分離配體的方法
2023-06-24 00:48:36
專利名稱：分離配體的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離配體的方法，特別是分離具有結合MHC/HLA分子的能力的T細胞表位的方法。
免疫系統是相關細胞型和分子的一個複雜網絡，為了保護多細胞生物抵抗傳染性微生物它們已經進化。能夠分為進化較早的先天(或自然)免疫和適應性(或獲得性)免疫。先天免疫系統識別模式是針對病原體通常共有的和基本的模式。對於數量有限的分子結構，種系編碼的受體已經進化。相反，適應性免疫系統的細胞——B和T淋巴細胞——能夠識別多種抗原結構。這些受體，根據表達它們的細胞型，被命名為B細胞受體(BCR，其可溶性形式稱為抗體)和T細胞受體(TCR，只是細胞表面結合形式)，通過體細胞重組產生，顯示克隆分布。因此，最初只有少量細胞具有某種特異性。在抗原遇到這些細胞後，開始分裂(克隆擴增)，產生能夠對付該抗原的效應群體。在抗原清除後，特異識別這種抗原的特化細胞亞群仍然具有免疫記憶。總之，適應性免疫系統是緩慢的(與先天免疫相比)，然而是特異的，在重複暴露於一種給定病原體/抗原後增強。
T細胞在適應性免疫中具有中心作用。它們的受體(TCR)識別細胞表面上的「主要組織相容性複合物」(MHC或HLA)肽複合物。這些肽被稱為T細胞表位，代表抗原的降解產物。T細胞有兩個主要類別CD8陽性細胞毒性T細胞(CTL)限於MHC I類。CD4陽性輔助T細胞(HTL)限於MHC II類。HTL是適應性免疫的多種特徵所必需的所謂「專業抗原呈遞細胞」(APC)的激活，免疫球蛋白(Ig)類別轉換，生發中心反應和Ig親和力成熟，CTL的激活，免疫記憶，免疫應答的調節等。
MHC分子收集細胞內的肽，在細胞表面將它們呈遞給T細胞的TCR。MHC有兩個主要類別被CD8陽性CTL識別的I類，和被CD4陽性HTL識別的II類。
MHC I類分子由45kDa的膜錨定α鏈和非共價連接的12kDa的β2-微球蛋白(b2m)組成。通過X射線結晶學解析三維結構(Stern和Wiley 1994)顯示α鏈有一個裂口，它在兩端封閉，適應8-11個胺基酸長度的肽。I類分子普遍表達，它們呈遞的肽來源於胞質蛋白質。它們被蛋白酶體降解，產生的肽被主動轉運到內質網(ER)內。在幾種侶伴蛋白的輔助下，在此形成MHC肽複合物，轉運到細胞表面(Heemels1995)。因此，MHC I類反映了細胞表面上的蛋白質組，使得T細胞能夠識別細胞內病原體或惡性細胞。
MHC II類分子由分別為35kDa和30kDa的兩種膜錨定蛋白質(α和β鏈)組成。它們一起構成了一個裂口，在兩端開口，能夠適應可變長度的肽，通常12-25個胺基酸。儘管有這些不同，但是I類和II類分子共有驚人的結構相似性(Stern和Wiley 1994)。II類分子只在專業APC上表達，包括樹突細胞(DC)、B細胞和巨噬細胞/單核細胞。這些細胞專門以內體途徑攝取並加工抗原。在生物合成後，II類分子立即被所謂的恆定鏈(Ii)複合，阻止ER中肽的結合。當含有II類Ii複合物的小泡(vesicles)與含有外源抗原的降解產物的內體融合時，Ii被降解，直到MHC結合的裂口只被所謂的CLIP肽複合。後者在侶伴蛋白如HLA-DM的幫助下，與抗原肽互換(Villadangos 2000)。最後，MHC肽複合物再次在APC表面呈遞，它們以多種方式與HTL相互作用。
MHC系統是多基因和極其多態性的，是高度複雜的。人類的I類α鏈，有三個基因座，被稱為HLA-A、-B和-C。同樣，有三個II類α鏈基因座(DRA、DQA、DPA)。至於II類β鏈基因座，情況更加複雜，因為有4個不同的DRβ鏈(DRB1、2、3、5)加DQB和DPB。除了單態的DRα鏈DRA之外，每個基因座存在於群體中的多個不同的等位基因中(幾十個到幾百個)(Klein 1986)。不同的等位基因具有很大不同的肽結合特異性。例如，等位基因被命名為HLA-A*0201或HLA-DRB1*0401或HLA-DPA*0101/DPB*0401。
T細胞表位已經用多種方法鑑定(Van den Eynde 1997)。例如，T細胞系和克隆已經用來在適當HLA分子轉染的COS細胞中篩查cDNA表達文庫。此外，也利用生物化學方法。後者包括從靶細胞表面上的MHC分子中洗脫天然配體，通過幾個層析步驟分離這些肽，利用表位重建測定分析它們與淋巴細胞的反應性，通過質譜法測序(Wolfel等人1994，Cox等人1994)。
最近，高度靈敏的細胞因子檢測試驗如IFN-γ酶聯印跡(ELIspot)的出現，允許利用直接來自體內的淋巴細胞篩選重疊的合成肽(Maecker 2001，Kern 2000，Tobery 2001)。首先，Kern等人(1999和2000)使用重疊的9mer肽集合的陣列在體外對CD8+T細胞表位作圖。後來，Tobery等人，2001改進了這一方法，證實含有多達64個20mer肽的集合可以用來在小鼠中篩選CD8+和CD4+T細胞表位。這兩種方法都是基於通過細胞內染色(Kern等人2000)或ELIspot測定(Tobery等人，2001)測定INF-γ的產生，監測抗原特異的應答。利用15-mers的混合物，CD4+T細胞應答大約等於在使用完整可溶性蛋白作為抗原時檢測到的應答，而CD8+T細胞應答顯著高於利用可溶性蛋白刺激檢測到的通常可以忽略的應答，這並不令人驚訝。而且，對15胺基酸肽的混合物的CD8+T細胞應答類似於利用選擇代表已知MHC I類最小表位的8-12胺基酸肽的混合物獲得的應答。最可能的是，在這些情況下，與細胞膜結合的肽酶負責將肽「修剪」成最佳長度(Maecker等人，2001)。
一個令人感興趣的備選方法是用特異淋巴細胞篩查合成組合肽庫。例如，由以位置掃描方式排列的200種混合物組成的十肽文庫已經成功用於鑑定刺激T細胞的克隆型群體的肽配體(Wilson等人，J.Immunol.，1999，1636424-6434)。
許多T細胞表位已經用所謂的「反向免疫法」測定(Rammensee1999)。在這種情況下，產生可能的T細胞表位的蛋白質已知，掃描其一級序列的HLA結合基序。一般合成幾十到幾百個候選肽，乃至全套重疊肽，檢測它與HLA分子的結合。通常選擇最佳結合劑進一步表徵它與T細胞的反應性。例如，藉助HLA轉基因小鼠，通過在體外或體內引發T細胞，能夠實現該目的。
本發明的一個目的是提供一種方法，用於篩選特異MHC分子的配體，優選地用於輸送適合且特異的T細胞表位，其選自具有對給定MHC分子的未知特異性的多種配體。
