一種古代人類遺存物質dna的提取方法
2023-05-30 00:58:26
專利名稱：一種古代人類遺存物質dna的提取方法
技術領域：
本發明涉及古代人類DNA提取與純化，特別涉及一種古代人類遺存物質DNA的提取方法，該方法能夠防止內源性和外源性汙染和提高提取成功率。
背景技術：
目前，古DNA提取方法主要是借鑑法醫學上的一些提取方法，這些提取方案一般首先通過打磨樣品表面或者用線鋸鋸掉樣品表面1-2mm，紫外照射，70％乙醇洗滌去除樣品表面外源DNA汙染，然後將樣品在液氮中研磨成粉末進行樣品前期處理。具體來說主要有以下三種不同的提取方案蛋白酶K/苯酚—氯仿法、二氧化矽法及異硫氰酸胍—二氧化矽法。
I.蛋白酶K/酚—氯仿法(ThomasWKetal.1990)的步驟是1.稱取樣品0.5g，加入50ml離心管中，並加入EDTA(0.5MpH8.0)溶液15ml，在室溫下振蕩脫鈣處理過夜(24h)；2.2500rpm離心10min，棄去上層溶液，重新加入15mlEDTA溶液，於室溫下振蕩過夜；3.2500rpm離心去除上層溶液，用重蒸水洗滌去除殘留的EDTA；4.向各樣品中加入5ml蛋白酶K緩衝液，於55℃振蕩過夜；5.90℃放置5min使蛋白酶K失活，2500rpm離心10min，保留上清液，用等體積平衡酚抽提一次，再用等體積苯酚/氯仿(1∶1)抽提一次，最後用等體積氯仿/異戊醇(24∶1)抽提，每次都取上層溶液；6.向各管中加入等體積的80％冰乙醇，搖勻靜置5min。用濾除分子量30kDa的超濾離心管離心過濾，加100μlTE緩衝液洗脫，收集洗脫液，即為含有古DNA片段的提取液。
II.二氧化矽法(CarterMJetal.1993；YangDYetal.1998)的步驟是1.在裝有0.5g骨粉的離心管中加入提取緩衝液8ml，於55℃水浴中振蕩5-6h；2.樣品液於37℃水浴中繼續振蕩溫育24h，90℃放置5min使蛋白酶K失活；3.離心3000rpm離心3min，棄去沉澱，保留上清液；4.用等體積平衡酚抽提一次，再用等體積苯酚/氯仿(1∶1)抽提一次，最後用等體積氯仿/異戊醇(24∶1)抽提，每次都取上層溶液；5.將二氧化矽懸浮液(1/10體積)加入樣品液，加入2倍體積6M碘化鈉，混勻後，室溫放置5min吸附DNA，3500rpm離心30s，將上清液重新吸附一次；6.3500rpm離心30s，棄上清。用等體積80％冰乙醇溶液重懸沉澱，3500rpm離心30s，棄上清，重複洗滌一次。45℃乾燥3min，烘乾沉澱。
7.100μlTE重懸沉澱，45℃溫育3min，5000rpm離心30s，收集上清即為DNA溶液。
III.異硫氰酸胍—二氧化矽法(Hss.Metal.1993；Baron.Hetal.1996)的步驟是1.稱取0.5g骨粉，加入10ml0.5MEDTApH8.0溶液，在室溫下振蕩7h；2.3400rpm離心10min，棄去上清液，加入4ml消解緩衝液，於56℃振蕩溫育12h；3.3400rpm離心10min，保留上清液，向每個離心管中加入1/10體積的二氧化矽懸浮液，充分搖勻，在室溫下緩慢振蕩10-20min；4.1500rpm離心2min，使二氧化矽完全沉積於底部，棄去上清液；5.用1.5ml提取緩衝液洗滌二氧化矽沉澱，將洗滌懸濁液移入經紫外照射的1.5ml離心管；
6.分別用70％冰乙醇和丙酮洗滌二氧化矽沉澱，每次於1300rpm離心4min，棄去上清液；7.二氧化矽沉澱於室溫下乾燥15min，加入120μ1TE緩衝液重懸二氧化矽沉澱，56℃溫育10min，然後於13000rpm離心5min，使二氧化矽完全沉澱，吸取上清液，即為含有DNA片段的提取液。
