一種檢測轉基因作物的蛋白質晶片試劑盒及方法
2023-05-29 17:22:01 1
專利名稱：一種檢測轉基因作物的蛋白質晶片試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及基於轉基因成分和蛋白質晶片的一種快速檢測轉基因作物的方法，尤 指在反應中一次並行檢測5種商業化轉基因成分的蛋白質晶片方法和試劑盒。已有的專利 是利用ELISA試紙條方法進行檢測，每種成分都需要檢測一次，耗費時間，不利於現場快速 檢測。我們通過選擇商品化的轉基因成分的蛋白質的抗體，將其作為探針固定於修飾過的 支持物上，將待檢成分經前處理後加入到晶片矩陣中，再加入標記的抗體，採用雷射共聚焦 掃描儀對結果進行檢測，可一次性直接確定待檢的樣品中有無需要檢測的成分，結果判讀 直觀、明確、快速，而且操作簡單、快速。適用於對商業化轉基因作物的簡單、快速檢測，可用 於檢測機構實驗室對於進出口商品的標識復驗，轉基因育種研究單位對轉基因作物田間快 速篩查等，屬於檢驗檢疫領域。
背景技術：
轉基因技術使開發農作物新品種的時間大為縮短，研究人員利用轉基因技術培育 出了抗除草劑、抗乾旱、耐鹽鹼、抗重金屬和抗病蟲害、營養價值高的品種，這對於提高糧食 產量、減少收穫後損失以及增加農產品營養價值具有重要作用。隨著轉基因技術的發展，越 來越多的轉基因作物新品種被培育出來。多個國家和地區相繼批准了轉基因作物進入商業 化生產，種植面積急劇擴大。然而轉基因作物在帶來巨大社會和經濟效益的同時也存在許 多問題，主要集中在轉基因食品的安全性及對生態環境的安全性方面。轉基因食品對人類健康及生態環境的潛在影響日益受到人們的普遍關注，轉基因 食品的安全性不容忽視。世界各國都在加強對轉基因食品的管理，美國、歐盟、日本、加拿大 都已制定了對轉基因食品進行標籤標識管理的法規，歐盟(EC)49/2000號條例規定食品中 含有超過的轉基因成分時，必須在標籤上做出標識。為了加強對農業轉基因生物的安全管理，保障人體健康，規範轉基因產品的銷售 行為，引導和保護消費者的知情權，2002年中國農業部頒布了《農業轉基因生物標識管理辦 法》，2006年通過了《中華人民共和國農產品質量安全法》，明確規定在中國境內銷售列入標 識的轉基因生物及其產品，必須進行是否含有轉基因成分的標識。轉基因作物標識管理必 須以有效的檢測方法為基礎。因此，建立針對轉基因作物快速檢測方法具有十分重要的現
眉、ο目前國際上，對轉基因產品採取的主要檢測方法是建立在核酸水平上的PCR檢 測，包括競爭 PCR(competitive PCR)、實時定量 PCR(Real-time PCR)、PCR-ELISA 方法；建 立在蛋白質水平上的Western印記、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和免疫試紙條的檢測方 法。由於這些方法存在操作步驟繁瑣，檢測時間較長；不適合於現場實時檢測和跟蹤檢測； 檢測成本過高；對檢驗人員的知識、操作水平和儀器水平要求過高等不足之處，方法較難普 及。蛋白晶片的技術原理最早由Roger Ekin在上世紀80年代提出，它將大量蛋白質 分子按預先設置的排列固定於一種載體表面形成微陣列，根據蛋白質分子間特異性結合的原理，構建微流體生物化學分析系統，以實現對生物分子準確、快速、大信息量的檢測，使用 5種抗體固定於基片上，可特異性結和需檢測的轉基因蛋白成分，相比於ELISA及試紙條方 法，具有高通量、檢測時間更短的特點，因此在轉基因檢測上明顯優於傳統方法。本發明首次基於以商品化轉基因成分和蛋白質晶片技術建立轉基因蛋白晶片檢 測技術應用於轉基因作物的檢測，提供了針對商業化轉基因作物成分的蛋白質晶片、試劑 盒和檢測方法。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種特異性強、靈敏度高、通量高的檢測轉基因作物 的蛋白質晶片。本發明的另一個目的是提供快速、準確、便於結果判定的檢測轉基因作物的檢測 試劑盒(基於蛋白質晶片)。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案選擇以商業化的轉基因作物轉基因成分的蛋白質作為抗原，以抗原抗體免疫反應 為基礎，設計相應的抗體成分。