因此，本發明提供一種方法，用於分離具有結合MHC/HLA分子的能力的配體，或含有該配體與該MHC/HLA分子的複合物，該方法包括下列步驟—提供配體集合，該集合含有可與該MHC/HLA分子結合的配體和不與該MHC/HLA分子結合的配體，—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合，從而使具有結合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結合，形成含有該配體和該MHC/HLA分子的複合物，—檢測該複合物，任選地使該複合物與不與該MHC/HLA分子結合的配體分離，—任選地從該複合物中分離並表徵該配體。
本發明也提供一種方法，用於分離具有結合MHC/HLA分子的能力的T細胞表位或含有該表位與該MHC/HLA分子的複合物，該方法包括下列步驟—提供配體集合，該集合含有可與一種MHC/HLA分子結合的配體和不與該MHC/HLA分子結合的配體，—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合，從而使具有結合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結合，形成含有該配體和該MHC/HLA分子的複合物，—檢測該複合物，任選地使其與不與該MHC/HLA分子結合的配體分離，—任選地從該複合物中分離並表徵該配體，—用T細胞測定法測定任選地分離的該配體或該複合物的T細胞激活能力，和
—提供具有T細胞激活能力的任選地分離的配體作為T細胞表位或複合物。
根據本發明的方法使得一種篩選系統能夠篩選與特異MHC/HLA分子的結合能力。鑑定MHC結合分子是病原體、腫瘤等的分子表徵的一種重要工具。因此，本發明能夠根據它們與MHC分子的功能親和力立即篩選多種(集合)可能的配體。與MHC分子的結合親和力也是旨在用作T細胞表位的配體的必要條件，儘管不是充分條件。也篩選適合的候選T細胞表位，並測定其T細胞激活能力。因此，根據本發明的結合篩選方法與適合的T細胞測定的組合提供了根據本發明分離T細胞表位的方法，其中利用MHC結合測定，能夠從可能的配體集合中鑑定這些T細胞表位。
在現有技術中，總是對具有已知結合/MHC特異性的配體進行這些測定，與之不同，根據本發明的方法提供這些測定法作為對含有未知特異性的配體的集合的篩查工具。在現有技術中，這些測定法一般對各個單配體進行，以檢測它們與MHC/HLA分子的結合親和力。Kwok等人(2001)利用最多可達5種重疊合成肽的集合產生MHC II類四聚體；然後用後者染色PBMC中對特定MHC II類肽複合物特異的T細胞，該複合物是在與5種肽的集合的結合反應中產生的。然而，由於敏感性和特異性的原因，不認為在這種方法中能夠增加每個集合的配體數量(Novak等人2001)。關於特異性的一個問題是，如果集合中存在一種以上的結合劑，則產生MHC四聚體，每個四聚體有一種以上的結合劑。這將排除T細胞染色，在現有技術所述的方法中後者可用於表位的鑑定。與它非常不同，根據本發明的方法允許從含有一種以上結合劑的高度複雜的混合物中鑑定一種以上的結合劑。
將要用本發明篩選的集合的性質並不重要該集合可含有任何天然或非天然存在的物質，它們a)特異結合MHC/HLA分子，和/或b)可被T細胞特異識別。該集合的這組配體與MHC分子的結合性質未知；因此，該集合中通常含有一種給定MHC分子的結合劑和至少一種非結合劑。因此該集合含有至少10種不同的配體。實際上，根據本發明使用含有明顯更多不同配體種的集合，例如20個或更多，100個或更多，1000個或更多，或者10000個或更多。也能夠篩查更大的文庫(例如含有106以上，108以上，乃至1010以上的不同配體種)。然而，這主要取決於這些配體文庫的可用性。
顯然，MHC肽複合物不是典型的受體-配體系統，至今仍未被視為合適的篩選工具的基礎。在體內，通常只存在MHC肽複合物，而沒有空MHC分子。一種肽與空MHC分子簡單結合不會產生MHC肽複合物，而是通過非常複雜的、但是仍未完全理解的所謂「抗原加工和呈遞」方法產生。這是一種高度組織化的細胞內方法，涉及多種酶(細胞溶質和溶酶體蛋白酶，轉運蛋白，侶伴蛋白，肽-交換因子等)。實際上眾所周知，不含配體的MHC分子是不穩定的，經歷快速降解。
因此，本發明的一個主要特徵是提供重組「空」MHC分子並使其能夠用來從集合中「捕獲」配體的生產、純化和反應條件的發展。現有技術中沒有例子證明類似的可能性。以上引用的Novak等人的參考文獻公開了一種生產(昆蟲細胞)和純化策略，用來獲得重組MHC分子，隨後與少數肽溫育，並四聚化。利用MHC四聚體染色來自個體的細胞，這些個體可能含有針對這些肽代表的抗原的T細胞，從而提供了該配體也是一種真正的T細胞表位的必要證據。然而，所述現有技術明確地表明，只有多達5種肽能夠成功使用。這與本方法非常不同，本方法可以成功使用每個集合10、21種、甚至幾百或幾千種肽。
根據本發明的方法使用的優選的配體集合選自肽集合，特別是重疊肽的集合，蛋白質片段的集合，糖脂的集合，鞘糖脂的集合，脂肽的集合，脂類的集合，聚糖的集合，修飾肽的集合，由抗原呈遞細胞獲得的集合，優選地是其總裂解物或級分的形式，特別是從這些細胞的表面或MHC/HLA分子上洗脫的級分，包含細胞片段(特別是病原體細胞、腫瘤細胞或組織)的集合，包含肽庫的集合，由重組DNA文庫產生的(聚)肽的集合，特別是來源於病原體或腫瘤細胞的，來自特定病原體的蛋白質和/或蛋白質片段的集合，或其混合物。
該集合的配體可能來自於天然來源(天然和/或衍生的形式)，也可能合成產生(例如通過化學合成或重組技術)。如果該集合中提供(聚)肽配體，優選地用肽合成儀或通過重組技術產生這些肽。根據一個優選實施方案，(聚)肽集合可由重組DNA文庫產生，例如來源於病原體或腫瘤細胞，通過體外翻譯(例如核糖體展示)或通過異種宿主如大腸桿菌等表達。
因此，配體優選的是肽，是能夠用作T細胞表位的抗原片段。這些肽優選地長於6個、特別是長於8個胺基酸，優選的最大長度為40、30、20、15乃至11或12個胺基酸。
能夠從中獲得這些肽的優選的病原體選自人類免疫缺陷病毒(HIV)，A型肝炎和B型肝炎病毒，C型肝炎病毒(HCV)，勞斯肉瘤病毒(RSV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，輪狀病毒，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)，沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，炭疽芽孢桿菌(Bacillus antracis)，霍亂弧菌(Vibrio cholerae)，瘧原蟲屬(Plasmodium)的種(惡性瘧原蟲(Pl.falciparum)、間日瘧原蟲(Pl.vivax)等)，麴黴屬(Aspergillus)的種或白色念珠菌(Candida albicans)。抗原也可以是癌細胞表達的分子(腫瘤抗原)。同樣也可以使用腫瘤抗原(癌症疫苗)或自身免疫抗原，為本發明提供適合的(肽)配體。
