運動發酵單胞菌red重組系統表達質粒及其構建方法與應用的製作方法
2023-05-30 06:13:46
運動發酵單胞菌red重組系統表達質粒及其構建方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一類能在運動發酵單胞菌中應用RED重組系統的質粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED及其構建方法與應用。質粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED都包含卡那黴素篩選標記基因、組成型啟動子Ppdc和RED基因。其區別在於質粒pSUZM1a-RED包含運動發酵單胞菌染色體上複製起點oriC、質粒pSUZM2a-RED包含運動發酵單胞菌內源性質粒pZZM401上的複製蛋白序列、質粒pSUZM3a-RED包含運動發酵單胞菌內源性質粒pZZM402上的複製蛋白序列。當把RED表達質粒轉入Z.?mobilis時，在敲入的篩選標記基因同源臂為60bp時，敲入基因能夠準確地替換靶基因。運動發酵單胞菌RED系統能夠對運動發酵單胞菌的基因組進行準確的編輯，具有很好的應用前景。
【專利說明】運動發酵單胞菌RED重組系統表達質粒及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及運動發酵單胞菌RED重組系統的表達質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a_RED及其構建方法與在運動發酵單胞菌中的應用，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]基因組重組系統主要有噬菌體重組系統和基因組編輯系統。噬菌體重組系統包括Red重組系統、RecET重組系統和P22重組系統。基因組編輯系統主要有鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENS)和CRISPR/Cas系統。
[0003]Red重組系統是利用λ噬菌體的Red a /Red β重組系統而建立的DNA重組技術，原理是將一段攜帶與靶基因兩側各有40~60 bp同源序列的PCR片段導入宿主菌細胞中，利用λ噬菌體Red重組酶的作用，使導入細胞的線性DNA片段與染色體(或載體)的特定靶序列進行同源重組，靶基因被敲入基因所置換。與常規的同源重組技術不同，該技術只需通過PCR在敲入基因兩側加上相對較短的與靶基因同源的序列，無須通過複雜的酶切、連接質粒等過程來建立上千bp的同源臂。Red重組系統在大腸桿菌中得到了大量的使用，除了用來敲除染色體上的基因外，還常被用來修改大腸桿菌內的載體或BAC質粒。Red重組系統來源於λ噬菌體Red區段，編碼能夠啟動細菌染色體與外源DNA發生同源重組的蛋白質。噬菌體Red區段包括3個基因:bet、eX0和gam。Exo具有DNA外切核酸酶活性，能以每秒鐘1000個鹼基的速度從雙鏈DNA末端按5' — 3'的方向降解單鏈DNA，Exo蛋白與單鏈DNA分子結合需要至少35個鹼基的區域，因此供體DNA需要35bp以上的靶位點同源臂。bet基因編碼的Beta蛋白是一個單鏈DNA (ssDNA)結合蛋白，它可以結合到由Exo產生的3』單鏈DNA末端，從而啟動互補DNA鏈的退火，引發DNA鏈的交換反應。Beta蛋白還可與Exo外切核酸酶形成複合體,調節核酸溶解和重組啟動。gam基因的表達產物Gam蛋白與宿主的RecBCD複合體結合併抑制宿主外切核酸酶活性，阻止外源線狀DNA片段被降解。當Beta蛋白與單鏈DNA 3'突出端結合形成絲狀體後，重組機制分為兩種:若參與重組的另一同源序列為沒有斷裂的雙螺旋DNA鏈，單鏈DNA在RecA蛋白的作用下侵入雙鏈DNA，完成重組過程，這一機制稱為鏈侵入模型；若另一同源序列為單鏈DNA，比如DNA複製過程中的複製叉，Beta蛋白介導互補單鏈DNA退火，完成重組過程，這一機制稱為單鏈退火模型。
[0004]目前，Red同源重組技術的研究主要在大腸桿菌進行，此外也用於其他一些細菌如痢疾桿菌、檸檬酸菌和沙門氏菌。此外相關研究說明RED重組技術在真核生物細胞中也可以實現。