一組檢測轉基因作物的蛋白質抗體，如下l)Bt crylAc/Ab 單克隆抗體DClO DB22) Bt cryIAh 單克隆抗體CBlO DClO3)植酸酶PHY單克隆抗體Ab01 Ab024)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體5)耐鹽IrrE多克隆抗體其中抗體1)、2)和3)分別為檢測轉基因成分Bt cry lAc/Ab, Bt cry IAh和植酸酶 蛋白質的單克隆抗體對，抗體4)和5)為檢測轉基因成分抗草甘膦G2-EPSPS蛋白質和耐 鹽IrrE蛋白質的多克隆抗體；作為二次結合的抗體，使用螢光素標記。我們採用蛋白晶片檢測技術建立了轉基因作物檢測方法，對反應的各種條件進行 了優化，其中包括基片修飾的優化，點樣緩衝液的優化，點樣濃度的優化，標記二抗使用濃 度的優化，螢光素與二抗標記的比例優化，封閉條件的優化。檢測轉基因成分的蛋白質晶片設計方案為4行六列，每點3個重複，點間距為450 微米，一張晶片12個點陣。點陣分布如下表所示 1)抗體來自中國農科院生物技術研究所2)質量體系控制點(QC)為Cy3標記的BSA3)空白對照(BC)為點樣緩衝液和IXPBS4)陰性對照(NC)為10mg/ml的BSA溶液由於基片修飾、點樣緩衝液、點樣濃度、樣品和基片反應條件、封閉液、清洗液以及反應時間對晶片反應後信號強度有一定影響，通過優化，確定了最佳晶片製作體系，見下表。表2建立的晶片製作和反應體系 6)晶片掃描條件使用共聚焦雷射掃描儀，設置合適的參數。試劑盒成分有l)Bt (巧認(3/^13單克隆抗體，2)8〖cryIAh單克隆抗體，3)植酸酶 PHY單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體，6)檢測用蛋 白質晶片7)螢光素，8)清洗液本發明的優點1)快速檢測時間僅為1. 5-2小時；2)特異由於採用了蛋白質抗原抗體特異性結合，每種抗體重複點制三次，從而 使結果準確性大大提高；3)高通量本發明能夠同時檢測包括:l)Bt crylAc/Ab蛋白，2)Bt cryIAh蛋白， 3)植酸酶PHY蛋白，4)抗草甘膦G2-EPSPS蛋白，5)耐鹽IrrE蛋白；4)穩定重複性試驗結果顯示所建立方法的穩定性良好。
圖1是本發明可用於轉基因產品檢測的蛋白質晶片的一種結構圖；圖2是本發明可用於轉基因產品檢測的蛋白質晶片圖1的方陣的陽性圖。圖3是本發明可用於轉基因產品檢測的蛋白質晶片圖1的方陣的陰性圖。
具體實施例方式本發明可用於轉基因產品檢測的蛋白質晶片，其結構是在平面型支撐載體的平面 上被覆有修飾材料的膜層，在該膜層的表面以點陣方式排布有轉基因農產品檢測用的外源 蛋白質探針。其中所說的該平面型支撐載體，可以採用目前同類技術中已有使用的玻璃片、 矽片等材料製成的片狀支持基體中的一種。該平面型支撐載體上被覆的修飾材料的膜層， 可以為環氧或PSG材料膜層。以點陣方式排布於該膜層表面處的供轉基因農產品用的蛋白 質探針，可以採用平面附著的方式位於所說的該修飾材料膜層的表面，使用接觸式點樣方 式完成這個目的。如圖1所示的可用於轉基因農產品檢測的基因晶片中，在常用的玻片、矽片的平 面型支撐載體的平面上，被覆有膜層材料，該膜層材料可以為環氧或PSG材料膜層中的一種。在該膜層的表面上以平面附著的點陣方式排布有供多種轉基因植物進行判斷用的蛋 白質探針，這些探針包括l)Bt (巧認(3/^13單克隆抗體，2)8〖cryIAh單克隆抗體，3)植酸酶 PHY單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體。該點陣方式 排布是每個外源蛋白質探針集中於該材料膜層表面處的一個區域內的形式。圖2所示的可用於轉基因農產品檢測的蛋白質晶片的結構是圖1的一個矩陣的結 構放大圖，每個外源蛋白質探針平行3個點，以取得準確的結果。具體製備方法(一 )可用於轉基因產品檢測的蛋白質晶片的製備將預先製備好的轉基因成分蛋白質的抗體稀釋成合適的濃度，按照實驗要求將各 種濃度的抗體和對照以及質量控制液按順序排列於384孔板中，用於蛋白質晶片的點制； 這些抗體和對照包括l)Bt (巧認(3/^13單克隆抗體，2)8〖cryIAh單克隆抗體，3)植酸酶PHY 單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體，6)質量控制點 (QC), 7)空白對照(BC)，8)陰性對照點(NC)，該5個抗體均使用標準抗體製備方法製得。