本方法所選擇的具體MHC分子(該術語當然也包括MHC樣分子)的性質也不重要。因此，這些分子原則上可選自任何種，特別是靈長類動物，如人(HLA，見下文)，黑猩猩，其它哺乳動物，例如maquaques、兔、貓、狗或齧齒動物，如小鼠、大鼠、豚鼠等，在農業上重要的動物，如牛、馬、綿羊和魚，但是為人類提供疫苗當然優選人(或「人源化」)分子。為了為具體動物，特別是農業上重要的動物，如牛、馬、綿羊和魚提供疫苗，優選使用這些動物特異的MHC分子。
因此優選的HLA分子含有I類分子，其來源於HLA-A、-B或-C基因座，具體的是A1、A2、A3、A24、A11、A23、A29、A30、A68；B7、B8、B15、B16、B27、B35、B40、B44、B46、B51、B52、B53；Cw3、Cw4、Cw6、Cw7；II類分子，來源於HLA-DP、-DQ或-DR基因座，具體的是DR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR11、DR12、DR13、DR51、DR52、DR53；DP2、DP3、DP4；DQ1、DQ3、DQ5、DQ6；和非傳統的MHC/HLA和MHC/HLA樣分子，它們能特異結合配體，特別是HLA-E、HLA-G、MICA、MICB、Qa1、Qa2、T10、T18、T22、M3和CD1家族的成員。
根據一個優選實施方案，根據本發明的方法的特徵在於該MHC/HLA分子選自HLAI類分子、HLAII類分子、非傳統的MHC/HLA和MHC/HLA樣分子或其混合物，或者它們的混合物。
優選地，使用一種方法進行複合物的配體的任選表徵步驟，該方法選自質譜法，多肽測序，結合測定，特別是SDS-穩定性測定，通過層析，特別是HPLC測定保留因子(retention factor)鑑定配體，或其它光譜技術，特別是紫外線(UV)、紅外線(IR)、核磁共振(NMR)、圓二色性(CD)或電子自旋共振(ESR)，或其組合。
根據一個優選實施方案，本發明的方法的特徵在於它與一種細胞因子分泌測定相組合，優選地與酶聯印跡(Elispot)測定、細胞內細胞因子染色、FACS或ELISA(酶聯免疫測定)(例如見《現代免疫學方法》)組合。
優選的T細胞測定法包括該複合物與分離的T細胞混合併溫育，然後測定該分離的T細胞的細胞因子分泌或增殖，和/或測定激活標記(特別是CD69、CD38)的上調，或表面標記(特別是CD3、CD8或TCR)的下調，和/或特別是通過實時RT-PCR測定與T細胞激活有關的mRNAs的上調/下調(參見，例如《現代免疫學方法》、《現代分子生物學方法》)。根據本發明的T細胞激活能力檢測(在此稱為「T細胞測定」)優選地也可以在小鼠中實現，具體地使用適當設計的人MHC/HLA設置(例如，在其基因組中整合有一種或多種人MHC/HLA分子)。
進一步優選的T細胞測定選自測定T細胞受體下遊成分(特別是p56lck、TCR的ITAMS和ζ鏈、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn)的磷酸化/去磷酸化的T細胞測定，測定細胞內Ca++濃度或Ca++-依賴的蛋白質激活的T細胞測定，測定免疫突觸形成的T細胞測定，測定效應分子(特別是穿孔素、粒酶或granulolysin)釋放的T細胞測定，或這些T細胞測定的組合(參見，例如，《現代免疫學方法》、《現代細胞生物學方法》)。
WO00/31542提出了鑑定只是來自腫瘤細胞的抗原的方法。抗原肽從位於半抗原修飾的惡性細胞表面的MHC-肽複合物中提取。然後能夠通過半抗原特異的親和層析分離半抗原化的肽，並測序。本發明的實施方案是，最初從位於腫瘤細胞表面的MHC分子中分離的肽具有刺激T細胞的性質。刺激是指添加細胞提取物引起的T細胞增殖，以及細胞因子(如INF-γ、TNF、IL-2等)的產生。根據分離的肽的序列，能夠鑑定抗原的來源。
儘管該方法的最終結果也是T細胞表位，但是該方法與本發明大大不同在現有技術中，從細胞系統中分離天然MHC肽複合物，在本發明中利用純化、重組的MHC分子從任何來源(細胞或合成的，天然或人工的)中分離配體；在現有技術中，隨後通過半抗原親和層析的分離需要表位的半抗原化，而本發明不依賴該步驟。
Tana等人(1998)描述了從根據MHC分子類型的已知結合基序設計的合成組合肽庫中篩選可被T細胞識別的抗原肽的方法。因此，與由209種所有可能的肽組成的「全面」文庫相比，將要篩選的肽的數量大大減少(～103)。這些肽在含有不同胺基酸的9種肽的混合物中在兩個固定位置處組合。然後檢測該混合物引發T細胞增殖反應。因此，該方法限於檢測適於結合這組MHC分子以及被TCR受體識別的胺基酸殘基。
Bitmansour等人(2001)稱，以前Kern等人(1999，2000)描述的矩陣方法已經用於CMV pp65蛋白內免疫顯性CD4+表位的鑑定。構建24個肽集合的矩陣，每個集合含有12種肽(15-mers，重疊11個胺基酸)(共138種肽)，代表整個pp65蛋白。首先，檢驗肽集合隨後檢驗各個肽引起特異T細胞應答的能力。該方法與其它方法(Maeker，2001；Tobery等人，2001)的不同在於，它依賴於不同的監測T細胞應答的技術，如流式細胞分析(表面INF-γ染色，CD4和CD69標記)和分子方法(CMV-特異的CD4+細胞的TCR-Vβ內容物的RT-PCR)。使用的技術被稱為細胞因子流式細胞分析，允許在抗原誘導的增殖或細胞死亡之前檢測CMV-特異的T細胞，因此當其在體內存在，不被長期體外培養改變時，該技術提供了測定CMV-特異T細胞的克隆型內容物的可能性。因此，在CMV血清陽性的健康受試者中發現了可能引起保護性CMV特異CD4+應答的兩種pp65表位(aa489-503和aa509-523)。
Tana等人和Bitmansour等人都描述了複雜的因此難以控制生物學細胞測定的方法，而本發明描述了特別是在可操作性和可重複性上現有技術根本無法比擬的直接生物化學分離。根據本發明使用「空」MHC/HLA分子使得所有使用與位於活細胞表面的MHC/HLA分子結合事件的複雜方法均已過時。
根據本發明分離T細胞表位的一種方法，其中配體集合與(「空」)MHC/HLA分子接觸(不依賴於細胞系統)，然後(優選地)用T細胞試驗檢測結合的配體的T細胞激活能力，因此該方法是一種全新的方法，特別是與描述的依賴細胞的測定相比。與「在矽片上的(insilicio)」方法相比，本發明也提供了可容易、快速處理的「真實世界」中的應用。
根據本發明的方法的實施和應用在關於一種具體病原體蛋白質——巨細胞病毒(CMV)的pp65的實施例部分得到證明。該實施例顯示了本發明的有效性和優點，並與現有技術方法進行了比較。
