溶液加入到Al2O3溶膠中，用微型移液管將混合有抗體的凝膠滴加在清潔後的電極表面，待乾燥聚合後，抗體就被包埋在凝膠中；洗滌覆蓋有凝膠膜的電極，並在PBS等溶液中攪拌使其本底電流下降至穩定水平；最後，將包被有抗體的凝膠膜電極置於長鏈烷基醇溶液中，進行封閉。這樣，本發明的電極就製備完成了。
本發明的另一個方面，提供了一種上述納米溶膠凝膠膜電極的應用，即將該電極用於製備電化學免疫傳感器。
本發明的電極亦可與多個上述納米溶膠凝膠膜電極與參比電極和對電極組合，形成可一次測得多種目的化合物濃度的的電化學檢測儀器。
多通道、多目標臨床檢測是免疫分析發展的方向及要求。目前關於多通道檢測方法的研究主要集中在螢光標記法、SPR及ELISA方法。這些方法存在的主要問題在於檢測過程複雜，或需要螢光標記，酶聯標記，或需要如表面等離子共振等大型儀器，在臨床應用上有一定的難度。而應用電位階躍法測定免疫傳感器電容值變化可在微秒時間範圍內實現檢測，因此如在該體系上附加一套多通道採點體系，即可實現多通道多目標物檢測；且無需標記免疫分子及複雜儀器，有較好的應用前景。
多通道電位階躍體系檢測原理也基於電極體系可模擬為簡單RC電路。由於金電極表面的生物凝膠膜處於絕緣狀態，在施加50mV電壓後極短時間內，可將其等效電路圖簡化為設想RC電路。圖6顯示八通道電極陣列的電位階躍線性擬和圖，即將前10個電流值取對數對時間作圖，其線性相關係數優於0.99。該值接近於1，證實電極體系與理想等效電路圖相似，表明多通道電位階躍法適用於本體系的電容測定。表2顯示了免疫傳感器組裝過程中的電容值。電容值不斷降低證實免疫傳感器組裝過程如設想構建。利用16-巰醇封閉後，電極的電容值顯著減小到150nF左右，表明通過長鏈巰醇封閉電極裸漏部分，可明顯增加電極表面生物膜的絕緣性。


圖1為基於溶膠凝膠體系的電容型免疫傳感器構建不同階段循環伏安圖。其中，a.裸金電極；b.表面覆蓋有凝膠膜的金電極；c.表面覆蓋有凝膠-抗體膜的金電極；d.16-巰醇封閉後的金電極。
圖2為Al2O3凝膠中不同水含量構建的電容型免疫傳感器對IgG抗原的響應圖。其中，(e)1ngmL1(f)5ngmL-1(g)50ngmL-1。
圖3為SiO2凝膠中不同水含量構建的電容型免疫傳感器對IgG抗原的響應圖。其中，(h)1ngmL-1(i)5ngmL-1(j)200ngmL-1。
圖4為含不同水含量的凝膠膜製備LN免疫傳感器對抗原的響應圖。其中，水與凝膠含水摩爾比分別是l為100∶1，m為200∶1，n為300∶1，o為50∶1。
圖5為免疫傳感陣列對混合抗原的響應圖。其中，p為透明質酸免疫傳感器對透明質酸(HA)的響應，q為層粘連蛋白免疫傳感器對層粘連蛋白(LN)的響應。
圖6為溶膠凝膠電容型免疫傳感陣列八通道電位階躍線性擬合圖。其中，抗原濃度分別為u)0ng/mL v)10ng/mL w)100ng/mL。
具體實施例方式
實施例1 溶膠凝膠體系中水含量對最終凝膠生物膜厚度的影響凝膠體系，溶膠中水的含量將直接影響最終凝膠生物膜的厚度。因此本發明分別測定具有不同水含量的Al2O3-Ab，SiO2-Ab生物膜厚度，列表如下表1具有不同水含量(摩爾比)的Al2O3-Ab，SiO2-Ab生物膜的厚度Al2O3(nm) SiO2(nm)(Al/water 1∶100) (1∶300) (Si/water 1∶10) (1∶100)1.31±322±2370±37250±252.42±419±2350±35260±363.37±421±2350±35270±374.40±419±2370±37250±25
