利用糖蛋白的糖基化的癌症診斷方法

2023-06-24 17:24:11

專利名稱：利用糖蛋白的糖基化的癌症診斷方法
技術領域：
本發明涉及一種選擇含有參與癌症發展的相關糖蛋白糖基化信息的多肽的選擇方法，以及一種使用所選的多肽進行癌症診斷的癌症診斷方法。相關技術的描述蛋白質是一種參與生物體中持續進行的各項生命保障活動的重要成分。因此，關於內源性蛋白的功能和鑑定的研究，對理解此類參與關鍵活動的蛋白、並基於理解此類蛋白的功能而進一步建立疾病早期診斷及治療的方法是非常重要的。蛋白質在生命保障活動中發揮著重要的作用，一旦需要，蛋白質將經由信號轉導進行翻譯後修飾。最具代表性的翻譯後修飾過程是糖基化和磷酸化。特別是對於糖蛋白的糖基化，許多存在於細胞膜表面的單糖經信號轉導穿過細胞膜，導致所需蛋白質被N-乙醯葡糖胺基轉移酶糖基化。這些糖蛋白由於位於外膜上，發揮具有重要作用。一旦糖蛋白完成其既定使命所需作用，它們將經糖苷酶作用進入糖酵解。然而，多數一些位於細胞膜表面的糖蛋白或糖脂通常會在特殊信號，如致癌基因等的引導作用下被異常糖基化。現已知許多一些疾病與糖苷酶及糖基轉移酶的此類異常功能密切相關，而這些異常功能是由致癌基因導致的異常信號轉導引起的(Kim, Y.J.等人；Glycoconj. J.，1997，14，569-576.； Hakomori,S. , Adv. Cancer Res. ,1989,52,257—331. ；Hakomori,S. , Cancer Res. ,1996,56, 5309-5318)。蛋白糖基化大致可分為兩種類型一種是N-連接糖基化，其特徵在於在蛋白合成過程中，通過特定序苷列組合中(NXS/T，X是除脯氨酸外的胺基酸)的天冬醯胺的側鏈進行糖基化；另一種是0-連接糖基化，其特徵在於通過形成胺基酸如絲氨酸、蘇氨酸等側鏈的羥基進行糖基化。廣泛見於糖蛋白中的是聚糖，如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖 (Man)、海藻糖(Fuc)、N_乙醯半乳糖胺(GalNAc)、N_乙醯葡糖胺(GlucNAc)、及N-乙醯神經氨酸(NeuNAc)。(Frank Kjeldsen 等人，Anal. Chem. 2003，75，2355-2361)。糖基化蛋白的功能，如摺疊、識別、和溶解度等，受到糖多樣性的調節(Varki，A等人，Glycobiology 1993， 3,97-130. ；Parodi, A. J. 入，Armu. Rev. Biochem. 2000，69，69—93)。從正常組和病患組獲得的蛋白樣品的糖基化差異可以是區分病患組和正常組的一個重要線索。迄今為止，報導了一些分析方法可以辨別糖蛋白的差異。蛋白質圖譜就是篩查蛋白質糖基化差異的方法的實例，該方法通過使用質譜儀分析糖蛋白水解得到的聚糖 (Cooke C. L.等人，Anal. Chem.，2007，79，8090-8097)。然而，此方法的缺點是丟失了糖基化亞型上關於各蛋白質特定糖基化位點上的糖基化特徵及糖基化結構特徵的信息，因為此方法只能分析聚糖的平均狀態，而所述聚糖的平均狀態由來源於和合併自不同蛋白和糖基化位點的所有種類的聚糖組成。基於整體圖譜的不同，此常規方法可以區分正常人與患者， 但是由於糖蛋白、糖基化位點、及糖基化亞型等的信息的丟失，它能提供的信息有限。在另一方法中，可以富集具有高分子量的完整糖蛋白。為進行富集，可用多種凝集素，包括ConA(甘露糖)、WGA(N-乙醯葡糖胺)、榴槤凝集素(Jacalin)(半乳糖)、 SNA(sailic acid)、AAL(海藻糖)或通過混合各種凝集素製備的多凝集素(Yang，Z.等人，J. Chromatogr, A, 2004,1053,79-88. ；Wang，Y.等人，Glycobiology，2006，16，514-523)。也可使用稱為聚糖捕捉器的醯胼(Zhang H.等人，Nat. Biotechnol.，2003，21，660 666)。 這些方法不僅可用於富集糖蛋白，也可用於富集糖肽。為了提高定量分析的可靠性，定量分析中可以使用其中糖已經被所需方法分離的多種糖蛋白的水解得到的肽，或者使用同位素標記的試劑(Tian Y.等人，Nat. Protocols, 2007, 2, 334-339) 但是這種方法仍無法區分具有不同糖基化結構的不同聚糖亞型。血漿蛋白質組由至少50000種成分構成，其中蛋白質成分的豐度非常動態化 (1 IO12)。所以，以極低濃度存在的候選蛋白生物標記物很難用液相色譜-質譜聯用法檢測(LC/MS/MS)並進行定量分析(Anderson N. L.等人，Mol. Cell Proteomics. 2002，1， 845-867)。為了使樣品複雜度降到最低從而有效檢測血清中的疾病生物標記物，首先用蛋白去除柱(如MARS，多重親和去除系統)清除佔血漿蛋白質組約90%或以上的高豐度蛋白質，如白蛋白、IgG、IgA、鐵傳遞蛋白、及結合珠蛋白，然後使用所得的蛋白質組。或者，也可使用未經此清除過程的蛋白質組。但是一般清除佔血清的90%的蛋白來製備目標蛋白質組。為了得到糖蛋白，僅用多凝集素富集糖蛋白，而不使用大量蛋白去除柱；或者可以逐步使用大量蛋白去除柱和多凝集素。還可以使用其他大量蛋白去除柱或者具有相應組成的凝集素。從而，製得的血漿蛋白質組進行經丙酮沉澱或MWCO(分子量截留)法的純化過程，以清除糖蛋白收集過程中使用的鹽。可以用質譜儀分析這些高分子量的蛋白或肽。質譜儀有三個不同的功能部件，即離子化器、分析器、和檢測器。樣品在離子化部件中被離子化。隨後經離子化的樣品在分析器中根據質荷比被分離。在檢測器中檢測被分離的離子。主要有兩種溫和的離子化方法用於離子化高分子量蛋白或肽。