蛋 白質晶片由arrayer (博奧生物晶片公司，中國)機器手，使用直徑為0. 4mm的針點制，蛋白 質晶片載體為環氧基修飾的玻片，每張晶片上有12個重複的一級矩陣，每個矩陣為4X6的 二級點陣，每個樣品點在二級陣中平行三次重複以驗證試驗的重複性。( 二)抗原抗體反應及信號檢測將檢測用蛋白質晶片置於晶片反應盒中，盒下部小孔中滴加數滴蒸餾水，提供溼 盒反應環境；將抗原蛋白質稀釋到適合的濃度，每陣加30μ 1抗原蛋白質，溼盒中室溫反應 30分鐘；清洗液(PBST)震蕩清洗5分鐘，室溫1500rpm離心甩幹；將標記好的抗體每陣加 30 μ 1，溼盒中室溫反應30分鐘，清洗液(PBST)震蕩清洗5分鐘，室溫1500rpm離心甩幹； 雷射共聚焦掃描儀掃描，參數設置laserpower-PMT-90-600/700，進行信號檢測。
權利要求
一組基於蛋白質晶片的檢測轉基因作物的抗體成分如下1)Bt cry1Ac/Ab單克隆抗體DC10，2)Bt cry1Ah單克隆抗體CB10，3)植酸酶PHY單克隆抗體Ab01，4)抗草甘膦G2 EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體其中抗體1)、2)和3)分別為檢測轉基因成分Bt cry1Ac/Ab、Bt cry1Ah和植酸酶蛋白質的單克隆抗體，抗體4)和5)為檢測轉基因成分抗草甘膦G2 EPSPS蛋白質和耐鹽IrrE蛋白質的多克隆抗體。
2.一種基於蛋白質晶片可簡單快速進行結果判定的轉基因作物檢測試劑盒，由以下組 分組成1)BtcrylAc/Ab單克隆抗體2)Bt cryIAh單克隆抗體3)植酸酶PHY單克隆抗體4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體5)耐鹽IrrE多克隆抗體6)檢測用蛋白質晶片7)螢光素8)陰性對照稀釋液；9)蛋白質晶片
3.根據權利要求2所述的轉基因作物檢測試劑盒，其特徵在於所述檢測抗體名稱為1)BtcrylAc/Ab 單克隆抗體 DB22)Bt cryIAh單克隆抗體DClO3)植酸酶PHY單克隆抗體Ab024)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體5)耐鹽IrrE多克隆抗體其中抗體1)、2)和3)分別為檢測轉基因成分Bt crylAc/Ab.Bt crylAh和植酸酶蛋白 質的單克隆抗體，抗體4)和5)為檢測轉基因成分抗草甘膦G2-EPSPS蛋白質和耐鹽IrrE 蛋白質的多克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種可用於轉基因產品檢測的蛋白質晶片。它是在平面型支撐載體的平面上被覆有修飾材料的膜層，在該膜層的表面以點陣方式排布有供轉基因農產品檢測用的蛋白質抗體探針，這些蛋白質抗體探針包括1)Bt cry1Ac/Ab單克隆抗體，2)Bt cry1Ah單克隆抗體，3)植酸酶PHY單克隆抗體，4)抗草甘膦G2-EPSPS多克隆抗體，5)耐鹽IrrE多克隆抗體，本發明進一步提供了一種基於抗原抗體反應的可簡單快速進行結果判定的轉基因作物檢測晶片試劑盒，屬於檢驗檢疫領域。本發明的優點1)快速檢測時間僅為1.5-2小時；2)特異由於採用了蛋白質抗原抗體特異性結合，每種抗體重複點制三次，從而使結果準確性大大提高；3)高通量本發明能夠同時檢測5種商業化轉基因成分的蛋白質；4)穩定重複性試驗結果顯示所建立方法的穩定性良好。
文檔編號C07K16/16GK101914156SQ201010257618
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者喬彩霞, 凌鳳俊, 劉輝, 吳丹, 周琦, 張偉, 張利峰, 張瑞宏, 張維, 李東燕, 林敏 , 柏亞鐸, 段向英, 汪琳, 蒲靜, 谷強, 賴平安, 邢佑尚, 高志強, 齊晶 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局;中國農業科學院生物技術研究所