5.41±424±2370±37250±25結果表明，對於Al2O3溶膠體系，Al∶H2O＝1∶100時可形成生物膜厚度約為40nm。進一步增加溶膠中水的含量至1∶300，生物膜的厚度下降至20nm左右。與此相比，對於SiO2生物膜，通常用於包埋生物分子的SiO2溶膠中Si∶H2O為1∶10，該層膜的厚度為350~370nm，與選用SEM方法測定結果相似(Liu ZJ，Liu BH，Kong JL，Deng JQ.Anal.Chem.2000，72，4707)。增加水的含量到1∶100，生物膜的厚度沒有明顯減小，為250~270nm。該厚度仍然遠遠超過Al2O3凝膠生物膜，表明單純的依靠增加SiO2體系中水的含量不能降低該層膜的厚度。同時，由於進一步增加SiO2中水的含量將使該生物凝膠膜產生一蓬鬆結構，並延長陳化時間，不易於包埋生物分子構建生物傳感器(Jiang DC，Huang S，Tang J，Liu BH，HuangYP，Kong JL，Chin.JAnal. Chem.2003，31，713-715)因此基於SiO2溶膠凝膠體系構建免疫型傳感器不利於電容免疫分析法。而Al2O3凝膠膜厚為20~40nm，與金電極自組裝方法構建的電容型生物膜的厚度相當，因此有可能應用於電容免疫分析方法。
實施例2 進一步減小Al2O3凝膠生物膜的厚度Al2O3凝膠生物膜的厚度雖然遠小於SiO2體系，但是相對於自組裝層而言仍然較厚，而其最終電容值大於基於巰基化合物自組裝構建的免疫傳感器電容(表2)。因此可在生物膜較厚的情況下有效的增加電極電容值，進而增加其RC常數。該值的增加對於實現多通道的採點分析至關重要。因為對於多通道電位階躍而言，儀器的A/D噪音將大於單通道狀態。為保證擬合曲線具有良好的線性，免疫傳感器的RC常數必須增大，以使實際體系更加接近RC模型，進而實現多通道採點分析。
表4同時列出所構建的免疫傳感器數據，其擬合線性變差，顯示採用Al2O3無機材料構建電容型免疫傳感器具有較大的優勢。相同條件下，我們構建SiO2電容型免疫傳感器，由於SiO2的介電常數相對較小(~3.9)，加之該層生物膜遠厚於Al2O3生物膜，使得體系在電阻沒有什麼變化，電容值下降，RC常數被較大程度的減小，使體系偏離理想狀態，不適合多通道電容免疫分析。
表2基於Al2O3，SiO2及SAMs體系的免疫傳感器電容、電阻值Methods capacitance(nF) resistance(Ω) correlation coefficient RC time constant(μs)Al2O3sol-gcl-derived 154 4172 0.995 642SAMs 28.9 3292 0.989 95.1SiO2sol-gel-derived57.7 4430 0.990 255
實施例3 長鏈烷基醇封閉後的傳感器生物膜處於絕緣狀態本實驗中利用[Fe(CN)6]3-/4-作為氧化還原探針監控該絕緣層的形成階段。用常規方法檢測，結果如圖1所示。圖1a為裸金電極在5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的循環伏安圖。當不加抗體的溶膠直接滴在電極表面，乾燥後的凝膠膜循環伏安圖(圖1b)顯示其電流值小於裸金電極狀態，表明凝膠膜能夠有效的固定在電極表面。混合抗體分子和溶膠在電極表面，乾燥後的電極電流進一步降低，如圖1c所示，證明抗體分子已成功固定在凝膠體系中。循環伏安圖形狀呈現正S形，表現出微電極特徵。其原因在於Al2O3溶膠在此條件下表面帶有正電荷，能夠通過靜電吸引包埋帶負電的生物分子形成一層緻密膜。其仍然存在氧化還原電流的原因在於納米Al2O3粒子組成的生物膜仍然具有一定的針孔，使[Fe(CN)6]3-/4-離子可以到達電極表面。為絕緣該層生物膜，16-巰醇用於封閉電極表面沒有被凝膠粒子覆蓋的部分。圖1d為16-巰醇封閉後的金電極循環伏安圖，[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原峰消失，表明電極表面的針孔已被長鏈的巰基化合物遮蓋，形成一層緻密的電絕緣物質。
表3顯示了免疫傳感器組裝過程中的電容值。電容值不斷降低證實免疫傳感器組裝過程如設想構建。利用16-巰醇封閉後，電極的電容值顯著減小到150nF左右，表明通過長鏈巰醇封閉電極裸漏部分，可明顯增加電極表面生物膜的絕緣性。
表3溶膠凝膠免疫傳感器構建不同階段電容值步驟 電容/nF裸金電極 1040電極包被凝膠後446包被有抗體的Al2O3凝膠 275用16-巰醇包被電擊後 154實施例4 透明質酸免疫傳感器的構建在臨床檢測透明質酸過程中，透明質酸結合蛋白和透明質酸的結合力大於透明質酸抗體與抗原的作用，利用其識別透明質酸抗原分子可將靈敏度提高兩個數量級，通常被選定為臨床檢測透明質酸的結合分子。
實驗中首先進行電極的清潔。即直徑為3毫米的玻碳電極依次用0.3、0.1及0.05μm的Al2O3拋光粉研磨，再在超聲波中依次用體積比為1∶1的硝酸/丙酮溶液及蒸餾水清洗5分鐘。最後通風乾燥24小時以上備用。
同時，製備包埋有抗體的Al2O3凝膠。以Al∶H20的摩爾比為1∶100的凝膠為例。將2克異丙醇鋁溶於44.0毫升蒸餾水中，80℃攪拌45分鐘後加入1M HCl 1.2毫升。然後將混合物加熱至90℃，將容器打開2小時排放異丙醇蒸汽。將混合物在90℃下回流16小時後，就得到了γ-Al2O3溶膠。在每10μl上述Al2O3溶膠中加入10μl0.1mg/ml的透明質酸抗體溶液。用微型移液管將20μl膠體混合物滴在玻碳電極表面，乾燥一天使溶膠聚合。
然後，用雙蒸水徹底清洗並置於pH＝7.4的PBS中攪拌至少2分鐘，使電極的本底電流下降並達到穩定狀態。置於4℃備用。
最後，將塗布有凝膠的玻碳電極置於16-巰醇溶液中封閉，4℃，過夜。
將上述構建的透明質酸免疫傳感器分別與透明質酸發生反應，並測定電容變化值。圖4顯示含有不同水含量的Al2O3凝膠生物膜構建的LN免疫傳感器對抗原的響應。結果顯示當Al∶H2O的比例為1∶100時，免疫傳感器對抗原的電容響應值最大。檢測下限為0.5ngmL-1，優於金電極自組裝技術獲得的免疫傳感器結果。相同的結論對於層粘連蛋白免疫傳感器同樣可以得到。該結果進一步證明實驗中已成功構建電容型免疫傳感器。
實施例5 透明質酸、層粘連蛋白免疫傳感器陣列實驗中利用優化的實驗條件構建透明質酸、層粘連蛋白免疫傳感器陣列，測定混合樣品中兩種抗原的濃度。其電容值的變化與濃度的關係圖顯示在圖5中。在0.5~50ngmL-1，1~50ngmL-1範圍內可分別得到LN，HA的線性響應。四根電極之間的相對標準偏差為10％(n＝4，HA)and 12％(n＝4，LN)，該線性響應範圍與正常人體中抗原HA濃度(44.23±23.06ngmL-1)and LN(99.10±12.96ngmL-1)匹配，表明構建的免疫傳感器能夠滿足臨床檢測的需要。其中LN的電容變化大於HA的原因在於LN的分子量(90KDa)大於HA(30kDa)，這使得抗體層結合單位抗原分子產生較大的膜厚變化，進而產生更大的電容變化。將以上結果與IgG免疫傳感器的分析結果相比，雖然IgG分子量較小，但其對單位濃度抗原的電容變化較大，這表明分子量只是影響電容變化的重要因素，而非全部因素。其它如抗原抗體的活性及結合力也是考慮的因素之一。