一種是ESI (電噴霧離子化)，與常規離子化法相比，能夠在不破壞連接的情況下檢測高分子量的生物分子。另一種方法是MALDI (基質輔助雷射解吸離子化)。在ESI法中，可以通過結合HPLC或毛細管型電泳法作為樣品的預處理過程，而降低樣品的複雜度，從而減少鹽或雜質的不期望的影響。質譜儀的分析器部件包括IT-LIT(離子阱-線性離子阱)、Q-Q-T0F (四極-四極-飛行時間)、！OF-TOF (飛行時間-飛行時間)、 FT-ICR(傅立葉變換離子迴旋共振)、Q-Q-Q (四極-四極-四極)、QQ-LIT (四極-四極-離子阱-線性離子阱)、和LIT-軌道阱(線性離子阱-軌道阱)等。總之，優選有助於鑑定片段化肽的單一型或混合型。內源性的高分子量蛋白質先經過上述樣品處理過程斷裂成肽，然後用質譜儀分析。之後使用例如下述的搜尋引擎進行鑑定SEQUEST (http //www. thermo. com)、 MASCOT (http://www. matrixscience. com) > 蛋白表達系統(http://www.waters.com)、 X ！ tandem (http //proteome. ca/opensource. html)、peptideProphet (http //www. proteomecenter. org/software.php)、 禾口 OMSSA(http://pubchem. ncbi. nlm. nih. gov/ omssa/)。樣品肽的質量分析結果用電腦資料庫中保存的所有序列進行篩查，然後通過運用上述搜尋引擎中使用的算法、並考慮蛋白消化規律，而預測假想片段的質量和形態。之後對比預測結果和實驗結果。兩個結果之間的一致程度以概率表示，依據概率鑑定目標蛋白質。要用質譜法鑑定蛋白質，則該目標蛋白的序列需已經保存在資料庫中。這些蛋白序列資料庫由Swiss-Prot、TrEMBL(歐洲分子生物學翻譯實驗室)、UniProt (通用蛋白資源)、 NCBI(美國國家生物技術信息中心)、IPI(國際蛋白質索引)等提供(Diamondl D. L.等人，Hepatology 2006，44，229-308)。用穩定的同位素進行蛋白標記是用質譜儀定量分析鑑定出的蛋白質的方法之一。 例如，最具代表性的標記包括ICAT(同位素編碼親和標籤)、ICPL(同位素編碼蛋白質標籤， 所述方法為培養基中的氮源被15N同位素取代而生成的蛋白質用質譜儀進行分析)、以及 SILAC(細胞培養中穩定同位素胺基酸標記，其中向培養基中加入穩定同位素胺基酸，從而在細胞培養過程中將其引入表達的蛋白質中)。還可以使用標記蛋白水解產生的肽的方法， iTRAQ(用於相對和絕對定量的同重標籤)，以及僅用同位素取代糖蛋白或經水解的糖肽的方法(Tian Y.等人，Nat. Protocols，2007，2，334-339)。此外，可以使用無標記方法，其基於通過重複實驗確定的可靠肽比較正常組與病患組，該重複實驗不對肽或蛋白質進行標記，也不用測定液相色譜的保留時間，而用質譜儀測定精確分子量(Silva J. C.等人，Anal. Chem. 2005，77，2187-2200 ;Finney G. L.等人， Anal. Chem. 2008，80，961-971)。當樣品中以痕量存在的蛋白質被選定為篩選候選生物標記物時，使用顯示具有良好選擇性和敏感性的MRM(多反應監測)。MRM通過兩種不同方式進行一種是無標記的比較定量分析；另一種是絕對定量分析，其特徵在於事先注入穩定同位素標記的肽標準物。為了更有效的進行MRM，需考慮的重要因素是，選擇只在目標蛋白中檢測到的肽，以及通過使用特殊程序和資料庫如TIQAM(用於通過MRM進行定量分析的目標識別)確定相應蛋白質的MRM檢測通道(Anderson L等人，Mol. Cell Proteomics. 2006,5, 573-588)。使用SISCAPA(抗肽抗體提取的穩定同位素標準物)的免疫親和-MS是進行下述的方法大規模獲取代表篩得的候選生物標記蛋白的肽，構建識別所述篩得的肽的抗體，使用所述抗體從混合肽中分離出目標肽，並且通過MRM使樣品複雜度最小化從而分析所述目標。該方法能提高LC/MS/MS法的LOD(檢測極限)和LOQ(定性極限)。因此，該方法具有極好的LOD和LOQ且不具有肽選擇性，可以取代常規方法如ELISA (酶聯免疫吸附試驗)及蛋白質印跡(Anderson NL等人，J Proteome Res. 2004. 3，235444.)。通過使用抗體選擇性分離並富集的抗原肽可以與抗體綴合，使用MALDI質譜儀通過免疫-MALDI-MS (iMALDI MS) 進行分析。本發明人研究開發了一種區分正常組與肝癌患者組蛋白糖基化差異的新方法。結果，本發明人證明當糖蛋白被糖基化時，特異肽的水解效率受到空間位阻效應影響，此空間位阻效應是由佔據巨大空間的糖鏈引起的，根據糖基化程度和周圍糖鏈的結構而改變所得肽的水平。本發明人還證明了，由糖蛋白水解產生的並參與糖基化的此類特異肽可用於通過定量質譜診斷癌症，因而此類肽可用作癌症診斷標記物，從而完成了本發明。發明概述本發明的目的是提供一種選擇用於癌症診斷的糖基化相關特異肽的方法，所述方法通過利用特異肽的水解過程根據參與癌症發展的糖蛋白的糖鏈的改變而改變的這一特殊現象；還提供了一種使用所選的特異肽的癌症診斷方法。為達到上述目的，本發明提供了一種癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，通過利用下述特殊現象選擇糖基化相關肽當用水解酶將從癌症患者樣品中分離/純化的蛋白質水解成肽時，水解的肽的量根據糖蛋白的糖鏈的改變而定量且特異地改變。本發明還提供了一種癌症診斷方法，其特徵在於，當用水解酶將從受試者樣品中分離/純化的蛋白質水解成肽時，而糖基化相關肽中的水解的肽的量根據糖蛋白的糖鏈的改變而定量且特異地改變時，確定具有所述糖基化相關肽的受試者是否具有癌症高風險。本發明還提供了一種用於癌症的診斷試劑盒，其包括與選自下述的一種或多種糖基化相關肽特異結合的抗體具有SEQ. ID. NO 1所示胺基酸序列的蜂毒明肽afamin前體、 具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原-1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO :4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。本發明還提供了一種用於癌症診斷的生物晶片，所述生物晶片上抗體整合在固體基質上，所述抗體與選自下述的一種或多種糖基化相關肽特異結合具有SEQ. ID. NO :1所示胺基酸序列的蜂毒明肽afamin前體、具有SEQ. ID. NO :2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO :4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。本發明還提供了一種與選自下述的任意肽特異結合的抗體在製備癌症診斷試劑盒中的用途具有SEQ. ID. NO :1所示胺基酸序列的蜂毒明肽afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。另外，本發明提供了一種生物分子在製備用於癌症診斷的生物晶片中的用途，所述生物分子可以從受試者的血液樣品中獲得，並且與選自下述的一種或多種肽的組合特異結合具有SEQ. ID. NO :1所示胺基酸序列的蜂毒明肽afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。有益作用如上文所述，本發明有利於經定量分析特異肽從而進行癌症的快速早期診斷，所述特異肽獲得自受試者的樣品，含有關於糖基化水平和糖鏈結構的蛋白異常糖基化的信息，並且所選的特異肽可有效用於癌症診斷的標記物。附圖簡述

圖1的示意圖說明肽片段的LC/MS/MS過程，所述肽片段是用胰蛋白酶消化源自正常組和病患組血漿的蛋白質組而得到的。
圖2的圖說明用LC/MS/MS定量分析正常組和病患組全部多肽的PCA(主成份分析)統計結果。圖3的圖說明與區分正常組和病患組的特異性密切相關的4種選出的特異肽的 PCA (主成份分析)統計結果。圖4是一組圖，其說明與區分正常組和病患組的特異性密切相關的4種選出的特異肽的ROC (接受者操作特徵曲線)。圖5的示意圖說明與區分正常組和病患組的特異性密切相關的該4種選出的特異肽是與N-連接糖基化密切相關的肽，也說明糖蛋白水解效率取決於糖基化。優選實施方式的描述下文將對本發明進行詳細描述。本發明提供了一種癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，通過利用下述特殊
7現象選擇糖基化相關肽當用水解酶將從癌症患者樣品中分離/純化的蛋白質水解成肽時，水解的肽的量根據糖蛋白的糖鏈的改變而定量且特異地改變。本發明中，糖蛋白中糖鏈的改變表明在癌症患者或有癌症病史的那些人中示出的蛋白糖基化的不同方面。這些改變可以發生在天冬醯胺、蘇氨酸、或絲氨酸位點上，且包括各位點的糖基化水平或糖鏈結構中的任何改變。本發明中，癌症優選是選自下述的癌癥結腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、和胰腺癌，更優選肝癌；但不總是限於此。認為癌症是通過異常信號傳遞和異常識別發展的。而所述異常多數源於細胞表面存在的或由細胞表面分泌的糖蛋白。本發明中，鑑於細胞系、細胞區域、器官組織、藥物施用、飲食習慣、營養狀況、和病情發展等，可以製備本文所用的糖蛋白或肽並用作用於癌症診斷的樣品。糖蛋白的糖基化位點佔據著相當巨大的空間位置，會影響相鄰特異肽的水解效率。因此，糖基化位點不同或改變會影響水解產生的特異肽的量。與正常樣品不同，癌症樣品顯現出異常的糖基化，如非必要的糖基化或者由異常信號傳遞、識別、或粘附引起的改變的糖基化。所述蛋白的異常糖基化導致蛋白質水解不同，這可用特異選擇的肽進行定量分析來證明，因而區別癌症患者血液樣品和正常血液樣品。具體地，癌症診斷標記物的篩選方法優選包括以下步驟，但不總是限於此1)從獲自癌症患者的樣品中分離總蛋白質；2)通過使用大量蛋白去除柱純化經分離的總蛋白質；3)通過使用水解酶處理經純化的蛋白質而製備水解的肽片段混合物；4)定量分析水解的肽片段混合物；5)篩選與對照組相比顯示出量的顯著改變的那些肽；以及6)確認所選的顯示出量的顯著改變的肽是否源於糖蛋白。上述方法中，步驟1)中所述的癌症優選是選自下述的癌癥結腸癌、胃癌、肺癌、 肝癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、和胰腺癌，更優選肝癌；但不總是限於此。上述方法中，步驟1)中所述的樣品優選血液樣品，因為血液含有所有不同器官分泌的各種蛋白質。本文所述的樣品不僅可以是血液，也可以是血漿、血清、唾液、尿液、腦脊液、卵泡液、乳汁、晶狀體液、和胰液，這些都可以是用於使用糖蛋白相關肽進行癌症診斷的良好樣品。上述方法中，步驟1)中所述的蛋白質不受其大小限制，且可以是寡肽、多肽或者蛋白質。上述方法中，由於從樣品中分離的蛋白質組的蛋白成分的密度非常動態化，使得難以檢測候選生物標記蛋白並進行定量分析，因此通過使用大量蛋白去除柱(如MARS，多重親和去除系統)進行步驟幻所述的純化，從而使樣品的複雜度最小化；但不總是限於此。難以在蛋白質水平上分析從樣品中獲得的蛋白質。為了分析蛋白質，需要將其進行水解。為此，可以進行預處理，例如變性、還原、半胱氨酸烷基化、去磷酸化、或去糖基化。蛋白質的分離/純化優選通過ID-凝膠蛋白分離、2D-PAGE、SEC (尺寸排阻色譜)、 FFE系統(自由流動電泳系統)、或FFF(場流分餾)進行；但不總是限於此。上述方法中，步驟幻所述的水解酶優選是選自下述的一種或多種酶Arg-C、Asp-N、GlU-C、Lys-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，更優選胰蛋白酶；但不總是限於此。預處理後，優選通過使用多種水解酶將高分子蛋白質或糖蛋白水解成低分子肽， 從而使用質譜儀對其進行分析。一般而言，為將蛋白質水解成肽片段，主要使用胰蛋白酶，其可以消化賴氨酸和精氨酸之間的醯胺鍵。然而，根據目的，也可以選擇性地或逐步地使用僅消化賴氨酸位點的 Lys-C、僅消化精氨酸位點的Arg-C、和僅消化天冬醯胺位點的Asp-N等。作為預處理的一個步驟，水解的肽片段優選地使用LC上裝配的可用於自動清除鹽的Zip-Tip或捕獲柱進行脫鹽，從而清除所有可能導致質譜分析中任何問題的鹽。上述方法中，步驟4)中所述的定量分析優選通過選自下述的方法進行蛋白晶片分析、MALDI-T0F (基質輔助雷射解吸/離子化飛行時間質譜)、SELDI-T0F(表面增強雷射解吸/離子化飛行時間質譜)、雙向電泳、液相色譜-質譜(LC-MS)、蛋白質印跡和ELISA，更優選通過直接與nano-UPLC相連的電噴霧離子化(ESI)進行；但不總是限於此。為了比較正常組和病患組，定量分析的結果用層次聚類、PCA(主成份分析)等進行統計分析。如有必要，可進行歸一化，從而最小化每批分析的差異。上述方法中，步驟幻中所述的「量的顯著改變」是指量的增加或者減少。上述方法中，步驟6)所述的源自糖蛋白的肽優選具有距離胺基酸序列N-末端或者C-末端處水解位點的8個胺基酸範圍內的糖基化位點；但不總是限於此。糖蛋白的糖基化位點佔據著相當巨大的空間位置，會影響鄰近特異肽的水解效率。因此，糖基化位點的不同或改變會影響水解產生的特異肽的量。與正常樣品不同，癌症樣品顯現出異常的糖基化，如非必要的糖基化或者由異常信號傳遞、識別、或粘附引起的改變的糖基化。所述蛋白的異常糖基化導致蛋白質水解不同，這可用特異選擇的肽進行定量分析來證明，因而區別癌症患者血液樣品和正常血液樣品。本發明還提供了一種癌症診斷方法，其特徵在於，當用水解酶將從受試者樣品中分離/純化的蛋白質水解成肽時，而糖基化相關肽中的水解的肽的量根據糖蛋白的糖鏈的改變而定量且特異地改變時，確定具有所述糖基化相關肽的受試者是否具有癌症高風險。具體地，所述癌症診斷方法優選包括以下步驟，但不總是不限於此1)從獲自受試者的樣品中分離總蛋白質；2)通過使用大量蛋白去除柱純化經分離的總蛋白質；3)通過使用水解酶處理經純化的蛋白質而製備水解的肽片段混合物；4)定量分析水解的肽片段混合物；5)篩選與對照組相比顯示出量的顯著改變的那些肽；6)確認所選的顯示出量的顯著改變的那些肽是否源於糖蛋白；以及7)當確認顯示出量的顯著改變的肽源於糖蛋白時，判斷或診斷受試者的癌症或癌症高風險。上述方法中，所述癌症優選是選自下述的癌癥結腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宮癌、 乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、和胰腺癌，更優選肝癌；但不總是限於此。上述方法中，步驟1)中所述的樣品優選血液樣品，因為血液含有所有不同器官所分泌的各種蛋白質。本文所述的樣品不僅可以是血液，也可以是血漿、血清、唾液、尿液、腦脊液、卵泡液、乳汁、晶狀體液、和胰液，這些都可以是用於使用糖蛋白相關肽進行癌症診斷的良好樣品。上述方法中，步驟1)中所述的蛋白質不受其大小限制，且可以是寡肽、多肽或者蛋白質。上述方法中，由於從樣品中分離的蛋白質組的蛋白成分的密度非常動態化，使得難以檢測候選生物標記蛋白質並進行定量分析，因此通過使用大量蛋白去除柱(如MARS， 多重親和去除系統)進行步驟2)所述的純化，以使樣品的複雜度最小化；但不總是限於此。難以在蛋白質水平上分析從樣品中獲得的蛋白質。為分析蛋白質，需要將其進行水解。為此，可以進行預處理，例如變性、還原、半胱氨酸烷基化、去磷酸化、或去糖基化。蛋白質的分離/純化優選通過ID-凝膠蛋白分離法、2D-PAGE、SEC(尺寸排阻色譜)、FFE系統(自由流動電泳系統)、或FFF(場流分餾)進行；但不總是限於此。上述方法中，步驟幻所述的水解酶優選是選自下述的一種或多種酶Arg-C、 Asp-N、GlU-C、Lys-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶，更優選胰蛋白酶；但不總是限於此。預處理後，優選通過使用多種水解酶將高分子蛋白或糖蛋白水解成低分子肽，從而使用質譜儀對其進行分析。一般而言，為將蛋白質水解成肽片段，主要使用胰蛋白酶，其可以消化賴氨酸和精氨酸之間的醯胺鍵。然而，根據目的，也可以選擇性地或逐步地使用僅消化賴氨酸位點的 Lys-C、僅消化精氨酸位點的Arg-C、和僅消化天冬醯胺位點的Asp-N等。作為預處理的一個步驟，水解的肽片段優選地使用LC上裝配的可用於自動清除鹽的Zip-Tip或捕獲柱進行脫鹽，從而清除所有可能導致質譜分析中任何問題的鹽；但不總是限於此。上述方法中，步驟4)中所述的定量分析優選通過選自下述的方法進行蛋白晶片分析、MALDI-T0F (基質輔助雷射解吸/離子化飛行時間質譜)、SELDI-T0F(表面增強雷射解吸/離子化飛行時間質譜)、雙向電泳、液相色譜-質譜(LC-MS)、蛋白質印跡和ELISA，更優選通過直接與nano-UPLC相連的電噴霧離子化(ESI)進行；但不總是限於此。為了比較正常組和病患組，定量分析的結果用層次聚類、PCA(主成份分析)等進行統計分析。如有必要，可進行歸一化，從而最小化每批分析的差異。上述方法中，步驟幻中所述的「量的顯著改變」是指量的增加或者減少。上述方法中，步驟6)所述的源自糖蛋白的肽優選具有距離胺基酸序列N-末端或者C-末端處水解位點的8個胺基酸範圍內的糖基化位點；但不總是限於此。所述方法是不進行標記而用於正常組和病患組的定性/定量分析方法。在用所述無標記法定量分析蛋白質組時，用質譜儀測量經LC柱分離的混合肽的分子量和可重複的保留時間，其精確度非常重要。因此，優選的，以規律的間隔加入其確切分子量已知的肽，以便於在分析後調整分子量；但不總是限於此。上述方法中，當用質譜儀通過無標記法進行定量分析時，需要校正批次樣品間的誤差。為此，內標物使用樣品中檢測不到的通過水解標準蛋白而得到的肽。減少批次定量分析間誤差的優選方法是，每次向每個樣品中加入等量的此內標物，以歸一化批誤差；但不總是限於此。在此，任何種類的蛋白質均可用作內標物，只要所述蛋白在要分析的樣品中檢測不到即可；或者，質譜法檢測到的蛋白的肽也可用作內標物，只要在正常組和病患組中觀察不到定量差異即可。
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上述方法具有以下優勢可以通過常規蛋白質組處理方法進行預處理；無需收集糖或糖蛋白的任何額外步驟；它靶向以根據近期蛋白質組分析技術能檢測到的濃度包含於目標樣品中的那些蛋白質；並且能區分病患組和正常組，而不使用非常複雜且定量分析昂貴的同位素置換法。上述方法中，基於對未標記的受試者樣品的研究結果進行定量分析，區分病患組和正常組。但也可以選擇性地使用多種蛋白標記法或水解肽標記法。上述方法中，糖蛋白相關肽可以被快速篩選。與正常人不同，癌症患者的糖基化發展異常，所以此快速篩選有助於了解正常組和病患組間不同的生命保障活動，也有助於有效的診斷各種疾病。本發明人從正常人和癌症患者的血液中分離蛋白質組。用大量蛋白去除柱清除至少90%的大量蛋白，隨後經丙酮沉澱得到純化的蛋白質組。通過用胰蛋白酶水解一定量的純化的蛋白質組，以得到肽混合物。從各蛋白質組獲得的肽混合物通過LC/MS/MS法分析3 次。用1 種已確認的肽構建焦點資料庫，在此基礎上，對各蛋白質組樣品進行定性/定量質譜分析(見圖1)。基於上述結果進行PCA(主成份分析)，由此明確區分病患組和正常組 (見圖2)。為了篩選特異顯示正常組與病患組間差異的那些肽，對每個蛋白的肽譜(ρ印tide pattern)進行分析。結果，從示出正常組與病患組間可量化差異的多個肽片段中，選出4種源自糖蛋白的特異肽(見圖幻。對所選的4種特異肽進行PCA(主成份分析)。由此更明確地證實了正常組和病患組之間的差異(見圖3)。用ROC曲線分析所選肽。結果證明，所述肽顯示區分病患組和正常組的高靈敏性和特異性(見圖幻。因此，證明通過比較所選4種特異肽的可量化差異區分癌症患者組和正常組，而無需量化地比較所有蛋白質(見圖4)。本發明人對所選4種特異肽進行序列分析。結果證明所述序列與N-連接的蛋白糖基化特異基序(N-X-S/T基序)相關(見圖4)。通過定量分析所選特異肽證實由蛋白糖基化導致蛋白水解的不同。根據此結果，能區分癌症患者的血液樣品和正常血液樣品(見圖3)。因此，本發明所選的特定肽可有效用作可用於使用人血液樣品診斷、預測或驗證癌症的標記物肽。本發明還提供了一種癌症診斷試劑盒，其包括與選自下述的一種或多種糖基化相關肽特異性結合的抗體具有SEQ. ID. NO 1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白-1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原-1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。通過證明顯著定量改變是由水解酶處理受試者樣品而引起糖鏈改變導致的，所述試劑盒可用於診斷及篩選癌症。本文所述癌症優選是選自下述的癌癥結腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳腺癌、 前列腺癌、甲狀腺癌、和胰腺癌，更優選肝癌；但不總是限於此。所述試劑盒中可另外包括所述4種標記物肽或其同位素標記的肽作為標準物。可用於所述試劑盒中的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、和表位可連接片段等。 多克隆抗體可用傳統常規方法製備，包括以下步驟將其中一種多肽標記物注入動物體內； 從動物上取血；並得到含抗體的血清。所述多克隆抗體可用選自於山羊、兔子、綿羊、猴子、 馬、豬、牛、狗等的宿主動物製備，並用本領域技術人員現有技術中熟知的常規方法純化。在此本文所述的單克隆抗體可以用任何可以在通過細胞系連續培養中產生抗體分子的技術製備，例如，但不僅限於，雜交瘤技術、人類B-細胞雜交瘤技術、和EBV-雜交瘤技術(Kohler G 等人，Nature 256 :495-497,1975 ； ；Kozbor D 等人，J Immunol Methods 81 :31-42, 1985 ； ；Cote RJ 等人，Proc Natl Acad Sci 80 :2026_2030，1983 ;and ；以及 Cole SP 等人，Mol Cell Biol 62 109-120，1984)；但不總是限於此。還可製備具含有特異於其中一種所述多肽標記物的特異結合位點的抗體片段(Huse WD等人，Science 254 :1275-1281, 1989)，。而製備這種含具有特殊序列的多肽特異性抗體的技術方法是本領域技術人員已熟知的現有技術。所述抗體優選對糖基化改變之前和/或之後的肽特異，但不總是限於此。本發明所述試劑盒中所用的抗體可固定於固體基質，以便於進行後續步驟，例如洗滌或分離。本文所述的固體基質例如合成樹脂、硝酸纖維素、玻璃板、金屬板、玻璃纖維、 微球、和微珠。本文所述合成樹脂可以是聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、PVDF、或尼龍。使從受試者得到的樣品與固定於固體基質上特異結合一種肽標記物的抗體接觸。 在此，接觸前可以對樣品進行適當稀釋。在使從受試者得到的樣品與固定於固體基質上特異結合一種肽標記物的抗體接觸後，通過洗滌去除未結合的蛋白，隨後用MALDI-MS檢測特異肽。本發明所述試劑盒可另外包括與所述肽標記物特異結合的檢測抗體。本文所述檢測抗體可以是用著色酶、螢光物質、放射性同位素、膠體等標記的綴合物，優選與所述標記物特異結合的二抗。本文所述的著色酶可以是過氧化酶、鹼性磷酸酶、或酸性磷酸酶(如辣根過氧化物酶)。本文所述的螢光物質可以是羧酸螢光素(FCA)、異硫氰酸螢光素(FITC)、 硫脲螢光素(FTH)、7-乙醯氧基香豆素-3-基、螢光素-5-基、螢光素-6-基、2 』，7 』 - 二氯螢光素-5-基、2』，7』 - 二氯螢光素-6-基、二氫四甲基若丹明-4-基、四甲基若丹明-5-基、 四甲基若丹明-6-基、4，4- 二氟-5，7- 二甲基-4-硼-3a，4a- 二氮雜-s_吲丹烯-3-乙基或4，4- 二氟-5，7- 二苯基-4-硼-3a，4a- 二氮雜-s_吲丹烯-3-乙基。本發明所述試劑盒可另外包括與著色酶反應的底物，以及用於清除未結合蛋白且只保留綴合的肽標記物的洗液或洗脫劑。本發明還提供了一種用於癌症診斷的生物晶片，所述生物晶片上抗體整合於固體基質上，所述抗體與選自下述的一種或多種糖基化相關肽特異結合具有SEQ. ID. NO :1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原-1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4 所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。通過證明顯著定量改變是由水解酶處理受試者樣品而引起糖鏈改變導致的，所述生物晶片可用於診斷及篩選癌症。本文所述癌症優選是選自下述的癌癥結腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳腺癌、 前列腺癌、甲狀腺癌、和胰腺癌，更優選肝癌；但不總是限於此。本文所述的生物分子優選抗體或適配體，但不總是限於此。所述生物分子不僅指小分子如初級代謝物、次級代謝物和天然物質，還指由活生物體產生的有機分子例如蛋白質、多糖和核酸。本文所述適配體是指與特殊靶向分子結合的寡核苷酸或者肽。本文所述的固體基質優選自塑料、玻璃、金屬、和矽，但不總是限於此。
本發明還提供了一種與選自下述的任意肽特異結合的抗體在製備癌症診斷試劑盒中的用途具有SEQ. ID. NO 1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。本文所述癌症優選是選自下述的癌癥結腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳腺癌、 前列腺癌、甲狀腺癌、和胰腺癌，更優選肝癌；但不總是限於此。此外，本發明提供了一種生物分子在製備用於癌症診斷生物晶片中的用途，所述生物分子可以從受試者的血液樣品中獲得，並且與選自下述的一種或多種肽的組合特異結果具有SEQ. ID. NO :1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO :3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、 以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。所述癌症優選是選自下述的癌癥結腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、和胰腺癌，更優選肝癌；但不總是限於此。本文所述生物分子優選是抗體或適配體，但不總是限於此。所述生物分子不僅指小分子如初級代謝物、次級代謝物和天然物質，還指由活生物體產生的有機分子例如蛋白質、多糖和核酸。本文所述適配體是指能與特殊靶向分子結合的寡核苷酸或者肽。本發明的實用且目前優選的實施方式將在下列實施例中闡明。然而，歡迎本領域的技術人員，在本發明的基礎上，在本發明的精神和範圍內，進行調整和改進。實施例1製備樣品如表1所示，本發明人從正常血液和肝癌患者血液(取自韓國延世大學西富蘭斯醫院醫院)中獲得蛋白質組，隨後根據通常已知方法為方便純化而進行預處理過程。表1
患者編號年齡性別期數壞死程度病原病理125男30HBV肝炎261男1 20HCV慢性肝炎372男210HBV慢性肝炎446女30HBV肝硬化566女10HCV肝硬化646男1 230HBV肝硬化759男230HBV肝硬化 血漿蛋白質組由至少50000種成份構成，蛋白成份的密度非常動態化(1 IO12)。 因此，候選生物標記蛋白，尤其是以極低濃度存在且佔不到10%的蛋白，難以用檢測極限是IO4 IO6的液相色譜-質譜(LC/MS/MS)檢測並進行定量分析。因此，為了使樣品複雜度最小化以有效檢測血清中疾病生物標記物，先用蛋白去除柱(如MARS，多重親和去除系統) 清除佔血漿蛋白質組約90%或以上的那些蛋白質，如白蛋白、IgG、IgA、鐵傳遞蛋白、及結合珠蛋白，製得的血漿蛋白質組經丙酮沉澱或分子量截留(MWCO)純化。經純化的蛋白質溶於 Tris-HCL緩衝液(pH = 8. 00)，然後用Bradford法定量。接著，從各正常組和病患組製備等量的總蛋白。向製得的蛋白樣品中加入二硫蘇糖醇(DTT，10mM)，之後於60°C下反應30分鐘。結果，半胱氨酸位點上的二硫鍵被還原，導致蛋白質變性。在暗室裡，通過與IAA(碘乙醯胺)烷基化試劑在室溫下反應，封閉已被還原的半胱氨酸位點。通過與胰蛋白酶在37°C 下反應10小時，消化半胱氨酸位點被保護的蛋白質。由蛋白水解得到的肽用真空乾燥機乾燥。各正常組和病患組經乾燥的肽溶於等體積緩衝液，以製備相同濃度的肽樣品。向所有樣品中加入相同濃度的源自酵母的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(GPD)肽作為內標物，隨後進行 〈實施例2>所述的實驗。分析多肽為了分離和純化〈實施例1>中製備的樣品，將捕獲柱(C18，5ym，180ym X 20mm, Waters)和分析柱(BEH，C18,1. 7 μ m, 75 μ m X 15cm, Waters)與 nano-UPLC (Waters)連接使用。用與nano-UPLC直接連接的電噴霧離子化(ESI)質譜儀(PremieH四級飛行時間 Ο -TOF)) ,Waters，英國)對已分離/純化的樣品進行ESI-MS/MS。每個樣品蛋白質組經胰蛋白酶水解而得到混合肽，將5 μ L相同濃度的所述混合肽上樣到與質譜儀相連的液相色譜(LC-ESI/MS/MS)中。樣品經過捕獲柱(α8，5μπι，180μπι X 20mm)以清除其中的鹽。然後，複雜肽經分析柱(BEH，C18,1.7ym,75ym X 15cm)分離。各時間區域的樣品經過質譜儀以m/z值的形式檢測。分析完成後，通過搜尋引擎如蛋白表達系統、MASCOT、和SEQUEST 等對蛋白質進行定性。根據上述質譜分析得到的分離時間和m/z值，用選擇離子色譜法確定所述定性的肽。為了使用無標記的定量分析法對定性的ESI-MS/MS結果進行定量分析， 重要的是要知道肽的確切分子量和肽分離時間的可重複性。所以在I^emier型質譜儀上安裝的鎖定噴霧器，以防止液相色譜中分離的電噴霧離子進入質譜儀，同時僅噴出分子量已經精確鑑定的標準物(GFP，Glu-血纖維蛋白肽B)。因此，構建的系統經過更精確地校正各肽的分子量而提供可重複的高度可靠的結果。為了使正常組和病患組樣品的定量分析建立在更加可靠的可復現的結果上，ESI-MS/MS分析重複3次。實施例3定性定量分析用搜尋引擎MASCOT對 中得到的結果進行定性。通過收集從正常組和病患組得到的所有已定性的蛋白質列表，構建焦點資料庫。基於焦點資料庫，用蛋白表達系統(WatenUK. 2. 1版)進行定性/定量分析。定性/定量分析的結果由Excel導出，隨後進行主成份分析(PCA)。結果如圖2所示，病患組明顯有別於正常組(圖2)。由此證明，本發明所述的肽分析法可用於正常組和病患組的比較篩選。基於統計處理過的PCA結果，對從正常組和病患組獲得的那些蛋白質進行肽譜分析。因而，從源於相同蛋白的肽中選出特別顯示出定量改變並與糖基化位點密切相關的特異肽，如表2所示。經證實，所有選出的肽與各糖蛋白中的N-連接糖基化位點相關(表4)。表2
權利要求
1.一種癌症診斷標記物的篩選方法，所述篩選方法包括下列步驟1)從獲自癌症患者的樣品中分離總蛋白質；2)通過使用大量蛋白去除柱純化所述經分離的總蛋白質；3)通過使用水解酶處理經純化的蛋白質而製備水解的肽片段混合物；4)定量分析所述水解的肽片段混合物；5)篩選與對照組相比顯示出量的顯著改變的那些肽；以及6)確認所選的顯示出量的顯著改變的肽是否源於糖蛋白。
2.根據權利要求1所述的癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，所述癌症選自肝癌、胃癌、結腸癌、肺癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌和胰腺癌。
3.根據權利要求1所述的癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，步驟1)中所述樣品是選自下述的樣品細胞、血液、血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液、卵泡液、乳汁、晶狀體液和胰液。
4.根據權利要求1所述的癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，步驟幻中所述經純化的蛋白質在水解前使用二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙醯胺(IAA)進行預處理。
5.根據權利要求1所述的癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，步驟幻中所述水解酶選自Arg-C、ASp-N、Glu-c、LyS-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。
6.根據權利要求1所述的癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，步驟4)中所述質譜法通過液相色譜-質譜(LS-MQ進行。
7.根據權利要求1所述的癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，步驟6)中所述源於糖蛋白的肽具有距離胺基酸序列N-末端或者C-末端處水解位點8個胺基酸範圍內的糖基化位點。