CMV是一種β皰疹病毒，是普通人群中非EB病毒(EBV)傳染性單核細胞增多症的主要原因，是無免疫應答的宿主中的一種重要病原體，包括感染人類免疫缺陷病毒(HIV)患獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)的患者、新生兒和移植受體(Drew等人，1999)。根據所調查的人群，不同地區CMV血清陽性的普及率為40-100％。至於其它皰疹病毒，最初是CMV感染，隨後是持續感染；在某些情況下也發生再感染和重複感染(Britt，1999)，然而，由於預先存在免疫，免疫活性宿主大多數沒有病理結果(Plotkin等人，1999)。CMV在人體中引起緩慢、持續的感染。這在免疫活性宿主中得到控制，但是決不會消除。其中(例如免疫抑制基因的活性表達，它幹擾抗原的加工和呈遞)，兩個因素似乎有助於持續逃脫免疫監視一方面，免疫特權(immunopriviliged)部位如唾液腺上皮中的複製，和CD33+單核細胞中潛在貯存庫(reservoir)的形成。這些巨噬細胞前體不支持CMV的複製，因此停止，直到細胞分化為巨噬細胞。只有在分化後，細胞環境才似乎允許裂解性感染。免疫活性個體中90％的初次感染在臨床上未被識別(Nichols等人，2000)，發展為長期免疫，控制病毒的持久性，雖然不是滅菌，但是是保護性的。
以下幾組具有感染/再激活的高度危險，他們具有發展為CMV疾病的高度危險a)血清陰性妊娠婦女的胎兒，b)血清陰性的移植患者，因為難以發現CMV陰性移植物，c)血清陽性的移植和HIV患者，因為它們誘導或獲得的免疫缺陷允許CMV從潛伏期再激活。
先天CMV感染可能導致耳聾，更重要的是，象普通遺傳症候群三體21和脆性X染色體一樣頻繁的引起智力低下的原因。根據FowlerKB，Stagno S，Pass RF等人(Fowler等人，1992)的研究能夠推斷，每年約有9000名歐洲和8000名美洲嬰兒(在美國每500名新生嬰兒有一個)由於子宮內CMV感染受到傷害，其中只有10％在出生時臨床上明顯。儘管先天CMV感染在出生時大部分沉默，但是它在臨床後遺症和公共衛生影響方面的累積作用較大(Plotkin等人，1999)。與較差的結果最密切相關的因素是妊娠期間的初次母親感染，這在血清陰性的母親中不易預防，因為密切的人-人接觸使病毒容易擴散，血清陽性的幼兒大量釋放病毒(Field等人，1999)。在無免疫應答成人中，疾病在實體器官移植(SOT)患者和異體造血幹細胞移植(HCT)患者以及HIV感染個體中最常見。在異體HCT患者中，大約15％的患者中仍然發生嚴重CMV疾病，死亡率約為50％。與HCT中的CMV疾病有關的危險因素是CMV陽性移植物供體和未感染的移植物受體、伴隨的細菌感染、暴髮型肝炎和移植物抗宿主疾病。對於SOT，如腎臟、肝臟、心臟、肺或胰的SOT，CMV疾病與移植物和患者存活率的降低有關。CMV本身引起多種傳染性疾病症候群。CMV疾病的後果在所有移植患者中相似，儘管具體的器官累及通常對應於移植的器官。肝臟、胰、肺、腸和心臟移植受體通常比腎移植受體有較高的CMV疾病發病率。未接受抗病毒預防的大約39-41％的心臟-肺、9-35％的心臟、22-29％的肝臟和胰、8-32％的腎移植受體發生有症狀的感染。而且，CMV感染與免疫抑制狀態增強有關，可以解釋移植患者頻發的機會性重複感染。此外，這似乎與同種異體移植功能障礙有關，間接與患者存活率降低以及成本增加、住院時間延長有關(Sia等人，2000)。對於後三點，一方面CMV可能與心臟移植後CMV感染患者中發現的進展性冠狀動脈粥樣硬化症有關(Van Son等人，1999和Field等人，1999)，另一方面與CMV/EBV雙陽性移植患者中EB病毒(EBV)相關移植後淋巴組織增生性疾病的危險增加有關(Sia等人，2000)。CMV視網膜炎是AIDS患者中最常見的疾病表現之一，已經報告在大約30％的患者中發生，使患者面臨失明的威脅。最近的證據表明，AIDS患者中CD4+淋巴細胞的損失與CMV疾病的發展有關，因此使用HIV蛋白酶抑制劑和高活性抗逆轉錄病毒治療(HART)，CMV視網膜炎的發病率顯著降低(Field等人，1999)。然而，CMV疾病在HAART開始4個月之內仍然發生，儘管HIV複製被充分抑制。此外，抗逆轉錄病毒治療的失敗是正在出現的一個問題(Nichols等人，2000)。
最近十年，利用抗病毒化學治療預防和治療CMV感染已經取得了相當大的進展。目前美國已經批准了5種藥物用於CMV的治療更昔洛韋(Cytovene，用作靜脈內和口服製劑時，或者Vitrasert，用作玻璃體內植物製劑時)、膦甲酸(膦甲酸鈉)、Cidofovir(Vistide)和Fomivirsen(Vitravene)。更昔洛韋和Cidofovir的三磷酸酯相當物(前者需要病毒和細胞酶磷酸化，後者只需要細胞酶磷酸化)是對於病毒DNA聚合酶的脫氧核糖核苷酸三磷酸的競爭性抑制劑，而焦磷酸鹽類似物膦甲酸阻斷該酶的焦磷酸鹽結合部位。Fomivirsen是獲得FDA批准的第一個反義設計的寡核苷酸。然而，Fomivirsen的作用機制還未完全證實，除了反義之外可能還有許多成分(Field等人，1999)。由於固有的高毒性、晚期CMV疾病的高發病率和普遍預防的高成本，抗病毒治療的先發制人(preemptive)策略是基於對具有發展CMV疾病的高危險的患者的選擇性治療，這是根據HCT後再激活的CMV的早期檢測(Zaia等人，2000)。在SOT患者中，預防策略在移植物供體CMV載體和未感染的移植物受體的設置中特別有吸引力。施用三個月Valganciclovir，口服生物利用性顯著提高的活性藥物的纈氨酸酯，顯著減少腎移植患者中CMV疾病的發病率。而且，移植後6個月活組織檢查證明排斥的患者的比例也顯著減少。然而，特別是用可以獲得的口服製劑長期預防，這種治療形式比常規靜脈內製劑更方便患者，也可提高耐藥性的發生率(Nichols等人，2000)。已經觀察到對更昔洛韋、Cidofuvir和膦甲酸的多藥耐藥性，這都是由於病毒DNA聚合酶的改變引起的(Field等人，1999)。Fomivirsen似乎對這些突變體有效(Nichols等人，2000)，但是由於除了反義作用模式之外的可能的抗病毒活性(Field等人，1999)，Fomivirsen耐藥株似乎可能出現。
因此，焦點集中於移植後CMV特異性免疫的(重)構建，這也可防止對血清陰性母親的嬰兒的損傷。這涉及到一個問題，免疫活性宿主如何控制CMV感染，以便了解非免疫活性宿主中什麼是恢復必需的。匯集的數據證明，CMV抗體通過減少病毒血症(無細胞病毒的傳播)是部分保護性的，但是在HCT患者中無效，在單核細胞群體內，使用抗體不能破壞的貯存庫(reservoir)，病毒持續與細胞結合(Plotkin等人，1999)。這強烈地要求發展恢復CD8+和CD4+T細胞應答的疫苗。通過在移植後早期過繼轉移這些細胞，最終能夠建立CMV特異的alphabeta/T細胞的保護功能。在I期研究中，在過繼轉移的CD8+CMV特異的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的受體中，與免疫活性骨髓供體相當的細胞溶解反應在第4次輸注後立即達到。然而，在不能恢復內源CD4+CMV特異的T輔助反應的患者亞組中，它們在隨後的幾周下降，這強調了同時產生CD8+和CD4+T細胞應答的重要性(Zaia等人，2000)。正常CMV血清陽性個體中極高頻率的特異性CD4+記憶細胞(總CD4+T細胞的約2.0％)也提示CMV對照中CD4+T細胞的可能的重要性(Waldrop等人，1998)。HIV感染中CD4+T細胞缺陷程度與CMV疾病的密切相關性也被認為與CD4+T細胞在控制CMV再激活中的重要作用相一致(Komanduri等人，1998)。已經描述了5種普通類型的CMV相關疫苗減毒活病毒疫苗、重組活病毒疫苗、DNA疫苗、全蛋白質疫苗和肽疫苗。在二十世紀七十年代發展並在腎移植患者和分娩當年的婦女中測試了一種減毒活病毒疫苗，「Towne株」。儘管該疫苗顯示免疫原性，但是在移植群體中使用活病毒仍具有潛在的危險。較低程度上這也適用於在人體中複製能力有限的重組痘病毒(禽痘)。在動物模型中顯示前途的方法包括導入編碼免疫原性蛋白質的DNA載體，作為引發TCL的工具。DNA疫苗技術的改進，包括使用最低細胞毒性和輔助T細胞表位作為免疫原，可產生更加有效的疫苗(Zaia等人，2000)。
總之，抗病毒藥物的副作用和高成本，上述用於CMV疫苗的方法的有限應用範圍/成功，和過繼轉移的T細胞克隆的良好效能，突出了發現新MHC I類和II類限制性T細胞表位的重要性。這些表位應當被最普遍的HLA分子呈遞，因此使大多數群體具有保護性，與個體HLA設置無關。CMV是已知的具有最高蛋白質編碼能力的病毒之一，含有170-200個開放閱讀框(Reddehase，2000)。然而，對顯然成功控制病毒的無症狀供體的T細胞應答的分析顯示CMV pp65、pp150、IE-1和gB的免疫顯性(Zaia等人，2000)。這可能是因為幾種免疫抑制基因的表達，幹擾了加載肽的MHC I類和II類分子的形成和釋放(egress)。顯著地，MHC I類分子的下調似乎很少幹擾CMVpp65或pp150-特異的CTL對CMV感染的細胞的識別。在病毒進入後的極早期，這兩種結構蛋白被輸送到細胞質中，這能夠用下列事實解釋在免疫抑制病毒基因表達之前，這些結構蛋白能夠加工並呈遞。然而，在較後期，當MHC水平已經降低時，CMV pp65或pp150特異的CTL也能有效地識別感染的細胞。這似乎是由於宿主的逆向逃避(counter evasion)策略。在CMV感染後，一種細胞基因被誘導，甚至在靶細胞只表達低肽/MHC密度時，它也與T細胞上的一種受體結合，促進T細胞激活(Zaia等人，2000)。另一方面，有跡象表明，pp65幹擾IE-1的呈遞，IE-1是隨後所有免疫抑制基因產物的激活劑(Reddehase，2000)，這能夠解釋pp65抗原的免疫顯性。因此，pp65特異的T細胞能夠在複製周期的所有階段裂解病毒感染的細胞，可能是在體內去除感染的細胞所必需的(Zaia等人，2000)。
根據另一方面，本發明也提供可以利用根據本發明的方法鑑定的T細胞表位，該T細胞表位選自含有序列KMQVIGDQYVK、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA的多肽或其組合。
本發明也提供具有T細胞激活能力的HLA A0201結合表位，該表位可以利用HLA A0201分子作為MHC/HLA分子，通過根據本發明的方法鑑定，該HLAA0201結合表位選自含有序列RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLESFCEDV的多肽或其組合。儘管已知這些序列可結合HLA A0201，但是本發明提供了它們激活T細胞的可用性。
本發明進一步提供含有序列RPHERNGFTV的肽在製備用於在B7陰性個體中激活T細胞的組合物中的用途。
另外，本發明也提供含有序列DDVWTSGSDSDE的肽在製備用於在B35陰性個體中激活T細胞的組合物中的用途。
而且，本發明也提供含有序列TPRVTGGGAM的肽在製備用於在B7陰性個體中激活T細胞的組合物中的用途。
儘管已經描述這些序列具有特異HLA限制(RPHERNGFTVB7，DDVWTSGSDSDEB35，TPRVTGGGAMB7)，但是令人吃驚的是這些序列具有不同於已知限制的特異性(RPHERNGFTV非B7，DDVWTSGSDSDE非B35，TPRVTGGGAM非B7)。這使得這些序列的有效性能夠擴展，例如通過使這些序列作為合適的疫苗，可用於表達不同於描述的其它HLA的個體。
本發明進一步提供可與II類HLA分子結合的肽，選自根據實施例部分的表3肽55-64、109、383、384、421、449-454、469和470。
優選地，根據本發明的表位或肽在N端、C端或N端和C端還含有1-30個、優選地2-10個、特別是2-6個天然存在的胺基酸殘基。對於本發明，術語「天然存在的」胺基酸殘基涉及在天然存在的蛋白質中，在相對於表位或肽的特定位置處存在的胺基酸殘基。例如，對於「AMAGASTSA」表位，在N端天然存在的胺基酸殘基是Gly；在C端天然存在的3個胺基酸殘基是Gly-Arg-Lys。因此，「非天然存在的」胺基酸殘基是與相對於表位或肽的特定位置處的胺基酸殘基不同的任何胺基酸殘基。
根據本發明的一個優選實施方案，該表位或肽還含有非天然存在的胺基酸，優選地1-1000個，更優選地2-100個，特別是2-20個非天然存在的胺基酸殘基，特別是在N端、C端或在N端和C端。在具體優選實施方案中，非天然和天然存在的胺基酸殘基的組合也是可能的。該表位也可含有修飾的胺基酸(即不同於20種「標準」胺基酸的胺基酸殘基，如D-胺基酸或Cys的S-S結合)作為另外的胺基酸殘基或代替天然存在的胺基酸殘基。
顯然，通過可提高、保持或至少不顯著阻礙表位的T細胞激活能力的胺基酸交換，由該表位或肽衍生的表位或肽，也包括於根據本發明的表位或肽中。因此，該表位或肽也包括不含如來源於CMV pp65的原始序列，但是觸發相同或者優選地提高的T細胞應答的表位或肽。這些表位被稱為「不規則的(heteroclitic)」。包括能夠觸發與原始表位相同的T細胞，優選地在體內或者也在體外具有更強的T細胞激活能力的任何表位。
不規則的表位能夠通過合理設計獲得，即考慮各個殘基對結合MHC/HLA的作用，如Ramensee等人1999或Sturniolo等人1999所述，結合可能與TCR相互作用的殘基的系統交換，用針對原始表位的T細胞檢測產生的序列。本領域技術人員不需要更多實驗即能夠使用這種設計。
另一種可能性包括用針對原始表位的T細胞篩查肽庫。一種優選的方法是合成肽庫的位置掃描。例如，Blake等人1996和Hemmer等人1999以及此處的參考文獻已經詳細描述了這些方法。
作為同源CMV pp65衍生的胺基酸序列代表的表位或不規則表位的備選，也能夠使用模擬這些表位的物質，例如「擬肽」或「retro-inverso-肽」。
設計改進的表位的另一方面是它們與可提高它們刺激T細胞的能力的物質配製或修飾。包括T輔助細胞表位、脂類或脂質體或優選的修飾，如WO01/78767所述。
提高表位的T細胞刺激能力的另一種方法是與免疫刺激物質一起配製，例如細胞因子或趨化因子，如白介素-2、-7、-12、-18，I類和II類幹擾素(IFN)，特別是IFN-γ，GM-CSF，TNF-α，flt3-配體等。
根據另一方面，本發明涉及根據本發明的表位或肽在製備用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的HLA限制的疫苗中的用途。
本發明也包括含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV和/或KYQEFFWDA的表位在製備用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的疫苗中的用途。
因此，本發明也包括一種用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的疫苗，它包含含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV和/或KYQEFFWDA的表位。而且，用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的HLA特異的疫苗，其包含根據本發明的表位或肽，也是本發明的一個方面。編碼根據本發明的肽的相應核酸的用途，例如用作DNA疫苗，也屬於本發明的範圍，至少是要求保護的肽疫苗的相當物。
Parker等人(1994)描述了根據個別肽結合的實驗數據預測肽與MHC I類分子結合的方法。通過監測肽促進β2-微球蛋白(β2m)摻入HLA-A2/β2m/肽雜二聚複合物中的能力間接評價肽結合能力。實驗數據(測定的β2m的分解速度)允許產生相應的係數值，然後用來計算與HLA-A2分子的複合物中對任何九肽的理論結合穩定性。在該研究中，第一次顯示CMV pp65衍生的肽序列RLLQTGIHV能夠穩定HLA-A2/β32m/肽複合物。
Morgan等人(1998)描述了測定肽與純化HLA分子的結合親和力的方法，也是根據間接測定β2m向HLA/肽複合物中的摻入。在該研究中，RLLQTGIHV肽的體外結合已經得到證明，並測定它與HLA-A2分子的相對結合親和力(結合及解離常數)。
儘管Parker等人和Morgan等人證實了與HLA-A2的結合，但是缺乏證明該配體也是一種真正的T細胞表位的最終證據，而在本發明中，通過幹擾素-γ酶聯印跡證實，RLLQTGIHV不僅能結合HLA-A2，而且只能誘導功能性T細胞。這不是一個沒有價值的發現在該領域眾所周知，以高親和力結合的多種配體不是T細胞靶標，因為例如通過上述「抗原加工和呈遞途徑」它們不會產生或者不會高效產生。因此，RLLQTGIHV的HLA A0201結合活性不僅令人吃驚，而且也可選擇用於例如為某些等位基因群體具體設計的疫苗。
優選地，根據本發明的這種疫苗還含有一種免疫調節物，優選地選自聚陽離子物質，特別是聚陽離子多肽，免疫調節核酸，特別是含有寡脫氧核苷酸的脫氧肌苷和/或脫氧尿苷，或其混合物。
優選地，該疫苗還含有一種聚陽離子聚合物，優選地一種聚陽離子肽，特別是聚精氨酸、聚賴氨酸或抗微生物肽。
根據本發明使用的聚陽離子化合物可以是顯示根據WO97/30721的特徵的任何聚陽離子化合物。優選的聚陽離子化合物選自鹼性多肽、有機聚陽離子、鹼性聚胺基酸或其混合物。這些聚胺基酸的鏈長應當至少為4個胺基酸殘基。特別優選的是含有肽結合的物質，如聚賴氨酸、聚精氨酸和含有8個以上、特別是20個以上胺基酸殘基且含有20％以上、特別是50％以上鹼性胺基酸的多肽，或其混合物。其它優選的聚陽離子及其藥物組合物在WO97/30721(例如聚聚乙烯亞胺)和WO99/38528中描述。優選地，這些多肽含有20-500個胺基酸殘基，特別是30-200個殘基。
這些聚陽離子化合物可以化學產生或重組產生，或者可以來自於天然來源。
陽離子(多)肽也可以是聚陽離子抗細菌微生物肽。這些(多)肽可以是原核或動物或植物來源的，或者可以化學產生或重組產生。這些肽也可能屬於防衛素類。這些宿主防禦肽或防衛素也是根據本發明的聚陽離子聚合物的一種優選形式。可以作為終產物激活(或者下調)適應性免疫系統、優選地被APC(包括樹突細胞)介導的化合物，用作聚陽離子聚合物。
本發明特別優選的用作聚陽離子物質的是cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000，在此引用作為參考)，特別是來源於哺乳動物cathelicidin的抗微生物肽，優選地來源於人、牛或小鼠，或神經活性化合物，如(人)生長激素(如WO01/24822所述)。
來自於天然來源的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的陽離子肽，觸角(antennapedia)肽，脫乙醯殼多糖或殼多糖的其它衍生物)或通過生物化學或重組生產由這些肽或蛋白質衍生的其它肽。其它優選的聚陽離子化合物有cathelin或者與cathelin有關的或其衍生的物質，特別是小鼠、牛或人cathelins，和/或cathelicidin。有關或衍生的cathelin物質含有全部或部分cathelin序列，至少含有15-20個胺基酸殘基。衍生可包括天然胺基酸被置換或修飾為不屬於20種標準胺基酸的胺基酸。而且，也可以向這些cathelin分子中引入其它陽離子殘基。這些cathelin分子優選地與根據本發明的抗原/疫苗組合物組合。然而，在不添加其它佐劑的情況下，這些cathelin分子作為抗原的一種佐劑也令人吃驚地有效。因此，在使用或不使用其它免疫激活物的情況下，在疫苗製劑中使用這些cathelin分子作為有效佐劑是可能的。
根據本發明使用的另外一種優選聚陽離子物質是一種合成肽，它含有至少2個KLK-基序，被一個3-7個疏水胺基酸的接頭隔開，特別是L(例如KIKL5KLK；PCT/EP01/12041，在此引用作為參考)。
根據本發明使用的免疫調節(或免疫原性)核酸可以是合成的、原核或真核來源的。對於原核來源，根據系統進化樹，DNA應當來源於發育較低的種(例如昆蟲等)。在本發明的一個優選實施方案中，免疫原性寡脫氧核苷酸(ODN)是一種合成產生的DNA分子或這些分子的混合物。也包括ODN的衍生物或修飾，如硫代磷酸酯取代的類似物(硫代磷酸殘基代替磷酸)，如美國專利號US 5,723,335和US 5,663,153所述，以及優選地穩定免疫刺激組合物但不改變其免疫性質的其它衍生物和修飾。一種優選的序列基序是一個6鹼基的DNA基序，它含有一個(非甲基化)CpG二核苷酸，側翼為兩個5′嘌呤和兩個3′嘧啶(5′-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3′)。根據本發明的ODN中所含的CpG基序在微生物中比在高等脊椎動物DNA中更常見，在甲基化模式上顯示差異。令人吃驚的是，刺激小鼠APC的序列對於人細胞不是非常有效。根據本發明使用的優選的回文或非回文ODN例如在澳大利亞專利申請A 1973/2000、A 805/2001、EP 0 468 520 A2、WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/37919、WO98/40100、WO98/52581、WO98/52962、WO99/51259和WO99/56755中公開，均在此引用作為參考。除了刺激免疫系統之外，某些ODN也中和某些免疫應答。本發明也包括這些序列，例如用於自身免疫病的治療。ODNs/DNAs可以化學產生或重組產生，或者來自於天然來源。優選的天然來源是昆蟲。
此外，基於肌苷和胞苷的核酸(例如PCT/EP01/06437所述)或含有脫氧肌苷和/或脫氧尿苷殘基的脫氧核酸(澳大利亞專利申請A1973/2000和A805/2001描述，在此引用作為參考)也可以優選地作為免疫刺激核酸用於本發明。
當然，根據本發明也可以使用不同免疫原性核酸的混合物。
優選地，該疫苗還含有一種藥學可接受的載體。
根據另一個優選實施方案，該疫苗含有以選自下列的形式提供的表位或肽肽、肽類似物、蛋白質、裸DNA、RNA、病毒載體、病毒樣顆粒、重組/嵌合病毒、重組細菌或用蛋白質/肽/RNA脈衝或用含有該表位或肽的DNA轉染的樹突細胞。
根據另一方面，本發明涉及T細胞、T細胞克隆或T細胞群體(製品)，特別是能夠識別根據本發明的任何表位或肽，尤其是如上所述的CMV表位。這些T細胞的一種優選用途是它們的體外表達和例如通過過繼轉移對患者的治療用途。因此，本發明也提供T細胞、T細胞克隆或T細胞群體(製品)在製備用於治療CMV患者的組合物中的用途。
根據本發明的這些T細胞(克隆或系)，特別是可以識別上述CMV肽的T細胞，也可用於鑑定不規則表位，不規則表位不同於最初鑑定的表位，但是引發相同的T細胞。
根據本發明的這些細胞、組合物或疫苗以有效的量對個體施用。
本發明將通過下列實施例和附圖更詳細地說明，但是不限於此。
圖1顯示肽與可溶性DR4分子的結合親和力；圖2顯示能夠結合空DR4分子的肽的鑑定(A.HLA-肽複合物的純化；B.結合的肽的MS分析)；圖3顯示在過量的低親和力肽存在下，高親和力肽與DR4分子的結合；圖4顯示個別肽和肽混合物與DR4分子的結合；圖5顯示使用(5a)分離的CD4+T細胞和DR0401分子(用抗CD28共刺激)，使用(5b)分離的CD8+T細胞和HLAA0201分子(用抗CD28mab共刺激)的酶聯印跡；圖6顯示CMV pp65肽集合陣列；圖7顯示(7a)來源於pp65蛋白的肽集合與DR4分子的結合，(7b)單個pp65肽與DR4分子的結合；圖8顯示用肽混合物(每個含有21種肽，供體#10736 HLA A2/3，HLA B15/35；8a)進行的第一次篩查，和用肽混合物(每個含有21種肽，供體#10687 HLA A2/11，HLA B7/13；8b)進行的第一次篩查；圖9顯示用單個肽(供體#10736 HLA A2/3，HLAB15/35)進行的第二次篩查；圖10顯示來自受試者10788的PBMC，用於使用CMVpp6515mers 57、59和對照(med不含肽，HIV無關HIV衍生肽，ConA多克隆刺激)的IFN-γELIspot；
圖11顯示通過細胞內IFN-γ染色證實針對CMVpp65 15mers 469、470的同時的CD4+和CD8+T細胞應答；圖12顯示利用IFN-γ酶聯印跡測定，在轉基因小鼠中用重疊的15mers對DRB1*0401表位的作圖最後一次接種一周後，取出脾臟，用有關的肽(編號1500-1505)來自體內地激活細胞，重疊的15mers代表這些較長的肽和無關的流感血凝素衍生肽(編號1171)，用來測定產生IFN-γ的特定細胞(減去培養基對照)。
實施例實施例概述這些實施例顯示本發明對具體病原體蛋白CMV的pp65的實施。
第一部分應用根據本發明的方法，該方法基於使用「空HLA分子」。這些分子與可能的CMV衍生肽配體混合物一起溫育，篩查特異性結合事件。分離這樣形成的複合物，用於鑑定特異結合的配體。使用高度複雜的混合物的可能性允許從幾百乃至幾千種可能的配體中極快地鑑定出少數結合劑。使用HLA-DRB1*0401和重疊15-mers的集合證實了這一點。
然而，I類分子和適當長度(即8-11-mers)的肽能夠使用相同的方法。配體集合可以是合成的重疊肽。另一種可能性是酶或非酶消化所述抗原。後者通過鹼水解實現，產生所有可能的降解產物，已經成功地用於鑑定T細胞表位(Gavin 1993)。酶消化能夠用蛋白酶進行。一個合理的方法是進一步使用參與天然抗原加工途徑的蛋白酶，如用於I類限制的表位的蛋白酶體(Heemels 1995)，或者用於II類限制的表位的組織蛋白酶(Villadangos 2000)。配體集合也可能由天然存在的配體組成，這些配體例如通過攜帶各自表位的細胞的裂解或洗脫獲得。就此而言，重要地指出，也能夠使用非肽配體，例如糖脂。眾所周知，可能由MHC(例如HLA-G、HLA-E、MICA、MICB)編碼或MHC之外(例如CD1家族)的非傳統的I類分子，能夠為淋巴細胞呈遞多種非肽配體(Kronenberg 1999)。使用重組「空」非傳統I類分子將允許結合劑的結合反應以及用與此處所述相似的方法鑑定。
在快速鑑定能夠結合HLA分子的配體後，根據本發明的加工也提供了直接表徵針對這些結合劑的特異T細胞應答的方法。一個可能性是在所謂的「合成T細胞測定」中直接使用分離的HLA配體複合物。後者包括HLA配體複合物對T細胞的抗原特異性再刺激，以及提供共刺激如激活抗體激活CD28的第二個信號。如實施例II所證實的，該測定能夠以酶聯免疫印跡讀數進行。