但是通過上述這些提取方案得到的DNA片段提取液，成功率都低於30％(Herrmann.Betal.1994；MacHughDeetal.2000)，究其原因，其主要缺陷就是不能有效地去除裂解液中殘留的蛋白、有機試劑等，不能充分的回收裂解液中的DNA片斷；並且這些提取方案在控制內源性和外源性汙染上表現一般，容易在提取過程出現假陽性的情況。隨著古DNA技術的深入發展，迫切需要開發防止汙染和提高提取成功率的技術方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種新的古代人類遺存物質DNA提取方法，該方法結合等離子體處理有效地防止骨骼內源性和外源性微生物汙染，降低假陽性出現機率；通過採用二氧化矽吸附柱吸附及超濾離心管(3kDa)過濾，顯著地提高了古代DNA模板含量，為後續進行的目的片斷擴增、序列分析、基因克隆等分子生物學操作打下良好的基礎。
為了實現上述任務，本發明採取如下的技術解決方案一種古代人類遺存物質DNA的提取方法，其特徵在於，該方法採用等離子體等處理骨骼樣品，使骨骼樣品的內表面的有機汙染物質被分解，快速清除骨骼樣品的表面和內表面汙染，然後通過二氧化矽吸附柱吸附及超濾離心管(3kDa)過濾等過程進行DNA的提取；具體包括下列步驟1)對打磨表面後經次氯酸處理表面的骨骼樣品進行紫外線照射30min，然後用70％的乙醇洗滌兩次，去除外源微生物DNA汙染；2)將骨骼樣品放置在等離子體處理反應器中，採用外電極、射頻功率發生器進行流動式射頻放電，放電時間1～10min；同時在等離子體處理反應器中加入Ar/O2為9∶1的等離子體對骨骼樣品處理，處理後的骨骼樣品從等離子體處理反應器中取出，在空氣中放置10min，然後進行古DNA提取；3)液氮處理骨骼樣品，把骨骼樣品研磨成粉末，作為DNA提取樣品；4)取DNA提取樣品，加入提取緩衝液5ml，於37℃振蕩過夜；過夜後的DNA提取樣品轉入空氣浴內振蕩，於55℃繼續振蕩溫育6h，然後於95℃放置5min，使多餘的蛋白酶K失活；5)2500rpm離心10min，吸出上清液，移入至另一經消毒的50ml離心管中；6)用和上清液等體積的平衡酚、苯酚/氯仿、氯仿/異戊醇三種溶劑依次各抽提一次，每次都取上層溶液，合併抽提液，振蕩放置10min，然後於2500rpm離心5min，得到上清液；7)將上清液置於真空旋轉蒸發儀中濃縮至300μl，加入等體積100％冰乙醇，充分混勻，將其加入二氧化矽吸附柱，於12000rpm離心30s，棄掉廢液，得到含有遺存物質DNA的溶質；8)用500μl的80％冰乙醇對溶質漂洗兩次，12000rpm離心2min，然後於室溫下放置10min，使殘留的乙醇完全揮發；9)將吸附柱轉入一個經消毒的離心管中，加入160μlTE洗脫液，在60～70℃水浴中預熱，室溫放置5min，12000rpm離心30s，保留洗脫液；10)將洗脫液再次加入二氧化矽吸附柱中，室溫放置10min，12000rpm的離心機中離心30s，保留洗脫液；11)將步驟12)的洗脫液轉入1.5ml超濾離心管中，於5000rpm離心10min；向超濾離心管中加入100μlTE緩衝液，室溫放置2min，收集洗脫液，即為含有古DNA片段的溶液。
等離子體是氣體經電離產生大量帶電粒子(離子、電子)和中性粒子(原子、分子)所組成的正負電荷的數目相等的集合體，一般等離子氣體有CF4、C2H6、CF3H、CF3Cl、NH3、N2、NO、O2、H2O、CO2、SO2、H2/N2、CF4/O2、O2/He、He、Ar、Kr、Ne、空氣等。
本發明的方法由於採用了等離子體等處理骨骼樣品，可以對骨骼多孔結構的內表面產生作用，可以對骨骼表面層深度幾十到幾百納米之間產生作用，使內表面可能的有機汙染物質被分解。能極快對表面和內表面汙染進行有效的清除。通過採用二氧化矽吸附柱吸附及超濾離心管(3kDa)過濾，顯著提高了古代DNA模板含量。
