一種蛋白酶複合酶及其應用的製作方法

2023-05-30 06:17:11

專利名稱：一種蛋白酶複合酶及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬複合酶及其應用領域，特別是涉及一種蛋白酶複合酶及其應用。
背景技術：
羊毛織物是深受人們歡迎的一種高檔產品，有其他纖維織物無法比擬的優點，其 本身固有的性能使毛織物成為高檔紡織品。手感及染色性能是羊毛的重要特性，然而羊毛 外層附著有難於處理的緻密、疏水的鱗片層，影響羊毛手感及染色著色等多項指標，人們很 久以來就開發各種工藝去除鱗片層。在現有工廠化處理工藝中，以化學手段為主，如通過氯 水對羊毛表面氧化而提高染色親和性或柔化劑來改善手感，提高特性。這種處理是表面處 理，因為與角質層的反應時間不足10秒鐘。氯化作用增加了角質層的表面能量，因此在其 後使用的Herosettl25聚醯胺上氯醇型聚合物就可以均勻地覆蓋在纖維表面上。這種聚合 物通常用來增強紙類產品的溼強力，在水中可以膨脹至正常狀況厚度的10倍，因此能防止 相臨纖維的毛鱗片邊緣互相作用，在洗滌中產生氈化。這一處理過程通過一個改良的復洗 機來完成，每小時可處理羊毛條條子45條，處理羊毛超過500公斤。但是這些處理工藝最 大的缺點就是環境汙染，如形成Α0Χ，嚴重汙染環境，並會在織物上留有難以完全去除的殘 留物，危害人體健康。我國擁有世界上最大的紡織工業，其在我國工業體系中佔有舉足輕重 的地位，因此解決紡織工業中的環境汙染問題顯得十分緊迫，尋找合適的方法代替氯化工 藝的研究受到普遍重視。因此研究者想尋找另外的處理工藝，以等離子及電暈放電處理為代表的物理方法 處理羊毛織物，具有無汙染，效率高等優點，但此類方法成本高，難以產業化應用。研究和開 發羊毛經濟可行的除鱗片且強度損失不大的綠色環保工藝對節約能源和提高毛紡織品的 質量具有特殊意義，這也是目前羊毛前處理中的難點和熱點之一。酶提高羊毛品質工藝由於其高效無汙染特性，越來越受到人們重視，也是完全符 合綠色紡織品標準的工藝。目前開發應用於毛織物處理工藝以蛋白酶為主，普通蛋白酶不 能處理羊毛纖維外層鱗片層中所富含二硫鍵，因此必需藉助於氧化還原前處理。但是通過 化學方法處理後，蛋白酶再處理羊毛導致羊毛強度劇烈下降，關於此目前的主要機理是蛋 白酶對羊毛的水解是一種「表裡競爭」的關係，酶不僅在羊毛表面作用，同時也滲透進羊毛 纖維內部作用，導致的最終結果是羊毛纖維強度大大降低。由於毛纖維外層鱗片層中二硫 鍵的特殊穩固性，使用常規的蛋白酶效果很不明顯，有時甚至根本毫無作用(樊增祿等，「蛋 白酶對羊毛的作用機理研究」，2002，《紡織學報》)，所以，目前國內外的毛紡織物酶處理往 往要採用化學前處理，不僅沒有達到不使用化學試劑的目的，而且依然破壞了毛紡織物的 內部結構，其實際應用效果仍不理想。2006年《江蘇絲綢》第五期上文章「蛋白酶在毛紡織 物纖維改性方面的應用」指出利用蛋白酶改性毛紡織物，前處理(氧化或還原)是必須步 驟，目前尚未發現不需前處理即能達到毛紡織物抗氈縮效果的蛋白酶。人們也曾開發出樹 脂法整理工藝來提高纖維強度，但這種工藝造成嚴重的環境汙染，在實踐中未見有大量應 用。Jason Patrick McDevitt等在專利US006051033A中公開了用蛋白酶處理羊毛強度降
4低，然後用轉穀氨醯胺酶處理連接蛋白間斷裂的肽鍵，從而提高了蛋白纖維強度，但該工藝 增加了處理流程，提高了處理費用，市場前景不大，因此目前也未見有大規模推廣應用。因 此開發一種一步法處理毛織物鱗片層以降低毛織物氈縮率而不影響其纖維機械強度的新 類型蛋白酶及處理工藝具有十分重要的意義。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種蛋白酶複合酶及其應用，該複合酶，可以 直接作用於各類毛紡織物，省去了以往處理過程中的化學試劑前處理，氧化前處理；應用方 法簡單，適合於與工業化生產；經處理後的毛或毛織物在抗氈縮性和機械強度上均有提高， 處理後毛織物氈縮率小於5%。本發明的一種蛋白酶複合酶，其製備方法包括將微生物接種於培養基中，放置在溫度為25-40°C，轉速為120-200轉/分鐘的搖 床上培養24-96小時，酶或超聲破壁或不破壁處理，過濾菌體，加入硫酸銨10% -40%,攪拌 溶化，0°C _4°C放置12-24小時得培養液，IOOOOrpm離心10-20分鐘，得沉澱，加入0. 05mol/ LpH7. 8的Tris-HCl溶解，透析後冷凍乾燥得蛋白酶複合酶酶粉；或將微生物接種於發酵培養基，30°C發酵23-72小時，通氣量3-5L/min，攪拌速度 為120-600rpm，培養24-72小時，測得其角蛋白酶的最高酶活達30. 3U/mL ；終止發酵，過濾 或離心菌體，得到蛋白酶粗酶液。所述的微生物為細菌，放線菌或真菌。所述的微生物為假單胞菌(Pseudomonas) 3096-4 (CGMCC No. 3888)、嗜麥芽糖 寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) DHHJ CGMCC No. 2231、橄欖綠鏈黴菌 (Streptomycesolivaceus(ffaksman)ffaksman et Henrici)CGMCC No. 4. 943 g 肉 fe 曲 β (Aspergilluscarneus (Van. Teighem)Blochwitz)CGMCC No. 3. 3920。所述的假單胞菌(Pseudomonas) 3096-4 (CGMCC No. 3888)的保藏證明原件在名稱 為一種降解羊毛鱗片層的菌株中已提交。
假單胞菌(Pseudomonas) 3096-4已於2010年6月1日保藏在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中科院微生物 研究所)，保藏號為CGMCC No. 3888。所述的培養基碳源為葡萄糖、澱粉、蔗糖、麥芽糖等。所述的培養基，每IOOml 含蛋白粉 l_4g，KCl 0. 01 0. lg,NaCl 0. 01 0. Igdi: 溫 800. 2 1. Og、磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 0. 1 1. Og、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 01 0. lg, pH 為 6. 2-7. 8。所述的培養基，每100ml含羊毛粉2g、KCl 0. 05g、NaCl 0.05g、磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)0. 5g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 05g、水 100ml，pH7. 5。、所述的培養基，每IOOrnl含可溶性澱粉2g、羊毛粉lg、MgSO4 · 7H20 0. 05g、KCl 0. 05g、FeSO4 · 7H20 0. 001g、K2HPO4O. 05g、水 100ml，pH6. 5。所述的培養基，每100ml 含蔗糖 2. 0g、羊毛粉 lg、MgSO4 · 7H20 0. 05g、KCl 0. 05g、 FeSO4 · 7H20 0. 001g、K2HPO4O. lg、水 100ml, pH 6. 2。所述的發酵培養基，每IOOmL含葡萄糖lg、羊毛粉2. 0g、乾酪素0. 2g、KCl 0.0373g、NaCl 0. 0294g、吐溫 80 0. 4g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 0. 4g、磷酸 二氫鉀 (KH2PO4) 0. 03g, pH 7. 4-7. 8。所述Tris-HCl與培養液體積比為1-4 1。所述的蛋白酶粗酶液在pH 6. 5-8. 0，5°C -30°C酶活穩定。本發明的蛋白酶複合酶由微生物產生，可為胞外酶，也可為胞內酶；該酶具有蛋白 酶活性，同時具有二硫鍵還原酶活性。蛋白酶複合酶為誘導酶，可由多種蛋白誘導表達，所 述蛋白包括哺乳動物毛髮，禽類羽毛，大豆粉，用量為每IOOmL培養基中添加l-4g。本發明的一種蛋白酶複合酶用於羊毛織物抗氈縮處理，處理方法包括將毛或毛織物加入0. 05mol/L Tris-HCl (pH7. 8)中，再加入權利要求1所述的蛋 白酶複合酶酶粉，調PH值為5. 0-8. 0，在溫度28-50°C，震蕩0. 5-10小時；所述毛或毛織物 與Tris-HCl的比例為1 10-40，每公斤毛織物中酶粉用量為0. 002_20g ；或將權利要求1所述蛋白酶粗酶液或稀釋2-10倍後的蛋白酶粗酶液，放入毛或毛 織物，浴比為1 20-40，pH為7. 0-8. 0，溫度為20_35°C，作用時間為30分鐘至4小時。所述蛋白酶粗酶液低溫乾燥後處理毛或毛織物時酶溶解濃度為0. 1-0. 5%。所述毛或毛織物，包括了多種哺乳動物原毛及其通過各種工藝生產的成品、半成 品、混紡或原料紡織品。所述的毛或毛織物為羊毛、羊毛織物或兔毛織物。為了更好說明本發明，先對下面涉及的一些專業名詞作一定義。二硫鍵還原酶能夠催化二硫鍵加氫形成兩個疏基的一類酶。蛋白酶水解蛋白質肽鍵的一類酶，能將蛋白質大分子內部肽鍵切斷，形成分子量 較小的肽或胺基酸。氈縮率水洗氈縮率，紡織物水洗後面積減少量佔水洗前面積量的比率。纖維強度纖維抗拉強度，指每平方毫米粗細的纖維或其他織物所能承受的而不 被破壞的拉力。通常纖維的抗拉強度達數百牛頓每平方毫米，性能良好的可達數千牛頓每 平方毫米，是纖維機械性能的一個指標。。手感對纖維和織物用手觸摸的感覺。包括纖維和織物的厚度、表觀比重、表面平 滑度、觸感冷暖、柔軟程度等因素的綜合感覺。蛋白酶活性測定方法在0.05mol/LpH 10的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝溶液中，將 ImL待測樣品溶液與ImL酪蛋白溶液在40°C恆溫水浴鍋中反應lh，加入2. OmL 10% TCA終 止反應。IOOOg離心IOmin0取ImL上清液，加入0. 5mL Folin-Ciocalteau酚試劑，在660nm
下測定吸光度。反應前即加TCA處理用作對照。酶活定義A66tl值每增加0. 1為1個單位 ⑶。二硫鍵還原酶活性測定方法lmL由待測樣品溶液、0. lmol/L pH 8的磷酸緩衝溶 液和蒸餾水按3 2 5比例混合組成的酶混合液與ImL 2mmol/L溶解於pH 7的磷酸緩衝 溶液中的氧化型穀胱甘肽，5mmol/L苯甲基磺醯氟(PMSF)在40°C恆溫水浴鍋中反應20min。 IOOOg離心lOmin，取1. 5 μ L上清液，加入50 μ L 二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)，靜置2min後 於420nm下測定吸光度並計算巰基含量。酶對照為除了加入ImL pH 7的磷酸緩衝溶液取 代氧化型穀胱甘肽外，其餘按同樣的方式進行。1個單位(U) 二硫鍵還原酶活性相當於每毫 升酶在40°C下每分鐘釋放出1 μ mol巰基。
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本發明的蛋白酶複合酶一步法處理毛織物。動物毛髮外表層鱗片層由富含二硫鍵 的特殊蛋白質角蛋白構成，正是由於鱗片層的存在造成其水洗後氈縮率高、有刺癢感、難染 色等問題。本發明製備的蛋白酶複合酶由於具有的二硫鍵還原酶活性，因此可打開鱗片層 二硫鍵，具有的蛋白酶活性可打開肽鍵。因此利用此類複合酶可單獨處理降解剝除鱗片層， 達到毛紡工業中的一步法防氈縮目的。有益效果(2)本發明的蛋白酶複合酶，可以直接作用於各類毛紡織物，省去了以往處理過程 中的化學試劑前處理，氧化前處理，避免了環境汙染和皮膚損傷；(3)本發明應用方法簡單，適合於與工業化生產；經本發明處理後的毛或毛織物 在抗氈縮性和機械強度上均有提高，處理後毛織物氈縮率小於5%，達到機可洗要求，同時 纖維強度沒有下降；(4)經過本發明處理後的毛或毛織物，手感得到改善，對人體皮膚的刺激性下降， 在很多方面具有羊絨的特點，因此，此方法也可用於仿羊絨製品的加工和生產中。


圖1處理後羊毛纖維效果的掃描電鏡圖；圖2未處理羊毛纖維效果的掃描電鏡圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例1以嗜麥芽糖寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) DHHJ (CGMCC No. 2231) (一種產角蛋白酶的菌株及其應用，申請號為2007101719394中已公開)為生產菌種，使用 以下培養基進行培養羊毛粉2g、KCl 0. 05g、NaCl 0. 05g、磷酸氫二鈉0. 5g、磷酸二氫鉀 0. 05g、水100ml，pH7. 5，置於500mL三角瓶中，在40°C和150rpm轉速條件下，恆溫培養72 小時後得到培養液。超聲波(150W，3分鐘)破壁處理，過濾菌體，加入硫酸銨10% -40%, 攪拌溶化，4°C放置12小時，IOOOOrpm離心10-20分鐘得沉澱，加入0. 05mol/L pH7. 8的 Tris-HCl IOOmL溶解，透析後冷凍乾燥得蛋白酶複合酶酶粉；離心後測得蛋白酶活為14U/mL，二硫鍵還原酶活為7U/mL。利用上述酶凍乾粉，使用其對單根羊毛纖維處理將5g單根羊毛放入IOOmL 0. 05mol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)，加酶量為 0. 002g,於 40°C，120rpm搖床上反應 60 分鐘。處理 效果見附圖1。實施例2UWiMM^UM (Streptomyces olivaceus (Waksman)Waksman et Henrici) (CGMCCNo. 4. 943)(購自中國微生物菌種保藏管理委員會，北京)為生產菌種，使用以下 培養基進行培養可溶性澱粉2g、羊毛粉lg、MgSO4 · 7H20 0. 05g、KCl 0. 05g、FeSO4 · 7H200. OOlg^K2HPO4O. 05g、水 IOOml，ρΗ6· 5，置於 500mL 三角瓶中，在 28°C和 150rpm轉速條件下， 恆溫培養72小時後得到培養液。離心分離後獲得上清液(胞外液)，蛋白酶活為12U/mL， 二硫鍵還原酶活為5U/mL。利用發酵液得到的胞外酶凍乾粉，使用其對羊毛織物處理凍幹 酶粉以0. 5%溶於0. 05mol/L PBS (pH7. 8)中，浴比1 25，50°C作用70分鐘。氈縮率(％ ) = (1-處理後毛織物面積/處理前毛織物面積)X 100減量率(％ ) = (1-處理後毛織物重量/處理前毛織物重量)X 100纖維強度測定應用纖維強度測定儀(H10K-S，Tiniius olsen Inc.，USA)測定，使 待測樣品在25°C，60%溼度條件下平衡24小時。將樣品剪成50mmX 50mm大小，經向夾在儀 器上，每邊留5mm。處理效果見表2。^ 2 WiMM^UM (Streptomyces olivaceus (Waksman)Waksman et Henrici) (CGMCC No. 4. 943)胞外酶處理對羊毛織物影響
權利要求
一種蛋白酶複合酶，其製備方法包括將微生物接種於培養基中，放置在溫度為25 40℃，轉速為120 200轉/分鐘的搖床上培養24 96小時，酶或超聲破壁或不破壁處理，過濾菌體，加入硫酸銨10％ 40％，攪拌溶化，0℃ 4℃放置12 24小時得培養液，10000rpm離心10 20分鐘，得沉澱，加入0.05mol/LpH7.8的Tris HCl溶解，透析後冷凍乾燥得蛋白酶複合酶酶粉；或將微生物接種於發酵培養基，30℃發酵23 72小時，通氣量3 5L/min，攪拌速度為120 600rpm，培養24 72小時；終止發酵，過濾或離心菌體，得到蛋白酶粗酶液。
2.根據權利要求1所述的一種蛋白酶複合酶，其特徵在於所述的微生物為假單 胞菌 Pseudomonas 3096-4CGMCC No. 3888、嗜麥芽糖寡養單胞菌 Stenotrophomonas maltophiIiaDHHJ CGMCC No. 2231、橄欖綠鏈黴菌 Sti^ptomyces olivaceus (Waksman) Waksman etHenrici CGMCC No. 4. 943 fe ft # Aspergillus carneus (Van. Teighem) BlochwitzCGMCC No. 3. 3920。