[0005]外源基因在Z.mobilis中進行表達並不容易達到滿意的效果，如將黑麴黴糖化酶基因轉入Z.mobilis中，無法獲得穩定表達的重組菌株；乳糖操縱子在Z.mobilis的表達不能使其在以乳糖為唯一碳源的培養基上生長；枯草芽孢桿菌內切葡聚糖酶基因轉入Z.mobilis未檢測到生物活性；木糖代謝相關基因轉入Z.mobilis往往不能使其在木糖為唯一碳源的培養基上生長，或是可以生長但生長和產醇速率要比在葡萄糖培養基上的低4-5倍。此外，要將Z.mobilis用於大規模乙醇生產，不僅要擴大其底物利用範圍，還有必要減少其副產物的產生，如山梨醇、3-羥基丁酮、甘油、乙醛、乙酸和胞外果聚糖等。因此，為了獲得乙醇生產效率高、且能利用多種碳源的運動發酵單胞菌基因工程菌，往往需要較大規模地刪除或插入多個基因，因此構建運動發酵單胞菌RED重組系統具有重要的應用前景。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供運動發酵單胞菌中RED重組系統表達質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED 和 pSUZM3a_RED 的構建。
[0007]本發明提供的運動發酵單胞菌中RED重組系統表達質粒分別命名為pSUZMla-RED、pSUZM2a_RED、pSUZM3a_RED。
[0008]其中pSUZMla-RED包含運動發酵單胞菌染色體複製起點oriC、質粒pUC18上的複製起點、卡那黴素篩選標記基因、來自於運動發酵單胞菌的組成型基因啟動子-丙酮酸脫羧酶pdc基因的啟動子Ppdc和來自質粒pKD46的RED基因。
[0009]其中pSUZM2a_RED包含運動發酵單胞菌內源性質粒pZZM401上的複製蛋白序列、質粒PUC18上的複製起點、卡那黴素篩選標記基因、來自於組成型基因啟動子-丙酮酸脫羧酶pdc基因的啟動子Ppdc和來自質粒pKD46的RED基因。
[0010]其中pSUZM3a-RED包含運動發酵內源性質粒PZZM402上的複製蛋白序列、質粒PUC18上的複製起點、卡那黴素篩選標記基因、組成型基因啟動子-丙酮酸脫羧酶pdc基因的啟動子Ppdc和來自質粒pKD46的RED基因。
[0011]本發明所提供的pSUZMla-RED、pSUZM2a_RED、pSUZM3a_RED質粒的構建方法，包括如下步驟:
O以運動發酵單胞菌表達質粒pSUZMla、pSUZM2a、pSUZM3a為模板，用以下引物5』 -GAGCAATGGCGATGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3』 和 5』 -CAGTTTCAGTATTAATATCCATTGCTTACTCCATATAT-3，，進行 PCR 擴增，獲得骨架片段 A(pSUZMla)、B(pSUZM2a)和 C (pSUZM3a).2)以質粒 pKD46 為模板，用以下引物 5』 -ATATATGGAGTAAGCAATGGATATTAATACTGAAACTG-3』 和 5』 -CCCACTGCAAGCTACCTTCATCGCCATTGCTC-3』，進行 PCR 擴增，獲得基因片段 RED。
[0012]3)將載體骨架片段A、B、C和基因片段RED分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合，混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得重組質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a_RED、pSUZM3a_RED。
[0013]本發明的運動發酵單胞菌RED重組系統表達質粒可以用於運動發酵單胞菌基因組編輯，具有很好的應用前景。
[0014]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1表達質粒pSUZMla-RED的構建策略。
[0016]圖2表達質粒pSUZM2a_RED的構建策略。
[0017]圖3表達質粒pSUZM3a_RED的構建策略。
[0018]圖4 構建表達質粒 pSUZMla-RED 的 PCR 片段電泳；Μ, λ EcoT14 DNA marker, 1:pSUZMla載體骨架；2: RED基因。
[0019]圖 5 構建表達質粒 pSUZM2a-RED 的 PCR 片段電泳；Μ, λ EcoT14 DNA marker, 1:pSUZM2a載體骨架；2: RED基因。
[0020]圖 6 構建表達質粒 pSUZM3a-RED 的 PCR 片段電泳；Μ, λ EcoT14 DNA marker, 1:pSUZM3a載體骨架；2: RED基因。
[0021]圖7 表達質粒 pSUZMla-RED 的酶切鑑定 Μ, λ EcoT14 DNA marker, I 和 2 道:Ncol/EcoRl 雙酶切 pSUZMla-RED。
[0022]圖8 表達質粒 pSUZM2a-RED 的酶切鑑定 Μ, λ EcoT14 DNA marker, 1、2 和 3 道:Ncol/EcoRl 雙酶切 pSUZM2a-RED。
[0023]圖9 表達質粒 pSUZM3a-RED 的酶切鑑定 Μ, λ EcoT14 DNA marker, 1、2 和 3 道:EcoRl 單酶切 pSUZM3a-RED。
[0024]圖10表達質粒pSUZMla-RED的PCR鑑定M,廣譜DNA marker, I和2道:質粒pSUZMla-REDo
[0025]圖11表達質粒pSUZM2a-RED的PCR鑑定M,廣譜DNA marker, 1、2和3道:質粒pSUZM2a-RED0
[0026]圖12表達質粒pSUZM3a-RED的PCR鑑定M,廣譜DNA marker, 1、2和3道:質粒pSUZM2a-RED0
[0027]圖13RED表達質粒導入Z.mobilis ZM4的轉化子PCR檢測Μ, λ EcoT 14DNAmarker, 1: pSUZMla-RED; 2: pSUZM2a-RED; 3: pSUZM3a-RED; 4: Z mobilis ZM4空菌株陰性對照；5:質粒pKD46陽性對照。
[0028]圖14PCR擴增的bla基因和rnd基因的敲入片段M, DL500 DNA marker, 1: bla基因；2: rnd基因。
[0029]圖15運動發酵單胞菌ZM4菌株bla基因和rnd基因敲除及tet基因敲入的 PCR 鑑定 M, ， λ EcoT14 DNAmarker, 1: ZM4(bla::tet)-bla-testF/ Test-tetR;2: ZM4_bla_testF/ Test-tetR; 3: ZM4 (bla::tet)-bla-testR/ Test-tetF;4: ZM4_bla_testR/ Test-tetF; 5:ZM4(rnd::tet)-rnd-testF/ Test-tetR; 6:ZM4-rnd-testF/ Test-tetR; 7:ZM4 (rnd::tet)-rnd-testR/ Test-tetF; 8:ZM4-rnd-testR/ Test-tetF。
[0030]圖16重組菌株ZM4(bla::tet)PCR產物測序左框中為bla基因序列，右框中為tet基因序列。
[0031]圖17重組菌株ZM4(rnd::tet)PCR產物測序左框中為rnd基因序列，右框中為tet基因序列。
[0032]
【具體實施方式】
[0033]實例I 表達質粒 pSUZMla-RED、pSUZM2a_RED、pSUZM3a_RED 的構建表達質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED的構建的策略見圖1、圖2和圖3。
[0034]I)設計引物IV-Red上遊，IV-Red下遊；引物Red-1上遊，引物Red-1下遊； IV-Red 上遊:GAGCAATGGCGATGAAGGTAGCTTGCAGTGGGIV-Red 下遊:CAGTTTCAGTATTAATATCCATTGCTTACTCCATATAT
Red-1 上遊:ATATATGGAGTAAGCAATGGATATTAATACTGAAACTG
Red-1 下遊:CCCACTGCAAGCTACCTTCATCGCCATTGCTC
2)分別以pSUZMla、pSUZM2a、pSUZM3a質粒為模板，用引物IV-Red上遊和IV-Red下遊擴增載體骨架片段A、B、C ;以pKD46質粒為模板；用引物Red-1上遊和Red-1下遊擴增RED基因。
[0035]PCR反應體系:2 X PCR buffer 25yL，上遊引物1.5yL，下遊引物1.5yL，模板DNA I μ L,加水至 50 μ L。
[0036]擴增載體骨架片段A、B、C的PCR反應條件:98°C變性10 s，68°C延伸lmin30s，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0037]擴增RED基因的PCR反應條件:98°C變性10 s，68°C延伸lmin，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0038]結果顯示，載體骨架片段A的PCR產物大小為3.3kb(圖4)、載體骨架片段B的PCR產物大小為5.0kb (圖5)、載體骨架片段C的PCR產物大小為4.6kb (圖6)，與預期結果相符。RED基因的PCR產物大小為1.8 kb (圖4、圖5、圖6)，與預期結果相符。
[0039]3) PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
[0040]4)不依賴基因序列和連接反應克隆(SLIC)，具體步驟如下:
在3個(編號為1、2、3)0.5mL的EP管中，加入4 μ L 5 X T4 DNA聚合酶緩衝液(Fermentas), 0.1 μ LT4 DNA 聚合酶(5 U/ μ L Fermentas);I 號管再加入 I μ L A 片段、Iμ L RED基因片段；2號管再加入I μ L B片段、I μ L RED基因片段；3號管再加入IyLC片段、I μ L RED基因片段，3管都分別加ddH20到20 μ L。
[0041]37°C孵育6 min，然後將EP管置於70°C的水浴中孵育lOmin，終止反應。取8 μ L上述Τ4 DNA聚合酶處理的DNA到另外一個新的0.5mL EP管，加入2 μ L 10 X退火緩衝液，10 μ L ddH20。將混合物置於75°C的水浴中反應15min，然後自然冷卻至室溫。取5 μ L產物轉化大腸桿菌。挑選單克隆提取質粒，進行下述的PCR和酶切鑑定。。
[0042]實例2 表達質粒 pSUZMla-RED, pSUZM2a_RED, pSUZM3a_RED 的酶切和 PCR 鑑定 I)表達質粒 pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a_RED 的酶切鑑定
取2個新的0.2ml的EP管，分別加入2 μ L的質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED, 10*Tango buffer 2 μ L,Nco10.4 μ L,EcoRlQ.4 μ L，ddH20 5.2 μ L, 37。。反應 3_4h，電泳檢測酶切效果。
[0043]結果顯示，使用AfcoI和及^?雙酶切，酶切結果與預期大小相符，見圖7、圖8。
[0044]取I 個新的 0.2ml 的 EP 管，加入 2 μ L 的質粒 pSUZM3a_RED, 10* EcoRl bufferI μ L, Ecom.8 μ L，ddH20 6.2 μ L, 37°C反應 3_4h，電泳檢測酶切效果。
[0045]結果顯示，使用EcoRl單酶切，酶切結果與預期大小相符，見圖9。
[0046]2)表達質粒 pSUZMla-RED、pSUZM2a_RED, pSUZM3a_RED 的 PCR 鑑定
分別以質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a_RED為模板，用引物Red-1上遊和Red-1下遊擴增RED基因。
[0047]PCR 反應體系:10 X PCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2yL，上遊引物 l.0yL，下遊引物l.0yL,模板 DNA 0.5 μ L,加水至 25 μ L。
[0048]PCR反應條件:94°C預變性lmin，98°C變性10 s，65°C延伸lmin50s，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0049]結果顯示，RED基因的PCR產物大小分別為1.8 kb。其結果見圖10、圖11和圖12，
與預期結果相符。
[0050]實例3 RED系統在運動發酵單胞菌中的應用
I)質粒 pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a_RED 電轉化運動發酵單胞菌挑取Z單菌落培養於5 mL RM培養基中，得到菌液全部接種於100 mL RM
