一種miRNA‑122檢測試劑盒及應用的製作方法

2023-05-29 21:30:46 2

本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種miRNA-122檢測試劑盒及應用。
背景技術：
：microRNAs是在多種真核細胞及病毒中發現的一類來源內源性染色體上的非編碼單鏈小分子RNA，其長度為21～25nt，在進化上具有高度的保守性，能夠通過與其目標mRNA分子的3』端非編碼區域(3』untranslatedregion，3』UTR)互補導致該mRNA分子的翻譯受到抑制。miRNA參與調控真核生物超過1/3以上基因的表達、抑制靶基因的翻譯、引起mRNA的降解等，具有非常重要的生物學功能。進一步研究表明，miRNAs在細胞增殖、分化和凋亡、神經元的極性、胰島素分泌、大腦形態形成、心臟形成、胚胎發育，生物個體死亡等過程中發揮著關鍵性的作用，這些最新的研究發現為我們提供了全新的疾病發生、發展調控網絡，拓展了我們對疾病發生機制的理解和認識。miRNAs可存在於人體的多種體液中，具有嚴格的時空性和組織特異性。循環miRNAs是正常細胞或腫瘤細胞釋放到血清/血漿的miRNAs，與目前臨床常用的蛋白質類、激素類標誌物相比，可更早預測和發現疾病發生發展狀態。循壞miRNAs是基因表達水平的新型疾病相關特異性生物標誌物，在臨床實驗診斷領域具有巨大的潛能和優勢，無疑將極大地提高重大疾病的診斷和治療水平。快速、準確、靈敏的miRNAs檢測技術是確保循壞miRNAs生物標誌物成功應用於臨床的關鍵環節。目前，檢測miRNAs的方法主要有Northern印跡分析、基因晶片和實時定量PCR等，但是，由於上述方法都需要預先對樣本進行反轉錄和PCR擴增，才能完成檢測，這樣既大為增加了檢測複雜性和檢測時間，又一定程度上幹擾了miRNAs的定量檢測，同時預擴增存在的實驗室汙染問題也極大地影響了這些檢測方法的準確性，使得這些方法的臨床實際應用受到了極大的限制。肝損傷是所有肝臟疾病共有的病理狀態，存在於肝病的整個發生和進展期，嚴重危害人類健康。臨床常常通過肝功能生化指標檢查，例如檢測血液中的谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶和膽紅素等了解肝臟是否發生病變，以及肝臟的受損程度等信息。但由於這些常規肝功指標的特異性不高，容易受其它因素例如骨骼肌損傷、肌炎和劇烈運動等等的影響，目前亟需一種更加特異和靈敏反應肝損傷的檢測標誌物。MicroRNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一種長約19-23個核苷酸的非編碼小RNA分子，其對細胞發育、分化、增殖和凋亡至關重要，調控並影響了整個生命活動的過程。目前大量研究已證實，miRNA-122幾乎只表達於人體肝臟中，並且表達豐度很高。由於肝損傷過程中會發生肝細胞的凋亡或裂解，細胞內的miRNA-122便會釋放到人體外周血中，並且miRNA分子在血液中較為穩定，相對不易降解，因此通過檢測血液中的miRNA-122分子含量，可有效評估肝損傷的程度。技術實現要素：本發明的目的在於克服現有技術的缺點，提供一種miRNA-122檢測試劑盒及應用。本發明的目的通過以下技術方案來實現：一種miRNA-122檢測試劑盒，它包括反轉錄引物、檢測引物、質控品和標準品，其中，所述反轉錄引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具體為：5』-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACC-3』；所述檢測引物的上遊引物序列如SEQIDNO.2所示，具體為：5』-GAGGCTGGAGTGTGACAATGG-3』，檢測引物的下遊引物序列如SEQIDNO.3所示，具體為：5』-TATCCTACGCAGGGTCCGAG-3』；所述質控品包括陰性質控品和陽性質控品，陰性質控品為合成的線蟲來源的cel-miRNA-39，陽性質控品為合成的人源的miRNA-122；所述標準品的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具體為：5』-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACCATTGTCACACTCCA-3』。進一步地，所述陰性質控品的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具體為：5』-ucaccggguguaaaucagcuug-3』。進一步地，所述陽性質控品的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具體為：5』-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3』。