具體實施例方式
為了更清楚的理解本發明，申請人給出以下的實施例和與原有的方法進行比較，對本發明作進一步的詳細說明。以下是發明人給出的實施例。
實施例1按照本發明的方法，採用等離子體等處理骨骼樣品，使骨骼樣品的內表面的有機汙染物質被分解，快速清除骨骼樣品的表面和內表面汙染，然後進行DNA的提取；具體包括下列步驟1.古代人類的樣品，選用骨骼和牙齒，打磨表面5mm，再經次氯酸處理表面。
2.進行30min紫外(λ＝254nm)照射，70％乙醇洗滌兩次，去除外源微生物DNA汙染。
3.將樣品放置在等離子體處理反應器中，體系真空度達到10-1Pa，等離子體處理反應器內部包括樣品臺、外電極(AI)、真空計，離子體處理反應器上連接有射頻功率發生器、真空泵、Ar等離子體(
圖1)。射頻功率發生器對離子體處理反應器進行流動式射頻放電，其頻率13.56MHz，放電壓強50Pa，功率40W，放電時間5min。用Ar/O2(9∶1)等離子體處理骨骼樣品。處理後的骨樣品從反應器中取出，在空氣中放置10min再進行古DNA提取實驗。
4.液氮處理骨骼和牙齒樣品，在瑪銠研缽中把骨骼或牙齒樣品研磨成粉末，作為實驗樣品。
5.取骨粉和牙齒粉樣品各0.5g，加入提取緩衝液5ml(50mMTrispH8.0，0.2MEDTApH8.0，1mMNaCl，1.2mg/mlDTT，0.5％SDS，500μg/mlProteinaseK)，於37℃振蕩過夜。
6.將各樣品轉入空氣浴振蕩，於55℃繼續振蕩溫育6h，然後於95℃放置5min，使多餘的蛋白酶K失活。
7.2500rpm離心10min，小心吸出上清液，移入另一經經消毒的50ml離心管。
8.用等體積平衡酚(Tris-Hcl飽和PH8.0)、苯酚/氯仿(1∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)各抽提一次，每次都取上層溶液，加入抽提液後必須振蕩放置10min，然後於2500rpm離心5min。
9.將上清液於真空旋轉蒸發儀中濃縮至300μl，加入等體積100％冰乙醇，充分混勻，將其加入二氧化矽吸附柱，於12000rpm離心30s，棄掉廢液。
10.用500μl80％冰乙醇漂洗兩次，12000rpm離心2min，然後於室溫下放置10min，讓殘留的乙醇完全揮發。
11.將吸附柱轉入一個經消毒的離心管中，加入160μlTE洗脫液(60～70℃水浴預熱)，室溫放置5min，12000rpm離心30s，保留洗脫液。
12.將洗脫液再加入二氧化矽吸附柱中，室溫放置10min，12000rpm離心30s，保留洗脫液。
13.將上述洗脫液轉入1.5ml超濾離心管(型號為3kDa，商品化產品)，於5000rpm離心10min。
14.向超濾離心管中加入100μl的TE緩衝液，室溫放置2min，收集洗脫液，即為含有古DNA片段的溶液。
實施例2本實施例與實施1所不同的是射頻功率發生器的放電時間10min，其餘均同實施例1，同樣可以達到實施例1的目的。
實施例3本實施例與實施1所不同的是射頻功率發生器的放電時間1min，其餘均同實施例1，同樣可以達到實施例1的目的。
上述實施例可以列舉很多，經多次實驗證明，射頻功率發生器的放電時間在1min～10min，均可以較好的達到本發明的目的。
本發明的方法和傳統的提取方法結果對比
通過上表可以看出本發明方法在提取液濃度(λ＝260)、純度(A260/A280)上具有明顯優勢，並且在提取成功率上遠遠超出傳統提取方法。
權利要求