將免疫傳感器陣列對抗原的響應與單一傳感器對抗原特異性響應的數據進行比較(表4)，在10~100ng/mL範圍內，由混合抗原產生的電容偏差在15％以內，符合常規分析的要求。當抗原量被進一步的稀釋，分析偏差不斷增大。
表4.混合抗原產生對免疫傳感器陣列分析誤差的影響(-ΔC1指對混合抗原的響應；-ΔC2指對單一抗原響應)濃度(ng/mL)-ΔC1(nF) -ΔC2(nF) derivation(％)0.5 6.5962 5.24 20.56512.35 10.0 19.0210 13.90 14.0 -1.0650 22.23 22.97 -3.28100 21.39 22.58 -5.60實施例6 多通道電位階躍體系多通道電位階躍體系檢測原理也基於電極體系可模擬為簡單RC電路。由於金電極表面的生物凝膠膜處於絕緣狀態，在施加50mV電壓後極短時間內，可將其等效電路圖簡化為設想RC電路。圖6顯示八通道電極陣列的電位階躍線性擬和圖，即將前10個電流值取對數對時間作圖，其線性相關係數優於0.99。該值接近於1，證實電極體系與理想等效電路圖相似，表明多通道電位階躍法適用於本體系的電容測定。
權利要求
1.一種納米溶膠-凝膠膜電極，其特徵在於，該電極上覆蓋的膜為Al2O3凝膠膜，Al2O3凝膠膜中Al2O3與水的摩爾比為1∶50-1∶300；並用長鏈烷基醇封閉使之絕緣；凝膠膜中固定有抗體，通過測定電極的電容變化檢測待測物中可與抗體結合的物質的含量。
2.如權利要求1所述的電極，其特徵在於電極上凝膠膜的厚度為20-40nm。
3.如權利要求1所述的電極，其特徵在於，用於封閉作用的長鏈烷基醇為12巰醇，或14巰醇，或16巰醇，或18巰醇。
4.一種如權利要求1所述電極的製備方法，其特徵在於有以下製備步驟(1)製備Al2O3溶膠；(2)將抗體溶液與Al2O3溶膠混合，形成含有抗體的Al2O3溶膠，溶膠中抗體的濃度為10ng/ml-30mg/ml；(3)將上述含抗體的溶膠滴加在清潔後的電極表面，凝膠膜的厚度為20-40nm，Al2O3凝膠膜中Al2O3與水的摩爾比為1∶50-l∶300；(4)用長鏈烷基醇對電極表面的凝膠膜進行封閉。
5.一種權利要求l所述電極的應用，其特徵在於，將該電極用於製備電化學免疫傳感器。
6.一種權利要求1所述電極的應用，其特徵在於，將多個該電極與參比電極和對電極組合，形成可一次測定多種目的化合物的電化學檢測儀器。
全文摘要
本發明涉及基本電器元件領域，提供了一種納米溶膠－凝膠膜電極、其製備方法及應用。電化學免疫傳感器是一種抗原測定新方法。目前，儘管電化學免疫法製備傳感器突破了常用免疫分析方法需要對檢測目標分子進行光學標記或酶標記、操作過程複雜、靈敏度不高等局限性，但是往往由於找不到適當的體系固定抗體而使其應用受到限制。本發明提供了一種覆蓋有納米溶膠凝膠膜的電極，電極上覆蓋的膜為納米溶膠凝膠膜，並用長鏈烷基醇封閉使之絕緣；凝膠中固定有抗體，並通過測定電極的電容變化檢測待測物中可與抗體結合的物質的含量。本發明的電極可用於製作檢測生物分子的傳感器，亦可用於製備可一次測定多種化合物濃度的的電化學檢測儀器。
文檔編號G01N27/327GK1588028SQ20041005403
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月26日 優先權日2004年8月26日
發明者孔繼烈, 江德臣, 劉寶紅, 張松 申請人:復旦大學