一種枯草芽孢桿菌及應用的製作方法
2023-05-29 19:44:46
專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌及其在石油餾分油深度脫硫中應用。
背景技術：
化石燃料中所含的硫化物燃燒時排放出大量的二氧化硫等毒性氣體，由此轉化成的大面積酸雨嚴重汙染大氣和水源，破壞生態平衡，危害人類生存。化石燃料中的有機硫化合物成分複雜，大部分是雜環化合物，其中的C-S化學共價鍵十分牢固，用常規的物理和化學方法難以有效地除去雜環中的有機硫，成本也較高。
近年來，國際上迅速發展的生物脫硫(Biodesulfurization，簡稱BDS)技術將成為降低石油產品硫含量的有效途徑。BDS可廣泛用於處理汽油、餾分油、催化裂解原料油和渣油。BDS可以與已有的化學法加氫脫硫技術(Hydrodesulfurization，簡稱HDS)裝置有機結合，最大限度地減少氫氣的生產費用，並改善HDS裝置的操作。另外，由於BDS過程中的副產物有機硫產品的價值較高，預計BDS比HDS在經濟上有更強的競爭力。BDS在常溫常壓下操作，能耗比HDS低70-80％，採用BDS技術的投資額約為HDS的50％，操作費用比HDS低10-25％。
由於二苯並噻吩(Dibenzothiophene，簡稱DBT)是化石燃料中含量高、難降解的有機硫化物的典型代表，所以一直被作為模式化合物來研究。人們對微生物降解DBT的途徑提出各種解釋，可以概括為兩種路線。一種是由Kodama等提出的C-C鍵斷裂氧化途徑[Kodama K K，et al.，Agric.Biol.Chem.，1973，3745]，也稱破壞性路線，即DBT的C-C鍵斷裂後形成水溶性含硫化合物從油中脫出。這樣脫去的不僅是硫本身，而是整個含硫雜環，這就會降低液體收率，同時也會降低有價值烴的燃燒值；另一種是C-S鍵斷裂氧化的非破壞性路線，即DBT依次被氧化為亞碸(Sulfoxide)、碸(Sulfone)、亞磺酸鹽(Sulfinate)和硫酸鹽(Sulphate)，因此稱為「4S」代謝途徑[Kilbane JJ，Trends Biotechnol，1989，797]。由於後來該途徑在R.rhodochrous IGTS8菌株進一步證實，所以又稱IGTS8途徑[Denome S A，et al.，Appl.Environ.Microbiol.，1993，59(9)2837]。其特點是DBT中的硫被氧化為硫酸鹽轉入到水相，而其骨架結構則氧化成羥基聯苯留在油相，沒有碳的損失。因此，C-S鍵斷裂氧化途徑更具有應用價值。1999年，L.Setti等對R.rhodochrous IGTS8降解DBT的「4S」途徑途徑作了進一步分析[L Setti，et al，Appl Mierobiol Biotechnol，1999，52111～117]指出IGTS8菌株的「4S」途徑有兩條不同路線第一條路線DBT被轉化成DBT亞碸和DBT碸。碸在亞硫酸水解酶的作用下轉變為2-(2』-羥基苯)苯亞磺酸[2-(2』-hydroxyphenyl)benzene sulfinate]，進一步形成2-羥基聯苯(2-HBP)和亞硫酸。第二條路線中碸進一步氧化成2-(2』-羥基苯)苯磺酸[2-(2』-hydroxyphenyl)benzene sulfone]，後者在磺酸水解酶的作用下轉變為2，2-二羥基聯苯(DHBP)和硫酸。
美國天然氣研究所(簡稱IGT)分離的紅平紅球菌Rhodococcusrhodochrous IGTS8(J.J.Kilbane B.A.Bielaga.Chemtech，1990)，可有效地脫除二苯噻吩結構中的有機硫，且不損失該有機物的熱值，是一株有商業價值的菌株。日本也分離到幾株紅平紅球菌(Izumi Y，et al.Appl.Environ.Microbiol，1994)。南韓國立重點科技研究所1998年分離到一株與紅平紅球菌很類似的諾卡氏菌Norcardia sp.，可用於油品脫有機硫，很有應用前景(J.H.Chang et al.Biotechnol，1998)。紅平紅球菌專一性的脫硫途徑已從酶學和分子遺傳學上所證實(Piddington C S et al.Appl.Environ.Microbiol，1995；Gray K A，et al Nature Biotechnol，1996)。
儘管人們分離到各種脫硫微生物，但它們的脫硫能力有限，還要經過誘變篩選或進行分子水平改良，或提供新類型的脫硫微生物。