進一步地，所述檢測試劑盒由反轉錄緩衝液、反轉錄酶、PCR緩衝液、超純水、質控品和標準品組成；其中，所述反轉錄緩衝液由dNTPs、RTBuffer、RNaseinhibitor、反轉錄引物和超純水組成；所述PCR緩衝液由PCRBuffer、檢測引物和超純水組成；所述標準品包括5個不同濃度的標準品S1、標準品S2、標準品S3、標準品S4和標準品S5，其濃度分別為106copies/ul、105copies/ul、104copies/ul、103copies/ul和102copies/ul。上述的試劑盒用於檢測miRNA-122。進一步地，所述的試劑盒用於檢測肝損傷中的miRNA-122。上述試劑盒基於螢光定量PCR平臺，檢測樣本類型包括血漿或血清。本發明試劑盒中標準品的使用方法為：本試劑盒中提供的標準品S1、S2、S3、S4和S5線性範圍為102～106copies/ul，用於螢光定量PCR標準曲線的製作，標準曲線可用於精確計算待測樣本中miRNA-122的濃度(copies/ul)。注意將原樣本反應體系中的反轉錄樣品3ul替換為本標準品3ul，反應條件與原樣本一致。檢測結果計算：通過標準曲線讀取待測樣本的miRNA-122濃度後，根據提取的樣本體積，總RNA總RNA(包含總microRNA)的溶解體積，反轉錄上樣體積和螢光定量上樣體積計算出原血漿或血清樣本中的miRNA-122濃度。例如：提取體積為Aul的血漿樣本，得到體積為Bul的總RNA，取其中2ul用於反轉錄，螢光定量PCR上樣3ul進行檢測，讀取的miRNA-122濃度為Ccopies/ul，則受試者血漿中miRNA-122的濃度(Xcopies/ul)按以下公式進行計算：X(copies/ul)＝C×20×15/3×B/2×1/A＝50BC/A上述陽性質控品和陰性質控品的使用方法為：在提取待測血漿或血清樣本總RNA(包括總microRNA)的同時，也用相同的試劑盒和方法提取陽性質控品和陰性質控品。1.陽性質控品檢測結果應滿足：105～2×105copies/ul，否則實驗無效。2.陰性質控品檢測結果應為0copies/ul，否則實驗無效。本發明試劑盒檢測結果的解釋方法為：1.miRNA-122濃度的檢測結果小於或等於3×104copies/ul時，可直接報告結果為陰性。2.miRNA-122濃度的檢測結果在3×104～6×104copies/ul範圍內時，可直接報告結果為陽性，並建議對此份標本謹慎跟蹤。3.miRNA-122濃度的檢測結果大於等於6×104copies/ul時，可直接報告結果為陽性。4.陰性結果表示肝臟正常無損傷，陽性結果表示存在肝損傷。本發明具有以下優點：1.本發明試劑盒提供的反轉錄緩衝液和PCR緩衝液不但在組分上進行了優化有利於長期穩定保存，同時可將加樣工作量簡化至最小，以減少加樣時可能出現的失誤或誤差，有利於得到穩定可靠的檢測結果；2.本發明試劑盒提供了一種新的檢測肝損傷的方法，選擇的檢測靶點miRNA-122僅表達於肝臟，因此特異性優於現有技術；3.本發明試劑盒選擇用患者血清、血漿或全血為樣本，保存方便，並且由於血細胞中不含miRNA-122，由採樣或保存手法所導致的樣本溶血或白細胞破裂等不會影響檢測的結果，因此檢測不但非侵入性，減少病人痛苦，且準確性不低於現有技術；4.本發明試劑盒基於螢光定量PCR平臺，因此檢驗靈敏度高。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護範圍不局限於以下所述。實施例1：miRNA-122檢測試劑盒所述檢測試劑盒由9ul反轉錄緩衝液、1ul反轉錄酶、17ul的PCR緩衝液、20ul超純水、200ul陽性質控品、200ul陰性質控品和標準品組成；其中，所述反轉錄緩衝液由100mMdNTPs(withdTTP)0.15ul、10×RTBuffer1.5ul、10mg/mlRNaseinhibitor0.2ul、10uM反轉錄引物1ul和超純水組成6.15ul；所述反轉錄引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具體為：5』-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACC-3』；所述反轉錄酶為分裝自ABI公司的MultiScribeTMReverseTranscriptase，50U/μL。所述PCR緩衝液由2×PCRBuffer10ul(分裝自Roche公司的FastStartEssentialDNAGreenMaster)、10uM檢測上引物0.5ul、10uM檢測下引物0.5ul和超純水6ul組成；所述檢測引物的上遊引物序列如SEQIDNO.2所示，具體為：5』-GAGGCTGGAGTGTGACAATGG-3』，檢測引物的下遊引物序列如SEQIDNO.3所示，具體為：5』-TATCCTACGCAGGGTCCGAG-3』；所述標準品包括5個不同濃度的標準品S13ul、標準品S23ul、標準品S33ul、標準品S43ul和標準品S53ul，其濃度分別為106copies/ul、105copies/ul、104copies/ul、103copies/ul和102copies/ul。