1.一種古代人類遺存物質DNA的提取方法，其特徵在於，該方法對古代人類的骨骼樣品，採用等離子體等處理，使骨骼樣品的內表面的有機汙染物質被分解，快速清除骨骼樣品的表面和內表面汙染，然後進行DNA的提取；具體包括下列步驟1)對打磨表面後經次氯酸處理表面的骨骼樣品進行紫外線照射30min，然後用70％的乙醇洗滌兩次，去除外源微生物DNA汙染；2)將骨骼樣品放置在等離子體處理反應器中，採用外電極、射頻功率發生器進行流動式射頻放電，放電時間1～10min；同時在等離子體處理反應器中加入Ar/O2為9∶1的等離子體對骨骼樣品處理，處理後的骨骼樣品從等離子體處理反應器中取出，在空氣中放置10min，然後進行古DNA提取；3)液氮處理骨骼樣品，把骨骼樣品研磨成粉末，作為DNA提取樣品；4)取DNA提取樣品，加入提取緩衝液5ml，於37℃振蕩過夜；過夜後的DNA提取樣品轉入空氣浴內振蕩，於55℃繼續振蕩溫育6h，然後於95℃放置5min，使多餘的蛋白酶K失活；5)2500rpm離心10min，吸出上清液，移入至另一經消毒的50ml離心管中；6)用和上清液等體積的平衡酚、苯酚/氯仿、氯仿/異戊醇三種溶劑依次各抽提一次，每次都取上層溶液，合併抽提液，振蕩放置10min，然後於2500rpm離心5min，得到上清液；7)將上清液置於真空旋轉蒸發儀中濃縮至300μ1，加入等體積100％冰乙醇，充分混勻，將其加入二氧化矽吸附柱，於12000rpm離心30s，棄掉廢液，得到含有遺存物質DNA的溶質；8)用500μl的80％冰乙醇對溶質漂洗兩次，12000rpm離心2min，然後於室溫下放置10min，使殘留的乙醇完全揮發；9)將吸附柱轉入一個經消毒的離心管中，加入160μlTE洗脫液，在60～70℃水浴中預熱，室溫放置5min，12000rpm離心30s，保留洗脫液；10)將洗脫液再次加入二氧化矽吸附柱中，室溫放置10min，12000rpm的離心機中離心30s，保留洗脫液；11)將步驟12)的洗脫液轉入1.5ml超濾離心管中，於5000rpm離心10min；向超濾離心管中加入100μlTE緩衝液，室溫放置2min，收集洗脫液，即為含有古DNA片段的溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的射頻功率發生器的頻率為13.56MHz，放電壓強為50Pa，功率40W。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的平衡酚的pH值為8.0，苯酚/氯仿的比例為1∶1，氯仿/異戊醇的比例為24∶1。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的骨骼樣品包括骨骼和牙齒。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的提取緩衝液的配方為50mM的Tris，pH8.0，0.2M的EDTA，pH8.0，1mM的NaCl，1.2mg/ml的DTT，0.5％SDS，500μg/ml的ProteinaseK。
全文摘要
本發明公開了一種古代DNA的提取方法，該方法採用等離子體等處理骨骼樣品，使骨骼樣品的內表面的有機汙染物質被分解，快速清除骨骼樣品的表面和內表面汙染，然後進行DNA的提取；包括打磨骨骼樣品表面，次氯酸處理，紫外照射，70％乙醇洗滌兩次，去除外源微生物DNA汙染，進一步用Ar/O
文檔編號C07K1/14GK1821265SQ20061004195
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月21日 優先權日2006年3月21日
發明者張虎勤, 張金, 劉芳娥, 葛宇 申請人:西安交通大學