發明內容
本發明提供一種新型脫硫微生物，能夠專一氧化斷裂C-S鍵，提高脫硫能力，用於石油餾分中有機硫的脫除過程。
本發明新型脫硫微生物菌株及變異體為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis Fds-1，CGMCC No.0644。(下面簡稱B.Subtilis Fds-1)該B.SubtilisFds-1菌株的形態特徵為革蘭氏陽性，杆狀；有亞端生芽孢，芽孢圓形，孢束膨大，細胞直徑小於1μm。
該B.Subtilis Fds-1菌株的生理生化特徵見表1。
表1 B.Subtilis Fds-1菌株的生理生化特徵
本發明的脫硫菌株與其它生物脫硫的專利菌種不同，與紅球菌Rhodococcus rhodochrous ATCC 53968、諾卡氏菌Nocardia sp、節桿菌Arthrobacter sp等相比，親緣關係較遠，不是同一屬的微生物；與專利US4,632,906中提出的Bacillus Sulfacportare ATCC 39909菌株相比，雖然是同屬，但不是同種。而且本發明的B.Subtilis Fds-1菌株是經過紫外線處理的突變菌株，它與普通的枯草芽孢桿菌的區別是可以耐受較高的溫度。
本發明的菌株可以用於石油或石油餾分的脫硫過程，如汽油、煤油、柴油、減壓餾分油、渣油、各種原油等的脫硫過程。脫硫過程可以採用生長細胞和休止細胞兩種方法脫硫，具體過程與其它菌株脫硫方法相同。
本發明提供的菌株是一種新型枯草芽孢桿菌，具有專一氧化斷裂有機硫化物中的C-S鍵。因此，B.Subtilis Fds-1菌株可作為生物催化劑，專一性斷裂含硫有機化合物中的C-S鍵，脫除硫原子，特別適合於石油餾分油的深度脫硫。該菌株通過4S途徑脫除石油或石油餾分油中的有機硫，而不破壞其C-C骨架，因而不向其它微生物脫硫那樣降低烴的燃燒值。並且脫硫功能強，具有工業應用價值。
本發明提供的B.SubtilisFds-1菌株，己於2001年10月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CBMCC No.0644。
具體實施例方式
下面具體說明本發明微生物菌株的誘變篩選過程，以及應用效果。
本發明的B.subtilisFds-1菌株是從高硫油井附近的土壤中分離並經過紫外線誘變篩選得到的。篩選方法如下在中國勝利石油管理局孤島油田的高硫油井附近，選幾十個代表地點。先除去表層土，再從10-20cm深處取土樣30-50g，裝入無菌紙袋。將1g土樣加入100ml基礎鹽培養基中(成分，重量百分比KH2PO4，0.4％；Na2HPO4，0.4％；NH4Cl，0.2％；MgCl2·6H2O，0.02％；CaCl2·2H2O，0.0001％；FeCl3·6H2O，0.0001％；無硫碳源，0.1～0.3％)。30℃培養2～3天，靜置後取上層液體1ml，加入富集培養基中(其成分為上述基礎鹽培養基中加0.01％～0.05％DBT)。
在富集培養基中30℃培養2～3天後在含有DBT的瓊脂平板上劃線分離單菌落。得到的單菌落做進一步的代謝途徑分析，鑑別是否以4S途徑降解DBT。其鑑別方法如下將在富集培養基培養2～3天的菌液離心除菌體，取上清液並將其pH調至8.0，加少量Gibb’s試劑，呈現藍色是二羥基聯苯的專一反應，說明培養液中有DBT的降解產物存在。
對篩選到的脫硫菌株進行了紫外線誘變處理，方法如下將篩選到的枯草芽孢桿菌接入基礎鹽加DBT的富集培養基中，28-30℃振蕩培養2天。取上述培養液離心，收集細胞，再用生理鹽水洗滌後製成菌懸液。分裝10mL菌懸液在培養皿中，置30w紫外燈下，距20cm照射1～6min，每隔30秒取樣。不同紫外線(U.V)處理時間的菌液梯度稀釋後塗布在培養皿上，與沒經照射的對照細胞塗布培養皿一起培養2天。通過這些培養皿上生長的菌落數可以計算不同照射時間的致死率。選致死率在70％左右的存活細胞進行單菌落擴大培養後，接入搖瓶作脫硫能力對比。從對比實驗中選出脫硫能力強的突變株即為本發明的脫硫菌株B.Subtilis Fds-1。
本發明菌株用於石油餾分脫硫可以採用如下過程。用生長細胞脫硫過程為菌種培養→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。用休止細胞脫硫過程為菌種培養→收集細胞→懸浮於磷酸鹽緩衝液中→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。具體過程如下。
