α(1，3)半乳糖轉移酶重組載體及其製備和應用的製作方法

2023-05-30 02:13:26

專利名稱：α(1，3)半乳糖轉移酶重組載體及其製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種α(1，3)半乳糖轉移酶表達載體，特徵是能夠高效感染人的各種腫瘤細胞，使之表達α(1，3)半乳糖轉移酶，引起腫瘤細胞表面表達α-Gal半乳糖表位，同時增加腫瘤特異性抗原表位的暴露，引起免疫排斥反應，預防或/和治療腫瘤等新生物。製備方法主要應用基因克隆，表達，純化，重組等基因工程和細胞工程技術。這種載體可以用於人類多種疾病的基因治療以及免疫治療，能有效治療或/和預防人類多種腫瘤等新生物。
背景技術：
隨著分子生物學技術的進步，特別是基因工程和細胞工程技術的發展，腫瘤等新生物的基因治療成為人們研究的熱點。目前，全球共有600多項基因治療方案獲準進入臨床實驗，有些治療方案已獲得一定療效，初步顯示了基因治療的前景。作為可用於基因治療的各種載體，本身不具有任何治療疾病的意義，無臨床應用價值；而作為可用於各種治療的目的基因，由於直接導入靶細胞及其在靶細胞內直接表達的有一定難度，只具有潛在的治療作用，沒有實際的臨床價值。只有將具有潛在治療作用的基因與可轉移基因的載體結合，通過後者介導，將目的基因導入靶細胞並表達，才能達到真正的臨床治療效果。因此，構建治療基因與基因載體的融合序列是實現基因治療的關鍵。將目的基因的表達盒與載體進行融合常用的方法是在真核細胞中進行同源重組，過程複雜，費時費力，而使用在原核細胞(大腸桿菌)中實現同源重組、構建融合表達載體的基因工程技術則可有效解決上述問題。
缺乏特異性，靶向性及高效性的基因轉移載體一直是腫瘤基因治療的一個難題，目前，用於基因治療的載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。常用的病毒載體有腺病毒載體，腺相關病毒載體和逆轉錄病毒載體等。腺病毒載體是常用的基因載體，它的優點在於轉染效率高、可操作性好、能攜帶較大的目的基因片斷、可製備高效價的病毒顆粒，易於工業化生產，即能感染分裂期細胞，也能感染非分裂期細胞，具有安全、致病性低等優點。也有不足之處，一是感染缺乏特異性，二是具有免疫原性。因此，對腺病毒載體進行存利去弊的改進是發展基因治療的必由之路。研究表明，腺病毒載體E1或E3缺失區攜帶外源性基因整合進靶細胞基因組中實現目的基因的較長時間的表達，且可降低其免疫源性，逆轉錄病毒載體能攜帶外源基因整合進靶細胞基因組中實現目的基因穩定持久的表達，但逆轉錄病毒體外繁殖滴度低、轉染效率低，只感染分裂期細胞，在染色體裡是隨機整合；其他可用於基因轉移的病毒載體和非病毒載體均存在不同的利弊。
大量證據提示人體內存在預先形成的抗體，即天然抗體(NAb)，是種間移植存在超急排斥現象(HAR)的基礎。HAR中的人的天然抗體可以廣泛識別豬抗原，但實際上，90％以上人血清內的補體依賴性排異反應天然抗體只識別異種(豬)抗原的一個結構，即α(1，3)半乳糖基(gal)，它是異種(豬)抗原的抗原表位(決定簇)，這些抗原都特異性地攜帶一個α(1，3)半乳糖基抗原表位。α(1，3)半乳糖基的形成，主要由α(1，3)半乳糖轉移酶催化，這種酶在低等動物和新世界猴體內表達，人、猿、及舊世界猴體內都缺乏這種酶。由於人體不表達α(1，3)半乳糖轉移酶，也不攜帶α(1，3)半乳糖的抗原表位(決定簇)，因此頻繁地與該抗原接觸使得體內的天然抗體有很高的效價。人細胞，特別是腫瘤細胞，引入異種(豬)的α(1，3)半乳糖轉移酶基因，使之表達α(1，3)半乳糖轉移酶，引起腫瘤細胞表面大量表達半乳糖表位，半乳糖表位引發了人體內的天然抗體對腫瘤細胞產生補體介導的細胞毒作用，進而腫瘤特異性抗原的暴露引發特異性免疫反應，達到治療或/和預防腫瘤的目的。這種方法充分利用體內存在的天然抗體，是一種簡便，經濟的基因治療或/和免疫治療方案。

發明內容
本發明旨在將具有潛在治療作用的基因與可轉移基因的載體進行有機結合，而提供一種病毒載體與α(1，3)半乳糖轉移酶基因的重組載體，能夠在基因工程改造過的特定細胞中繁殖、生產，並可在真核細胞中表達，使腫瘤細胞膜表面產生較多α(1，3)半乳糖基表位，用於人類多種疾病的基因治療以及免疫治療。結果令人鼓舞，細胞感染α(1，3)半乳糖轉移酶基因的重組病毒體後，細胞表面產生較多半乳糖表位，引發了人體內的天然抗體對腫瘤細胞產生補體介導的細胞毒作用以及腫瘤特異性抗原的暴露引發的特異性免疫反應，達到了治療或/和預防腫瘤的目的。本發明的目的還在於提供重組載體的製備方法及其用於製備治療或/和預防腫瘤藥物的方法。