8.根據權利要求1所述的癌症診斷標記物的篩選方法，其特徵在於，步驟6)中所述源於糖蛋白的肽選自具有SEQ. ID. NO 1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。
9.一種用於提供癌症診斷信息的方法，所述方法包括以下步驟1)從獲自受試者的樣品中分離總蛋白質；2)通過使用大量蛋白去除柱純化所述經分離的總蛋白質；3)通過使用水解酶處理所述經純化的蛋白質而製備水解的肽片段混合物；4)定量分析所述水解的肽片段混合物；5)篩選與對照組相比顯示出量的顯著改變的那些肽；6)確認所選的顯示出量的顯著改變的那些肽是否源於糖蛋白；以及7)當確認所述顯示出量的顯著改變的肽源於糖蛋白時，判斷或診斷受試者為癌症或癌症高風險。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟1)中所述樣品是選自下述的樣品 細胞、血液、血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液、卵泡液、乳汁、晶狀體液和胰液。
11.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟；3)中所述水解酶選自Arg-c、 Asp-N、Glu-C、Lys-C、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶。
12.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟7)中所述源於糖蛋白的肽具有距離胺基酸序列N-末端或者C-末端處水解位點8個胺基酸範圍內的糖基化位點。
13.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，步驟7)中所述源於糖蛋白的肽選自具有 SEQ. ID. NO :1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。
14.一種癌症診斷試劑盒，其包含與選自下述的肽特異結合的抗體具有SEQ. ID. NO 1 所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO :2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原-1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4 所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。
15.根據權利要求14所述的癌症診斷試劑盒，其特徵在於，所述癌症選自肝癌、胃癌、 結腸癌、肺癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌和胰腺癌。
16.一種癌症診斷生物晶片，所述生物晶片上的生物分子整合在固體基質上，所述生物分子與由一種或多種選自下述的肽組成的肽組合特異結合具有SEQ. ID. NO 1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原-1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。
17.根據權利要求16所述的癌症診斷生物晶片，其特徵在於，所述生物分子是抗體或適體。
18.根據權利要求16所述的癌症診斷生物晶片，其特徵在於，所述固體基質選自塑料、 玻璃、金屬、和矽。
19.根據權利要求16所述的癌症診斷生物晶片，其特徵在於，所述癌症選自肝癌、胃癌、結腸癌、肺癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌和胰腺癌。
20.一種與選自下述的任何肽特異結合的抗體在製備癌症診斷試劑盒中的用途具有 SEQ. ID. NO 1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原_1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。
21.一種生物分子在製備癌症診斷生物晶片中的用途，所述生物分子可以從受試者血液樣品中獲得，並且與選自下述的一種或多種肽的組合特異結合具有SEQ. ID. NO 1所示胺基酸序列的afamin前體、具有SEQ. ID. NO 2所示胺基酸序列的α 1酸性糖蛋白1、具有 SEQ. ID. NO 3所示胺基酸序列的激肽原-1前體的高分子量亞型、以及具有SEQ. ID. NO 4所示胺基酸序列的玻連蛋白前體。
22.根據權利要求20或權利要求21所述的用途，其特徵在於，所述癌症選自肝癌、胃癌、結腸癌、肺癌、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌和胰腺癌。
全文摘要
本發明涉及一種使用含有參與癌症發展的糖蛋白糖基化信息的肽的癌症診斷方法。更具體地，本發明涉及一種癌症診斷方法，其通過使用酶的水解過程從參與癌症發展的糖蛋白中獲得肽，從由此得到的肽中定量檢測受蛋白糖基化影響並在水解過程中顯示出特異定量改變的糖基化相關特異肽，從而選擇根據癌症發展顯示出特異定量改變的糖基化相關特異肽。本發明的癌症診斷方法使用所選的糖基化相關特異肽作為標記物。
文檔編號C12N9/50GK102422161SQ200980159154
公開日2012年4月18日 申請日期2009年11月19日 優先權日2009年5月7日
發明者劉種信, 安榮熙, 李周妍, 金珍英 申請人:韓國基礎科學支援研究院