本發明採用生長細胞和休止細胞兩種工藝對模型化合物(如DBT)或柴油脫硫。生長細胞脫硫利用加入適量有機硫(如DBT)的基礎鹽培養基作為培養細胞的培養基；接種量為5％，培養溫度30℃，200rpm振蕩培養48小時。然後加入10％待處理柴油，30℃，200rpm振蕩培養24小時，分離柴油。休止細胞脫硫利用加入適量有機硫(如DBT)的基礎鹽培養基作為培養細胞的培養基；接種量為5％，培養溫度30℃，200rpm振蕩培養48小時。離心收集菌體，用pH7.2的磷酸鹽緩衝液重懸細胞，按油水比1∶5加入柴油，200rpm振蕩培養8小時，分離柴油，測定硫含量。上述條件可以根據具體情況進行調整。
下面通過實施具體說明。
實施例1枯草芽孢桿菌B.Subtilis的篩選方法。
(1).取基礎鹽培養基10ml，加2mM DBT，接入土樣5g。振蕩1分鐘，沉澱30分鐘。用吸管取出上清液接入肉湯培養基，28-30℃培養24-48小時。
(2).將上述培養菌種分別接種到以DBT為唯一硫源的選擇培養基中，30℃培養48小時。再進一步富集培養2～3天，取培養液離心，上清液作Gibb’s分析，呈現蘭色說明培養物中含有可以專一性將DBT轉化為2-HBP的菌株，或用氣相色譜/質譜分析檢測2-羥基聯苯，判斷專一性脫硫菌種存在。
(3).對上步檢測呈現陽性的脫硫微生物劃線分離，並對單菌落進行純培養。
(4).對純培養的菌株再做進一步的脫硫驗證試驗，然後對有脫硫能力的菌株進行分類學鑑定。本發明通過上述步驟分離、篩選出的脫硫微生物定名為枯草芽孢桿菌B.Subtilis。
實施例2對篩選到的B.Subtilis菌株進行紫外線誘變篩選。
以實施例1分離到的B.Subtilis菌株為出發菌株，經紫外線(U.V)誘變，篩選脫硫能力強的突變株B.Subtilis Fds-1，方法如下(1).測定紫外線照射致死率將分離到的具有脫硫能力的枯草芽孢桿菌接入基礎鹽加DBT的富集培養基中，28-30℃振蕩培養2天。取上述培養液離心，收集細胞。再用生理鹽水洗滌後製成菌懸液。取10ml菌懸液於帶磁轉子的培養皿中，置20w的紫外燈下，垂直距離30cm照射6分鐘。每隔30秒取樣。不同照射時間的菌液分別用生理鹽水稀釋，與沒經照射的對照細胞同時塗布於基礎鹽培養基培養皿，30℃培養2-3天。通過這些培養皿上生長的菌落數，可以計算不同U.V照射時間的致死率。U.V照射3分鐘的致死率在70％左右，此劑量下的存活細胞更容易積累有利變異。
(2).紫外線誘變按前述方法，分裝10mL菌懸液在培養皿中，紫外線照射3分鐘。將存活細胞進行單菌落擴大培養後，接入搖瓶作脫硫能力對比。
(3).突變株B.Subtilis Fds-1的篩選如果所選的菌株將以4S途徑降解DBT，產生二羥基聯苯(2-HBP)，可以用Gibbs反應檢測出來。2-HBP在鹼性條件下與Gibbs試劑(2，6-二氯醌亞胺)反應生成藍色靛酚衍生物。其濃度與顏色成正比。Gibbs反應方法如下用10％的Na2CO3溶液將菌液pH調至8.0，然後離心除菌體，取上清5mL，加入Gibbs試劑50μL，30℃反應30分鐘後，溶液呈亮藍色，即為陽性反應。測量其610nm處吸光度。測定發酵液中2-HBP的含量。
脫硫活力的測定以單位時間一定量的菌體降解DBT產生2-HBP的量來比較脫硫活力將培養液離心後用pH7.0緩衝液洗滌，加DBT溶液，於30℃恆溫振蕩反應1h。測定2-HBP的生成量。從200個具有脫硫能力的突變株中，選定一個脫硫能力較強的菌株，菌株編號為B.subtilis Fds-1。
實施例3B.Subtilis Fds-1菌株的生長細胞脫硫。
(1)將B.Subtilis Fds-1菌株按10％接種量接入到含有0.5～1.0mM DBT的50ml基礎鹽培養基中(組分為每升蒸餾水中含有10.0g葡萄糖，4.0g NH4Cl，6.3g KH2PO4，8.0g K2HPO4，0.2g MgCl2·6H2O，1.0ml金屬鹽溶液和1.0ml維生素混合液。其中，金屬鹽溶液為2.0g CaCl2，1.0g NaCl，0.5g FeCl2·4H2O，0.5g ZnCl2，0.5g MnCl2·4H2O，0.1g Na2MoO4·2H2O，0.05g CuCl2，0.05g Na2WO4·2H2O和10ml 10M HCl溶於1升蒸餾水的溶液；維生素混合液是400mg泛酸鈣，200mg肌醇，400mg煙酸，400mg鹽酸吡哆辛，200mg對氨基苯甲酸和0.5mg維生素B12溶於1升蒸餾水的溶液)。在30℃，200rpm搖床培養48小時，測培養物中菌體濃度與產物2-HBP的含量。
(2)菌濃測定利用細胞乾重與細胞懸液在660nm的光密度(OD660)之間的線性關係，通過測定培養物的OD值得出。
(3)B.Subtilis Fds-1菌株如上所述經過48h生長，菌體濃度可達到1.4～1.5g/L。平均比脫硫活性0.0907～0.1076mM/g幹細胞/h；DBT脫除率可達98.8％。
實施例4B.SubtilisFds-1菌株的休止細胞和生長細胞進行柴油脫硫實驗。
本發明菌株用於石油餾分脫硫可以採用如下具體過程。生長細胞脫硫利用加入適量有機硫(實驗中採用DBT)的基礎鹽培養基(同實施例3)作為培養細胞的培養基；接種量為5％，培養溫度30℃，200rpm振蕩培養48小時。然後加入10％待處理柴油，30℃，200rpm振蕩培養24小時，分離柴油。休止細胞脫硫利用加入適量有機硫(實驗中採用DBT)的基礎鹽培養基(同實施例3)作為培養細胞的培養基；接種量為5％，培養溫度30℃，200rpm振蕩培養48小時。離心收集菌體，用pH7.2的磷酸鹽(實驗中採用磷酸氫鈉)緩衝液重懸細胞，按油水比1∶5加入柴油，200rpm振蕩培養8小時，分離柴油，測定硫含量。
按上述方法，用B.Subtilis Fds-1分別對不同規格柴油進行生物脫硫。
表2數據表明，用B.Subtilis Fds-1菌株對4#柴油(含硫量200μg/g)進行生長細胞脫硫，48h內可使硫含量降至40.1μg/g，脫除率達到79.9％。比未誘變的生長細胞脫硫率提高25.3％。
表2 B.subtiiis菌株誘變前後的脫硫性能比較
表3結果表明B.Subtilis Fds-1菌株休止細胞的平均脫硫率比生長細胞高10％。最高脫硫率可以達到90％以上，說明該菌的休止細胞脫除有機硫能力更強。
表3 B.Subtillis Fds-1菌株的生長細胞和休止細胞脫硫對比
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌株Bacillus subtilis Fds-1，CGMCC No.0644。
2.按照權利要求1所述的菌株，其特徵在於菌株的形態特徵為革蘭氏陽性，杆狀；有亞端生芽孢，芽孢圓形，孢束膨大，細胞直徑小於1μm。
3.按照權利要求1所述的菌株，其特徵在於菌株的生理生化特徵如下表
4.按照權利要求1所述的菌株，其特徵在於所述的菌株從高硫油井附近的土壤中分離並經過紫外線誘變篩選得到的。
5.權利要求1所述菌株在石油或石油餾分脫硫中的應用。
6.按照權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的石油或石油餾分為汽油、煤油、柴油、減壓餾分油、渣油或原油。
7.按照權利要求5所述的應用，其特徵在於脫硫採用生長細胞脫硫。
8.按照權利要求5所述的應用，其特徵在於脫硫採用休止細胞脫硫。
9.按照權利要求7所述的應用，其特徵在於採用生長細胞脫硫過程為菌種培養→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。
10.按照權利要求8所述的應用，其特徵在於採用休止細胞脫硫過程為菌種培養→收集細胞→懸浮於磷酸鹽緩衝液中→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。
全文摘要
本發明涉及的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Fds－1，2001年10月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.0644。本發明菌株從高硫油井附近的土壤中分離並經過紫外線誘變篩選得到的。該菌株的生長細胞或休止細胞均可以通過氧化斷裂C－S鍵脫除有機化合物中的有機硫，特別適合於脫除石油餾分油中的有機硫，脫硫率高。
文檔編號C12N1/20GK1609189SQ200310104908
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月24日 優先權日2003年10月24日
發明者佟明友, 方向晨, 張全, 李淑蘭 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院