為實現上述目的，本發明提供一種病毒載體與α(1，3)半乳糖轉移酶基因的重組載體，該重組載體是將由DNA克隆技術構建的病毒載體與α(1，3)半乳糖轉移酶基因表達盒相結合，構建成一個能在基因工程改造過的特定細胞中擴增、繁殖，也能在真核細胞中表達α(1，3)半乳糖轉移酶的融合序列。
該重組載體的載體可以為質粒載體，DNA病毒或RNA病毒載體的任何一種，其優選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的複合載體；最優選載體為腺病毒載體。
所述α(1，3)半乳糖轉移酶基因可以是α(1，3)半乳糖轉移酶基因的任一種，最優選的基因為豬α(1，3)半乳糖轉移酶基因。
本項發明提供了這種重組載體的製備和應用方法一、重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因重組載體和/或重組腺病毒顆粒的製備方法 提供了一種用分子生物學中基因克隆，表達，純化，重組等基因工程和細胞工程技術製備重組載體的方法。該重組載體的載體可以為DNA病毒或RNA病毒的任一種，其優選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的複合載體；最優選載體為腺病毒載體。這種方法在載體中引入α(1，3)半乳糖轉移酶基因，組成轉染效率高、可操作性強的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因重組腺病毒載體和/或重組腺病毒顆粒。
二、重組載體或病毒體的應用方法 此項發明提供了應用上述重組病毒體進行腫瘤等新生物治療或/和預防的方法。本發明的重組載體或病毒體可用於製備成合適的劑型，如液體劑型、半固體劑型、固體型或氣體劑型。本發明的重組載體中治療基因的啟動子可以替換為人體器官特異性啟動子，達到靶向性治療的目的。本發明的重組載體可用於對腫瘤細胞進行免疫修飾，製成腫瘤疫苗預防腫瘤。
下面結合具體實施方式
對本發明做進一步說明，凡依照本發明公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。
具體實施例方式
實施例1例如，豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體(顆粒)這樣準備(a)在腺病毒載體(如pShuttle)序列中，定點引入豬的α(1，3)半乳糖轉移酶的cDNA，組成α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒穿梭載體；(b)將(a)中α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒穿梭載體轉入原核細胞(如BJ5183-AD-1)中篩選，挑取陽性克隆，酶切以及測序確定正確陽性克隆，並進行擴增獲取重組載體DNA；(c)將(b)中擴增的重組載體DNA轉入包裝細胞(如Ad-293)，產出適量豬的α(1，3)半乳糖轉移酶基因的腺病毒體(複製缺陷的病毒顆粒)；(d)將上述病毒顆粒純化製備成製劑，如液體劑型、半固體劑型、固體型或氣體劑型。
實施例2例如，豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體治療尖銳溼疣這樣實施(a)豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體製備成質量符合臨床試驗標準的半固體製劑；然後(b)尖銳溼疣表面塗敷(a)中半固體製劑，引起尖銳溼疣細胞表面大量表達α(1，3)半乳糖基表位，激發免疫排斥反應，達到清除和/或預防尖銳溼疣的目的。
實施例3例如，豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體瘤內注射這樣實施(a)豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體製備成質量符合臨床試驗標準的注射液；然後(b)體表腫瘤瘤體內直接注射(a)中注射液，體內腫瘤用介入方法西向腫瘤瘤體內注射(a)中注射液，引起腫瘤細胞表面大量表達α(1，3)半乳糖基表位，激發免疫排斥反應，達到清除和/或預防腫瘤的目的。
實施例4豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體前列腺靶向性改造這樣實施(a)克隆純化人的前列腺特異性抗原基因的啟動子，調控試驗證實有效；然後(b)正確定向克隆入豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒重組載體，替代原有啟動子，完成豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體前列腺靶向性改造。
實施例5豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體修飾腫瘤細胞疫苗這樣製備(a)培養擴增腫瘤細胞，用豬的重組α(1，3)半乳糖轉移酶基因腺病毒體轉染修飾；(b)篩選轉染腫瘤細胞陽性克隆或不篩選；(c)物理或化學方法進有效周期抑制；(d)製成腫瘤細胞疫苗製劑應用。
權利要求
1.一種重組載體，是載體基因和α(1，3)半乳糖轉移酶表達編碼區的重組體，通過基因工程和細胞工程方法製備，能夠在靶細胞或宿主細胞中表達α(1，3)半乳糖轉移酶，用於非特異性或器官特異性啟動子等指導的靶向性治療以及用於對腫瘤細胞進行免疫修飾，製成腫瘤疫苗預防腫瘤。
2.權利要求1所述的載體，其特徵是該重組體的載體可以為質粒載體，DNA病毒或RNA病毒載體的任何一種，其優選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的複合載體；最優選載體為腺病毒載體。
3.權利要求2所述的載體，其特徵是包含α(1，3)半乳糖轉移酶基因表達框，巨細胞病毒IE啟動子和SV40早期多聚腺苷酸信號，α(1，3)半乳糖轉移酶基因表達由巨細胞病毒IE等非特異性啟動子控制或前列腺特異抗原的啟動子等器官特異性啟動子控制。
4.權利要求2所述的載體，其特徵是腺病毒複製的必須基因缺失，引入α(1，3)半乳糖轉移酶基因表達框，所述α(1，3)半乳糖轉移酶基因可以是α(1，3)半乳糖轉移酶基因的任何一種，最優選的基因為豬α(1，3)半乳糖轉移酶基因。
5.權利要求2所述的載體，其特徵是腺病毒載體的E1A和E1B區缺失，引入α(1，3)半乳糖轉移酶基因表達框。
6.權利要求1所述的載體，其特徵是應用時採用任何合適的可接受的藥學劑型或/和給藥方式。
7.挽救野生型α(1，3)半乳糖轉移酶功能缺失的細胞的方法是一定量的權利要求1所述的重組載體通過接觸並進入野生型α(1，3)半乳糖轉移酶基因缺失的細胞，在細胞中有效表達野生型α(1，3)半乳糖轉移酶蛋白來挽救細胞。
8.權利要求7所述的方法，其特徵是α(1，3)半乳糖轉移酶功能缺失的細胞是α(1，3)半乳糖轉移酶基因缺失的細胞，α(1，3)半乳糖轉移酶功能缺失的細胞是人或哺乳動物細胞。
9.一種生產重組腺病毒的方法，包括(a)將含有表達α(1，3)半乳糖轉移酶元件的腺病毒質粒載體用脂質體介導的轉染方法導入合適的宿主細胞；並且(b)分析培養的宿主細胞出現的細胞病變效應，監測同源重組的病毒產量。
10.權利要求9所述的方法，其特徵是這種腺病毒質粒具有複製缺限，而宿主細胞能夠彌補這種缺陷；這種腺病毒質粒缺失功能性E1A和E1B基因，而宿主細胞是功能性能E1基因表達細胞；這種宿主細胞是293細胞，這種宿主細胞的培養基是MEM培養基。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種α(1，3)半乳糖轉移酶表達載體，特徵是能夠高效感染人的各種腫瘤細胞，使之表達α(1，3)半乳糖轉移酶，引起腫瘤細胞表面表達α－Gal半乳糖表位，同時增加腫瘤特異性抗原表位的暴露，引起免疫排斥反應，預防或/和治療腫瘤等新生物。製備方法主要應用基因克隆，表達，純化，重組等基因工程和細胞工程技術。這種載體可以用於人類多種疾病的基因治療以及免疫治療，能有效治療或/和預防人類多種腫瘤等新生物。
文檔編號C12N15/63GK1704477SQ200410042649
公開日2005年12月7日 申請日期2004年5月31日 優先權日2004年5月31日
發明者楊捷 申請人:楊捷