培養基中，培養至OD6tltl為0.3-0.4。於4°C 6000 rpm 10 min收集菌體，用10 mL 10%甘油清洗菌體，於4°C 6000 rpm 10 min收集菌體,重複清洗一次,將收集到的菌體懸浮於2 mL10%甘油中，製備感受態。
[0051]採用美國BTX公司的ECM830脈衝導入儀。分別將各I μ g的質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a_RED 與 200 μ L?.?0況7眾感受態混合後在 2500 V、200 Ω、50 μ F條件下電擊，電擊後把菌液迅速轉移至3mL RM培養基中靜止恢復3 h，取100 μ L菌液塗布於含卡那黴素(200 yg/mL)的平板，3 d後出現轉化子，對轉化子進行PCR鑑定。
[0052]以轉化子單菌落為模板，用引物Red-1上遊和Red-1下遊，擴增RED基因。
[0053]PCR 反應體系:10 X PCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2yL，上遊引物 l.0yL，下遊引物l.0yL,模板 DNA 0.5 μ L,加水至 25 μ L。
[0054]PCR反應條件:94°C預變性lmin，98°C變性10 s，65°C延伸lmin50s，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0055]電泳檢測結果表明，PCR擴增的Red基因片段大小為1.8kb (圖13)。
[0056]2)敲入基因片段的製備
(I)篩選標記的選擇
運動發酵單胞菌自身具有氨苄青黴素和氯黴素抗性，不具有四環素抗性，RED表達質粒具有卡那黴素抗性，因此選擇質粒PBR322的四環素標記基因作為敲入基因，易於檢測RED系統的重組。
[0057](2)含有同源臂四環素基因的獲得
運動發酵單胞菌具有β -內醯胺酶基因(bla)和mexAB型RND藥物外排泵基因(rnd)，bla基因編碼產物使運動發酵單胞菌具有氨苄青黴素抗性，rnd基因編碼產物也使運動發酵單胞菌具有一定的耐藥性，在細菌致病性方面也具有非常重要的生理作用。選定這兩個基因作為靶向基因，利用RED重組系統對這兩個基因進行敲除，構建bla突變株和rnd突變株。採用兩輪PCR的方法，第一輪擴增以質粒pBR322為模板，產生30bp左右的靶向基因同源臂的PCR產物；第二輪擴增以第一輪擴增的PCR產物為模板，使同源臂達到60bp。
[0058]設計引物1- bla上遊，1- bla下遊；引物2_ bla上遊，2_ bla下遊；1- rnd上遊，1- rnd下遊；引物2- rnd上遊，2- rnd下遊。
[0059]其中引物1- bla上遊和2- bla上遊中含下劃線部分為bla基因左端60bp同源臂，引物1- bla下遊和2- bla下遊中含下劃線部分為bla基因右端60bp同源臂。
[0060]弓丨物Ι-rnd上遊和2_rnd上遊中含下劃線部分為rnd基因左端60bp同源臂，引物
1-rnd下遊和2-rnd下遊中含下劃線部分為rnd基因右端60bp同源臂，具體序列如下:
1-bla上遊:CGCCGTGTTAAAACAGTTTATTGCAAAAACAGGCCACCTGACGTCTAAGAAAC
1-bla下遊:
GTCATAATCATTCCTTTGGCGGCGTTTTTTATGTTCTGCCAAGGGTTGG
2-bla上遊:
GACGATCATAACGGCTGTTAAAAATTTACGCCGTGTTAAAACAGTTTATTG
2-bla下遊:
TTTTTTCATAAAGAGTGCGGGGATTTTTTGTCATAATCATTCCTTTGGCG
1- rnd上遊:
GAATTTTGGGTCTTGACCTCTTTATAGGAGCGCCACCTGACGTCTAAGAAAC
1-rnd下遊:
GCTGGAACAAGGTTTCTGCTTGATTGACCGTCTGTTCTGCCAAGGGTTGG
2-rnd上遊:
TGCAGGAAAATTCTTTTCATCAAATGAAAGAATTTTGGGTCTTGACCTCTT
2- rnd下遊:
TTTGCCTGCTCCCGCAAATCTGCTTTTTGCTGGAACAAGGTTTCTGCTT
以質粒PBR322為模板，用引物1- bla上遊和1- bla下遊，擴增包含靶向基因同源臂的四環素基因片段1- bla-tet ;以質粒pBR322為模板，用引物1_ rnd上遊和1- rnd下遊擴增包含靶向基因同源臂的四環素基因片段1- rnd-tet。
[0061]PCR反應體系:2 X PCR buffer 25yL，上遊引物1.5yL，下遊引物1.5yL，模板DNA I μ L,加水至 50 μ L。
[0062]PCR反應條件:98°C變性10 s，68°C延伸50min，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0063]結果表明，PCR擴增的1- bla-tet, 1- rnd-tet片段大小為1.5kb (圖14)。
[0064]以1- bla-tet為模板，用引物2_ bla上遊和2_ bla下遊擴增包含靶向基因同源臂的四環素基因片段2-bla-tet ;以1- rnd-tet為模板,用引物2_ rnd上遊和2_ rnd下遊擴增包含靶向基因同源臂的四環素基因片段2-rnd-tet。
[0065]PCR反應體系:2 X PCR buffer 25yL，上遊引物1.5yL，下遊引物1.5yL，模板DNA I μ L,加水至 50 μ L。
[0066]PCR反應條件:98°C變性10 s，68°C延伸50s，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0067]結果表明，PCR擴增的2-bla-tet片段和2-rnd-tet片段的大小都為1.5kb (圖14)。
[0068](3)四環素基因片段的電轉化
分別取包含 pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED, pSUZM3a_RED 質粒的 Z mobilis ZM4 單菌落培養於3 mL RMG培養基中，得到菌液全部接種於100 mL RM培養基中，培養至0D_為
0.3_0.4。於4°〇6000 rpm 10 min收集菌體,用20 mL滅菌的ddH20清洗菌體,於4°C 6000rpm 10 min收集菌體,重複清洗一次,再用10 mL 10%甘油清洗菌體,於4? 6000 rpm 10min收集菌體，重複清洗一次，將收集到的菌體懸浮於I mL 10%甘油中，製備感受態。
[0069]採用美國BTX公司的ECM830脈衝導入儀。將I μ g的四環素基因片段2_bla_tet和 2-rnd-tet 分別與 200 μ L Z mobilis (pSUZMla_RED、pSUZM2a_RED，pSUZM3a_RED)感受態混合後在2500 V、200 Ω、50 μ F條件下電擊，電擊後把菌液迅速轉移至3mL RM培養基中靜止恢復3 h，將全部菌液離心收集後塗布於含四環素(50yg/mL)的平板，3 d後出現轉化子。
[0070](4)轉化子的鑑定
為驗證敲除結果，檢測在bla突變株和rnd突變株中，四環素基因攜帶的同源臂與靶向基因是否實現了同源重組。首先在四環素基因內部設計驗證引物，同時在bla和rnd基因的上下遊各200bp左右的位置設計引物，將各引物配對後對突變株進行PCR鑑定。
[0071]設計擴增四環素內部引物Tet-test上遊，Tet-test下遊；擴增bla基因引物bla-test上遊，bla-test下遊。引物bla_test上遊位於左端同源臂上遊330bp,引物bla-test下遊位於右端同源臂下遊325bp。
[0072]設計擴增rnd基因引物rnd_test上遊，rnd_test下遊,其中引物rnd_test上遊位於左端同源臂上遊249bp，引物rnd-test下遊位於右端同源臂下遊299bp，具體序列如下:
Tet-test 上遊:TATCGCCGACATCACCGATGGGGAA，
Tet-test 下遊 CGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAG，
bla-test 上遊:GGAATGCGTTCTTTCTCG，
bla-test 下遊:ACGACATGGACAATGCC ；
rnd-test 上遊:TTGACGGGAACATTTGAT，
rnd-test 下遊:TAT TCGCCGCTGTAGTGA
對bla突變株進行檢測。以單菌落為模板，引物Test-tet上遊和bla-tes下遊，進行PCR擴增片段I。結果顯示，PCR擴增的片段I大小為1.4kb (圖15)。以單菌落為模板，弓丨物bla-test上遊和Test-tet下遊，進行PCR擴增片段2。結果顯示，PCR擴增的片段2大小為 1.3kb (圖 15)。
[0073]以單菌落為模板，引物Test-tet上遊和rnd-test下遊，進行PCR擴增片段3，對nd突變株進行檢測。結果顯示，PCR擴增的片段3大小為1.3kb(圖15)。以單菌落為模板，弓丨物rnd-test上遊和Test-tet下遊，進行PCR擴增片段4。結果顯示，PCR擴增的片段4大小為 1.3kb (圖 15)。
[0074]PCR 反應體系:10 X PCR buffer 2.5 μ L, dNTP 2yL，上遊引物 l.0yL，下遊引物l.0yL,模板 DNA I μ L,加水至 25 μ L。
[0075]PCR反應條件:94°C預變性lmin，98°C變性10 s, 63°C延伸1.5min，共30個循環，72°C最後延伸5min。
[0076]為進一步驗證結果，將得到的PCR擴增得到的片段I和片段3的產物送華大基因公司進行測序，測序結果見圖16，圖17。測序結果表明，在bla突變株和rnd突變株中，帶有60bp同源臂的四環素基因片段與靶向基因在同源區實現了同源重組，使得四環素基因整合到運動發酵單胞菌的基因組上，說明RED系統能夠在運動發酵單胞菌中發揮作用。
【權利要求】
1.一類能在運動發酵單胞菌中應用的RED重組系統表達質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a_RED，包含運動發酵單胞菌內源性基因啟動子、篩選標記基因和RED重組系統基因(exo、bet、gam)。
2.根據權利I所述的質粒，其特徵在於: DpSUZMla-RED包含運動發酵單胞菌染色體上的複製起點oriC、質粒pUC18的複製起點、卡那黴素篩選標記基因、來自運動發酵單胞菌的組成型基因啟動子-丙酮酸脫羧酶Pdc基因的啟動子Ppdc、來自質粒pKD46的RED重組系統基因； 2)pSUZM2a-RED包含運動發酵單胞菌內源性質粒pZZM401的複製蛋白序列、質粒pUC18的複製起點、卡那黴素篩選標記基因、來自組成型基因啟動子-丙酮酸脫羧酶Pdc基因的啟動子Ppdc、來自質粒pKD46的RED重組系統基因； 3)pSUZM3a-RED包含運動發酵內源性質粒pZZM402的複製蛋白序列、質粒pUC18的複製起點、卡那黴素篩選標記基因、組成型基因啟動子-丙酮酸脫羧酶Pdc基因的啟動子Ppdc、來自質粒pKD46的RED重組系統基因。
3.權利2所述的載體的構建方法，包括如下步驟: O分別以運動發酵單胞菌表達質粒PSUZMla (含有運動發酵單胞菌染色體複製起點oriC、質粒pUC18上的複製起點、以及來自於運動發酵單胞菌的組成型基因啟動子Ppdc)、pSUZM2a (含有運動發酵單胞菌內源性質粒PZZM401的複製起點和DNA複製酶基因序列、質粒pUC18的複製起點、以及來自於運動發酵單胞菌的組成型基因啟動子Ppdc)、pSUZM3a (含有運動發酵單胞菌內源性質粒PZZM402的複製起點和DNA複製酶基因序列、質粒pUC18的複製起點、以及來自於運動發酵單胞菌的組成型基因啟動子Ppdc)為模板，用以下引物5』-GAGCAATGGCGATGAAGGTAGCTTGCAGTGGG-3 』和 5 』 -CAGTTTCAGTATTAATATCCATTGCTTACTCCATATAT-3』，進行 PCR 擴增，獲得載體骨架片段 A(pSUZMla)、B(pSUZM2a)和 C (pSUZM3a)； 2)以 pKD46 質粒為模板，用以下引物 5』 - ATATATGGAGTAAGCAATGGATATTAATACTGAAACTG-3』 和 5』 - CCCACTGCAAGCTACCTTCATCGCCATTGCTC -3』 進行 PCR 擴增，獲得基因片段 RED ； (3)將載體骨架片段A、B和C與基因片段RED分別經電泳凝膠回收後等摩爾混合，混合片段用T4 DNA聚合酶進行處理，然後進行退火反應重組，轉化大腸桿菌，獲得重組質粒pSUZMla-RED、pSUZM2a_RED 和 pSUZM3a_RED。
【文檔編號】C12N15/74GK104131023SQ201410320681
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月8日 優先權日:2014年7月8日
【發明者】譚雪梅, 曹慶華, 張義正, 王海燕, 馮紅 申請人:四川大學