所述質控品包括陰性質控品和陽性質控品，陰性質控品為合成的線蟲來源的cel-miRNA-39，陽性質控品為合成的人源的miRNA-122；所述標準品的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具體為：5』-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACCATTGTCACACTCCA-3』。所述陰性質控品的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具體為：5』-ucaccggguguaaaucagcuug-3』。所述陽性質控品的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具體為：5』-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3』。實施例2：檢測肝移植術後病人血漿中的miRNA-122的表達水平1、樣本採集及處理使用普通EDTA採血管採集健康人和肝移植受者血液5ml，分別共10份。將血液轉移至新的15ml離心管中，4℃2000g離心10min，吸取上層血漿至一新的15ml離心管中。再將血漿4℃4000g離心20min，吸取上層血漿至一新的15ml離心管中。吸取200ul並使用QIAGEN的miRNeasySerum/PlasmaKit按照操作說明書進行總RNA(包括總microRNA)的提取，同時也進行等體積陽性質控品和陰性質控品總RNA的提取，得到最終待測總RNA體積為40ul。2、實驗檢測將待測樣本、陽性質控品和陰性質控品提取後的總RNA(包括總microRNA)按下述反應體系和反應條件進行反轉錄後，miRNA-122反轉錄反應體系如表1所示，miRNA-122反轉錄反應條件如表2所示，將反轉錄後的待測樣本、陽性質控品、陰性質控品和標準品S1-S4的反應體系按照上述說明在96孔板中進行配置混勻，板式離心機短暫離心5s後，置於Bio-radCFXconnect螢光定量PCR儀中進行反應，反應條件按照下述說明進行，miRNA-122螢光定量PCR檢測反應體系如表3所示，miRNA-122螢光定量PCR檢測反應條件如表4所示，在每個循環第二步即，60℃1min收集螢光信號。每管反應做5個副孔。表1：miRNA-122反轉錄反應體系成分體積反轉錄緩衝液9ul反轉錄酶1ulRNA樣品(5～50ng)2ul超純水3ul共計15ul表2：miRNA-122反轉錄反應條件表3：miRNA-122螢光定量PCR檢測反應體系成分體積PCR緩衝液17ul反轉錄樣品3ul共計20ul表4：miRNA-122螢光定量PCR檢測反應條件3、實驗結果檢測結果經副孔計算取平均值後，見表5(結果取小數點後1位)表5.螢光定量PCR儀檢測miRNA-122結果樣本類型檢測結果(copies/ul)健康人1852.4肝移植受者11231.6陽性質控品16224.2陰性質控品0經計算，陽性質控品的濃度為(16224.2×50×40)/200＝1.62242×105copies/ul，陰性質控品的濃度為0copies/ul，符合試劑盒說明，因此本次實驗結果有效。經計算，健康人的miRNA-122濃度為(1852.4×50×40)/200＝1.8524×104copies/ul，小於3×104copies/ul，因此排定為陰性。肝移植受者的miRNA-122濃度為(11231.6×50×40)/200＝1.12316×105copies/ul，大於6×104copies/ul，因此判定為陽性。SEQUENCELISTING成都仕康美生物科技有限公司一種miRNA-122檢測試劑盒及應用20166PatentInversion3.5152DNA人工序列1cgactatcctacgcagggtccgaggtattcgcgtaggatagtcgcaaacacc52221DNA人工序列2gaggctggagtgtgacaatgg21320DNA人工合成3tatcctacgcagggtccgag20466DNA人工序列4cgactatcctacgcagggtccgaggtattcgcgtaggatagtcgcaaacaccattgtcac60actcca66522RNA人工合成5ucaccggguguaaaucagcuug22622RNA人工合成6uggagugugacaaugguguuug22當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp