色黴素A2、A3的生物合成及提純工藝的製作方法
2023-05-30 10:36:41
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及一種色黴素A2、A3的生物合成及提取純化工藝。
背景技術：
色黴素(Chromomycin)是一種糖基化聚酮化合物，屬於金黴酸家族的成員。色黴素和金黴酸類其它大多數抗生素一樣，已被研究證實具有良好的抗細菌、抗真菌以及抗癌活性。通過與位於DNA上富含GC的核苷酸序列相互作用，色黴素能夠抑制依賴DNA的RNA聚合酶，並抑制mRNA的合成，從而抑制癌細胞的分裂增殖。特別是對像腦癌、睪丸癌等病毒性腫瘤，色黴素具有顯著的抑制效果。此外，近期研究也發現，色黴素能夠刺激K562細胞進行紅系分化，在神經療法上能夠抑制神經細胞凋亡，並具備抗人類免疫缺陷病毒Ⅰ型的抗病毒活性。色黴素原產自灰色鏈黴菌7號，也是目前工業生產所採用的主要菌種。色黴素A3現已實現商業化生產，而色黴素A2與A4則是其生產過程中的副產物。產量較低、純度不足是目前色黴素生產的最主要問題，這也導致其售價居高不下。本發明通過過表達激活基因SrcmRI，同時敲除抑制基因SrcmRII構建的工程菌實現色黴素A2、A3的高產，獲得產物的純度相較於傳統生產方式更高，並且能夠顯著降低生產成本。
技術實現要素：
本發明為了解決上述現有技術中存在的缺陷和不足，提供了一種基於基因工程菌的色黴素A2、A3的高效生物合成及提取工藝。
本發明的技術方案：一種色黴素A2、A3的生物合成及提純工藝，包括下述步驟：
(1)SrcmRI基因過表達工程菌SR1的構建
以純化的鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI:5』-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3』和引物14-2-SARP-R-XbaI:5』-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3』，通過聚合酶鏈式反應擴增激活基因SrcmRI片段，擴增反應的條件為98℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，30個循環，利用限制性核酸內切酶HindIII和XbaI將上述擴增得到的基因片段連接到大腸桿菌-鏈黴菌穿梭載體pSET152的XbaI位點，即得本發明所需的SrcmRI基因過表達質粒pZJ183。參照《微生物學實驗》(第4版)介紹的方法，將該pZJ183質粒通過原生質體轉化導入鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株，即得本發明所需的重組工程菌株SR1。
(2)SrcmRII基因敲除工程菌SR2的構建
以純化的鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI:5』-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3』、PadRout-left-R-XbaI:5』-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3』和右臂引物PadRout-right-F-XbaI:5』-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3』、PadRout-right-R-HindIII:5』-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3』，通過聚合酶鏈式反應擴增一個包含有無功能ΔSrcmRII基因的2.3kb片段，擴增反應的條件為98℃15秒，60℃15秒，72℃100秒，30個循環。將上述擴增得到的片段克隆到大腸桿菌-鏈黴菌穿梭載體pKC1139的EcoRI/HindIII位點，即得本發明所需的SrcmRII基因敲除質粒pZJ196。參照《微生物學實驗》(第4版)介紹的方法，通過接合作用將基因敲除質粒pZJ196導入到鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株，將包含基因敲除質粒pZJ196的鏈黴菌roseiscleroticus菌株在MS固體培養基上28℃下培養20天，再分別挑取單菌落到3mL的TSBY液體培養基中，在28℃下培養5天，然後取50μL培養液塗布到ISP4固體培養基上。在37℃下培養5天，長出的菌株即為本發明所需的單交換突變株。將上述篩選得到的單交換突變株接種到不含有安普黴素的TSBY固體培養基上，在28℃下培養3代，然後挑選相同克隆分別接種到含有安普黴素的TSBY固體培養基與不含有安普黴素的TSBY固體培養基上，在37℃下培養5天，篩選出不能在含有安普黴素的TSBY固體培養基上生長，但能夠在不含有安普黴素的TSBY固體培養基上生長的菌落，即為本發明所需的雙交換突變工程菌株SR2。
(3)SrcmRI基因過表達和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的構建
將上述SrcmRI基因過表達質粒pZJ183通過接合作用導入到雙交換突變株SR2中，即得本發明所需的同時具有SrcmRI基因過表達和SrcmRII基因敲除的突變工程菌株SR3。
(4)工程菌在液體培養基中的發酵及產物萃取
將鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2與SR3分別接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L三角瓶中，在28℃、250rpm下培養2-5天。將上述液體培養液於3000×g下離心，分離發酵液和菌體細胞。用500mL乙酸乙酯萃取發酵液，重複萃取三次，菌體細胞用500mL甲醇萃取三次，合併來源於發酵液和菌體細胞的萃取液，利用旋轉蒸發儀進行減壓蒸餾濃縮，濃縮後的產物溶解於10mL甲醇。
(5)工程菌在固體培養基上的培養及產物萃取
將鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株、SR1、SR2與SR3分別接種到YEME固體培養基上，在28℃下培養7天。各取500g上述固體培養基，搗碎至固形物尺寸小於0.5cm，然後加入500mL乙酸乙酯-甲醇-甲酸(89:10:1)萃取液，在28℃，200rpm下震蕩30分鐘，收集萃取液，再用500mL乙酸乙酯萃取固體殘留物二次，合併萃取液。上述萃取液體在25℃，4000rpm下離心5分鐘，收集上清液，旋轉蒸發儀進行減壓蒸餾濃縮，濃縮後的產物溶解於3mL甲醇。
(6)色黴素的純化和分析
將上述(5)或(6)中的提取溶液在HPLC上用Agilent eclipse plus C18色譜柱(5μm,4.6×250mm)分離，用流速為1mL/min的包含0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在45分鐘內，乙腈-水的體積比由10:90逐漸提高到90:10，收集25.8-26.5分鐘和29.4-30.3分鐘的產物流出液，即為分離得到純的化合物；對上述兩個化合物進行核磁共振和質譜分析，證實這兩個化合物分別是色黴素A3、色黴素A2。
與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：
(1)本發明通過基因工程菌的構建形成一套高產色黴素A2及A3的方法；
(2)本發明所採用的色黴素生產方法產量高，副產物少，產物提純工藝簡單；
(3)本發明操作過程易控制，無汙染，生產成本低。
附圖說明
圖1為色黴素A2的結構圖；
圖2為色黴素A3的結構圖；
圖3為使用液相色譜純化色黴素A2及A3的檢測結果圖；
圖4為色黴素A2及A3的質譜檢測結果圖。
具體實施方式
下面結合實施例、附圖和表格對本發明作進一步詳細的說明，但並不是對本發明保護範圍的限制。
實施例1
SrcmRI基因過表達工程菌SR1的構建
以純化的鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI:5』-AATCTAGAGGAGGAGCCCATATGAGCTCCGACAGCGACTGCA-3』和引物14-2-SARP-R-XbaI:5』-AATCTAGATCAGCCGGCCCGGCGCTGCC-3』，通過聚合酶鏈式反應擴增激活基因SrcmRI片段，擴增反應的條件為98℃15秒，60℃15秒，72℃30秒，30個循環，利用限制性核酸內切酶HindIII和XbaI將上述擴增得到的基因片段連接到大腸桿菌-鏈黴菌穿梭載體pSET152的XbaI位點，即得本發明所需的SrcmRI基因過表達質粒pZJ183。參照《微生物學實驗》(第4版)介紹的方法，將該pZJ183質粒通過原生質體轉化導入鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株，即得本發明所需的重組工程菌株SR1。
上述鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 53903。pSET152質粒載體購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；DNA聚合酶、限制性核酸內切酶HindIII和XbaI購自寶生物工程(大連)有限公司；引物14-2-SARP-F-XbaI-NdeI和14-2-SARP-R-XbaI訂購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
實施例2
SrcmRII基因敲除工程菌SR2的構建
以純化的鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株基因組DNA為模板，使用左臂引物PadRout-left-F-EcoRI:5』-AAAGAATTCTACTCGCCGGAGTGCGCACGGTCGAA-3』、PadRout-left-R-XbaI:5』-AAATCTAGACTTCTTCGCGCAGCTTGCGCAGCT-3』和右臂引物PadRout-right-F-XbaI:5』-AAATCTAGACGTACCGCTGTCGCCGCGAT-3』、PadRout-right-R-HindIII:5』-AAAAAGCTTATGATCTCGATCATCGAGCG-3』，通過聚合酶鏈式反應擴增一個包含有無功能ΔSrcmRII基因的2.3kb片段，擴增反應的條件為98℃15秒，60℃15秒，72℃100秒，30個循環。參照《微生物學實驗》(第4版)介紹的方法，通過接合作用將基因敲除質粒pZJ196導入到鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株，將包含基因敲除質粒pZJ196的鏈黴菌roseiscleroticus菌株在MS固體培養基上培養20天，再分別挑取單菌落到3mL的TSBY液體培養基中，在28℃下培養5天，然後取50μL培養液塗布到ISP4固體培養基上。在37℃下培養5天，長出的菌株即為本發明所需的單交換突變株。將上述篩選得到的單交換突變株接種到不含有安普黴素的TSBY固體培養基上，在28℃下培養3代，然後挑選相同克隆分別接種到含有安普黴素的TSBY固體培養基與不含有安普黴素的TSBY固體培養基上，在37℃下培養5天，篩選出不能在含有安普黴素的TSBY固體培養基上生長，但能夠在不含有安普黴素的TSBY固體培養基上生長的菌落，即為本發明所需的雙交換突變工程菌株SR2。
所述MS固體培養基中各組分用量佔MS固體培養基質量用量的百分比分別為：硝酸鉀0.19％；硝酸銨0.165％；磷酸二氫鉀0.017％；七水硫酸鎂0.037％；二水氯化鈣0.044％；碘化鉀0.000083％；硼酸0.00062％；四水硫酸錳0.00223％；七水硫酸鋅0.00086％；二水鉬酸鈉0.000025％；五水硫酸銅0.0000025％；氯化鈷0.0000025％；乙二胺四乙酸二鈉0.00373％；七水硫酸亞鐵0.00278％；肌醇0.01％；甘氨酸0.0002％；鹽酸硫胺素0.00001％；鹽酸吡哆醇0.00005％；煙酸0.00005％；蔗糖3％；瓊脂0.7％；滅菌；所述TSBY液體培養基中各組分用量佔TSBY培養基質量用量的百分比分別為：胰蛋白腖1.5％；大豆蛋白腖0.5％；氯化鈉0.5％；pH 7.2；根據所需滅菌後添加安普黴素50μg/mL；所述TSBY固體培養基中各組分用量佔TSBY培養基質量用量的百分比分別為：胰蛋白腖1.5％；大豆蛋白腖0.5％；氯化鈉0.5％；瓊脂2％；pH 7.2；根據所需滅菌後添加安普黴素50μg/mL；所述ISP4固體培養基中各組分用量佔ISP4固體培養基質量用量的百分比分別為：可溶性澱粉1％；磷酸氫二鉀0.1％；七水硫酸鎂0.1％；氯化鈉0.1％；硫酸銨0.2％；碳酸鈣0.2％；七水硫酸亞鐵0.0001％；七水氯化錳0.0001％；瓊脂2％；滅菌後添加安普黴素50μg/mL；
上述pKC1139質粒載體購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；DNA聚合酶、限制性核酸內切酶HindIII和XbaI購自寶生物工程(大連)有限公司；引物PadRout-left-F-EcoRI，PadRout-left-R-XbaI，PadRout-right-F-XbaI和PadRout-right-R-HindIII訂購自生工生物工程(上海)股份有限公司。上述的配製培養基所用的化學試劑購自杭州華東醫藥集團有限公司，生化試劑購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。
實施例3
SrcmRI基因過表達和SrcmRII基因敲除工程菌SR3的構建
將上述SrcmRI基因過表達質粒pZJ183通過接合作用導入到雙交換突變株SR2中，即得本發明所需的同時具有SrcmRI基因過表達和SrcmRII基因敲除的突變工程菌株SR3。
實施例4
工程菌SR3在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR3接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養2天。取500mL的上述液體培養液於3000×g下離心，分離發酵液和菌體細胞。用等量乙酸乙酯進行3小時的發酵液萃取，重複操作三次，菌體細胞用500mL甲醇萃取三次，合併來源於發酵液和菌體細胞的萃取液，利用旋轉蒸發儀進行減壓蒸餾濃縮，濃縮後的產物溶解於10mL甲醇。
將上述溶液在HPLC上用Agilent eclipse plus C18色譜柱(5μm,4.6×250mm)分離，用流速為1mL/min的包含0.1％甲酸的乙腈-水混合液梯度洗脫，在45分鐘內，乙腈-水的體積比由10:90逐漸提高到90:10，收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到110.2mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到137.5mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2；色黴素A2及A3的結構如圖1所示；色黴素A2及A3的核磁共振數據如表1所示；使用液相色譜純化目標化合物過程的檢測結果如圖2所示；色黴素A2及A3的質譜檢測結果如圖3所示。
所述YEME液體培養基中各組分用量分別是：(以總體積1L為例)酵母提取物3g；細菌蛋白腖5g；麥芽浸粉3g；葡萄糖10g；蔗糖340g；滅菌。
上述的配製培養基所用的化學試劑購自杭州華東醫藥集團有限公司，生化試劑購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。
實施例5
工程菌SR3在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR3接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養3天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到144.8mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到158.3mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例6
工程菌SR3在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR3接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養4天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到145.1mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到156.1mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例7
工程菌SR3在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR3接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養5天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到142.2mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR3的液體培養物中分離得到157.1mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例8
工程菌SR2在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR2接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養2天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到87.2mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到90.3mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例9
工程菌SR2在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR2接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養3天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到101.3mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到108.2mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例10
工程菌SR2在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR2接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養4天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到98.8mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到107.9mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例11
工程菌SR2在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR2接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養5天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到100.3mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR2的液體培養物中分離得到108.6mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例12
工程菌SR1在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR1接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養2天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到19.6mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到20.3mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例13
工程菌SR1在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR1接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養3天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到33.1mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到35.9mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例14
工程菌SR1在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR1接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養4天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到32.6mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到35.4mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例15
工程菌SR1在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將SR1接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養5天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到33.4mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR1的液體培養物中分離得到36.2mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例16
野生型菌株在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養2天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘和29.4-30.3分鐘流出液，最終未從鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株的液體培養物中得到色黴素A3或A2。
實施例17
野生型菌株在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養3天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘和29.4-30.3分鐘流出液，最終未從鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株的液體培養物中得到色黴素A3或A2。
實施例18
野生型菌株在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養4天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘和29.4-30.3分鐘流出液，最終未從鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株的液體培養物中得到色黴素A3或A2。
實施例19
野生型菌株在液體培養基中發酵及產物萃取、純化和分析
將鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株接種到裝有500mL YEME液體培養基的2L燒瓶中，在28℃、250rpm下培養5天。發酵液提取、純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘和29.4-30.3分鐘流出液，最終未從鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株的液體培養物中得到色黴素A3或A2。
實施例20
工程菌SR3在固體培養基上培養及產物萃取、純化和分析
將SR3接種到YEME固體培養基上，在28℃下培養7天。各取500g上述固體培養基，搗碎至固形物尺寸小於0.5cm，然後加入500mL乙酸乙酯-甲醇-甲酸(89:10:1)萃取液，在28℃，200rpm下震蕩30分鐘，收集萃取液，再用500mL乙酸乙酯萃取固體殘留物二次，合併萃取液。上述萃取液體在25℃，4000rpm下離心5分鐘，收集上清液，旋轉蒸發儀進行減壓蒸餾濃縮，濃縮後的產物溶解於3mL甲醇。純化操作同實施例5；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR3的固體培養物中分離得到198.3mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR3的固體培養物中分離得到231.8mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
所述YEME固體液體培養基中各組分用量分別是：(以總體積1L為例)酵母提取物3g；細菌蛋白腖5g；麥芽浸粉3g；葡萄糖10g；蔗糖340g；瓊脂20g；滅菌。
實施例21
工程菌SR2在固體培養基上培養及產物萃取、純化和分析
將SR2接種到YEME固體培養基上，在28℃下培養7天。萃取操作同實施例20，純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR2的固體培養物中分離得到218.6mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR2的培養物中分離得到122.5mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例22
工程菌SR1在固體培養基上培養及產物萃取、純化和分析
將SR1接種到YEME固體培養基上，在28℃下培養7天。萃取操作同實施例20，純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘流出液，最終從工程菌SR1的固體培養物中分離得到43.9mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A3；收集在29.4-30.3分鐘流出液，最終從工程菌SR1的培養物中分離得到44.4mg/L純的化合物；對該化合物進行了核磁共振和質譜分析，證明該化合物是色黴素A2。
實施例23
野生型菌株在固體培養基上培養及產物萃取、純化和分析
將鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株接種到YEME固體培養基上，在28℃下培養7天。萃取操作同實施例20，純化操作同實施例4；收集在25.8-26.5分鐘和29.4-30.3分鐘的流出液，最終未從鏈黴菌roseiscleroticus野生型菌株的固體培養物中分離得到色黴素A3或A2。
附表1：色黴素A2、A3的1H NMR數據(300MHz)