3.根據權利要求1所述的一種蛋白酶複合酶，其特徵在於所述的培養基，每IOOml 含蛋白粉 l_4g，KCl 0. 01 0. lg、NaCl 0. 01 0. lg、吐溫 80 0. 2 1. Og、磷酸氫二鈉 Na2HPO4O. 1 1. Og、磷酸二氫鉀 KH2PO4O. 01 0. lg, pH 為 6. 2-7. 8。
4.根據權利要求1所述的一種蛋白酶複合酶，其特徵在於所述的培養基，每100ml含 羊毛粉 2g、KCl 0. 05g、NaCl 0. 05g、磷酸氫二鈉 Na2HPO4O. 5g、磷酸二氫鉀 KH2PO4O. 05g、水 100ml,ρΗ7·5 ；或所述的培養基，每100ml含可溶性澱粉2g、羊毛粉lg、MgS04 ·7Η20 0. 05g、KC10. 05g、 FeSO4 · 7H20 0. 001g、K2HPO4O. 05g、水 100ml，pH6. 5 ；或所述的培養基，每100ml含蔗糖2. 0g、羊毛粉lg、MgSO4 · 7H20 0. 05g、KCl 0. 05g、 FeSO4 · 7H20 0. 001g、K2HPO4O. lg、水 100ml, pH 6. 2 ；或所述的發酵培養基，每IOOmL含葡萄糖lg、羊毛粉2. 0g、乾酪素0. 2g、KCl 0. 0373g、 NaCl 0. 0294g、吐溫 80 0. 4g、磷酸氫二鈉 Na2HPO4O. 4g、磷酸 二氫鉀 KH2PO4O. 03g, pH 7. 4-7. 8。
5.根據權利要求1所述的一種蛋白酶複合酶，其特徵在於所述Tris-HCl與培養液體 積比為1-4 1。
6.根據權利要求1所述的一種蛋白酶複合酶，其特徵在於所述蛋白酶複合酶為胞外 酶或胞內酶；該酶具有蛋白酶活性，同時具有二硫鍵還原酶活性。
7.一種蛋白酶複合酶用於羊毛織物抗氈縮處理。
8.根據權利要求7所述的一種蛋白酶複合酶用於羊毛織物抗氈縮處理，處理方法包括將毛或毛織物加入到0. 05mol/L pH7. 8 Tris-HCl中，再加入權利要求1所述的蛋白 酶複合酶酶粉，調PH值為5. 0-8. 0，在溫度28-50°C，震蕩0. 5-10小時；所述毛或毛織物與 Tris-HCl的比例為1 10-40，每公斤毛織物中酶粉用量為0.002-20g;或將權利要求1所述蛋白酶粗酶液或稀釋2-10倍後的蛋白酶粗酶液，放入毛或毛織 物，浴比為1 10-40，pH為7. 0-8.0，溫度為20-35°C，作用時間為30分鐘至4小時。
9.根據權利要求8所述的一種蛋白酶複合酶用於羊毛織物抗氈縮處理，其特徵在於 所述的毛或毛織物為羊毛、羊毛織物或兔毛織物。
10.根據權利要求8所述的一種蛋白酶複合酶用於羊毛織物抗氈縮處理，其特徵在於 所述反應的PH為7. 6，溫度為30°C。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白酶複合酶及其應用，製備方法包括將微生物接種於培養基中，放置在溫度為25-40℃，轉速為120-200轉/分鐘的搖床上培養24-96h，酶或超聲破壁或不破壁處理，過濾菌體，加入硫酸銨，沉澱蛋白，離心，加入Tris-HCl溶解，透析後冷凍乾燥；或將微生物接種於發酵培養基，30℃發酵23-72小時，攪拌速度為120-600rpm，培養24-72小時，終止發酵，過濾或離心菌體。本發明的複合酶，可以直接作用於各類毛紡織物，省去了以往處理過程中的化學試劑前處理，氧化前處理；應用方法簡單，適合於與工業化生產；經處理後的毛或毛織物在抗氈縮性和機械強度上均有提高，處理後毛織物氈縮率小於5％。
文檔編號C12R1/66GK101935642SQ201010216528
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者周美華, 張興群, 曹張軍, 洪楓, 蔡少博, 黃錚華 申請人:東華大學