在此，選擇合成CMV pp65作為一系列重疊的15mer肽，每個肽的15個胺基酸中的14個與其前體重疊。這些肽作為21種單個肽的集合提供，它們的構建使得每一種肽恰好在2個集合中出現。矩陣形式的肽集合陣列能夠確定單個肽為行和列混合物的交叉點(圖6)。選擇10名表達MHC I類分子A2的CMV血清陽性的健康血液供體作為供體。由於已知pp65抗原被攜帶該MHC分子的供體特異識別，推斷出這種MHC偏性(Saulquin等人，2000；Kern等人，2000)。
平行地使用來自CMV血清陽性個體的外周血單核細胞(PBMC)(在SDS-穩定性測定中與可溶性重組HLA II類分子結合)通過幹擾素-γ(IFN-γ)酶聯免疫印跡測定篩選相同的肽(集合)。這兩種方法都產生表位，儘管選擇HLA沒有偏向(T細胞測定方法選擇I類HLA-A2，肽結合方法選擇II類HLA-DR4)顯示一定程度的重疊。
材料與方法肽用Syro II合成儀(Multisyntech，Witten，Germany)合成547種15個胺基酸殘基(15mer)的肽，它們有14個胺基酸重疊，代表CMV pp65抗原的完整序列。利用標準F-moc化學法平行製備288種肽。
每種肽均以～10mg/ml的濃度溶解於100％DMSO中。來源於pp65的42種肽集合的貯存液在100％DMSO中製備，每種肽的終濃度均為0.45mg/ml。
其它肽用標準F-moc化學方法在Syro II合成儀或ABI 433A合成儀(Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)上合成，利用C18柱(來自YMC的ODS ACU或來自Vydac的218TP)通過RP-HPLC(Biocut700E，Applied Biosystems，Langen，Germany)純化。每種肽的純度和身份用Reflex III質譜儀(Bruker，Bremen，Germany)通過MALDI-TOF表徵。
肽結合測定可溶性HLA I類A*0201和HLA II類DRA1*0101/DRB1*0101/Ii、DRA1*0101/DRB1*0401/Ii和DRA1*0101/DRB1*0404/Ii分子在SC-2細胞中表達，如Aichinger等人，1997所述純化。
在肽結合反應中，使用濃度為0.5μM的HLA分子，如果沒有提出不同，每種單肽以10倍摩爾過量(5μM)加入。結合反應中DMSO的濃度不超過4％。在蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和0.1％辛基-b-D-葡糖吡喃糖苷(Sigma)存在下，該反應在PBS緩衝液(pH7.4)中進行，室溫下48小時。
肽的結合通過SDS-穩定性測定法評價(Gorga等人，1987)三聚體HLA II類ab-肽複合物耐受SDS，因此在SDS-PAGE Western印跡分析中以～60kDa的帶出現。中親和力到高親和力的肽結合不能穩定的單個HLA II類α和β鏈分別作為～35kDa和～30kDa的帶遷移。
簡言之，HLA-肽複合物用1％SDS在室溫下處理，通過20mA的SDS-PAGE電泳在室溫下分析約2.5小時。通過電印跡將蛋白質轉移到PVDF膜上，用抗-a-鏈TAL.1B5α或/和β-鏈MEM136抗體染色。為了檢測Western印跡信號，使用ECL溶液(Amersham)。
與DRB1*0701和DRB1*1101的結合親和力通過肽競爭測定法檢測(Reay等人，1992)。簡言之，生物素化的CLIP肽(參照肽)的結合用於監測HLA肽複合物的形成。向結合反應中加入的與CLIP肽等摩爾濃度的檢測肽當其親和力高於CLIP的親和力時能夠競爭CLIP，或者當其親和力等於CLIP的親和力時抑制50％的結合。對於較低親和力的肽，它們應當過量加入參照肽中，以競爭佔據HLA結合的溝槽。參照肽結合50％抑制(IC50)所需的競爭肽的濃度值能夠用來估計肽結合的親和力。此外，在存在或不存在競爭肽的情況下，比較與HLA分子結合的參照肽的量，能夠測定目的肽的結合活性。
在該肽-競爭測定中，肽結合的條件與以上所述相似。可溶性HLA分子以0.5μM的濃度使用，生物素化的CLIP以2μM的終濃度加入所有樣品中。以三個不同濃度加入競爭肽0.25、5、100μM。結合反應在PBS緩衝液(pH7.4)中進行，37℃18小時。與可溶性HLA分子結合的生物素化CLIPm的量通過ELISA測定。簡言之，MaxiSorb 96孔板(Nunc，Denmark)用小鼠抗αβ抗體L243(從ATCC HB-55中純化)包被，方法是與50μl10μg/ml PBS稀釋液4℃溫育過夜。與塑料的非特異性結合通過與含有3％BSA的T-PBS在37℃下溫育2小時阻斷，結合反應然後在室溫下「捕獲」2小時。用T-PBS充分洗板後，使用鹼性磷酸酶-鏈黴親和素偶聯物(Dako)和Sigma 104磷酸酶底物(SigmaDiagnostics，USA)以比色法檢測HLA結合的肽複合物。405nm的光密度用微孔板讀板器SUNRISE(Tecan)測量。
來自HLA-肽複合物的肽的鑑定在肽與可溶性HLA分子的結合反應後，在Superdex-200柱(AKTAdesign，Amersham Pharmacia Biotech)上通過凝膠過濾層析使HLA-肽複合物與游離肽分離。收集含有HLA的級分，通過加入TFA至終濃度為1％，由複合物重建結合的肽。這些肽通過Ziptip純化脫鹽，並通過MALDI-TOF質譜法分析。
合成酶聯免疫印跡測定來自Millipore的96孔過濾板(目錄號MAHA S4510)用1μg/孔來自Bender Med Systems的抗人IFN-γmab B140和0.5μg/孔來自Qiagen的QIAexpress五His抗體的混合物包被，4℃過夜。作為CD8+T細胞的生存力和細胞因子產生的陽性對照，有些孔用抗CD3抗體包被，克隆MEM-57，來自V.Horejsi，Institute of Molecular Genetics，Prag。
用PBS(來自GIBCOBRL，目錄號14190-094)洗板2次，用下列ELISPOT培養基封閉來自GIBCOBRL的RPMI 1640(目錄號31870-025)，補充有1mM來自GIBCOBRL的丙酮酸鈉(目錄號11360-039)、2mM來自GIBCOBRL的L-穀氨醯胺(目錄號25030-024)、0.1mM來自GIBCOBRL的非必需胺基酸(目錄號11140-035)、50μg/ml來自 GIBCOBRL的慶大黴素(目錄號15710-049)、50μM來自GIBCOBRL的2-巰基乙醇(目錄號31350-010)和10％來自BioWhittaker的人AB型血清(目錄號14-490E)，37℃30分鐘。
在除去封閉培養基後，孔與可溶性HLA DRB1*0401溫育，37℃5小時，後者加載來自結核分枝桿菌的肽1242，來自流感血凝素的肽1171(HA-pepaa 306-318)，或者對於陰性對照，加載來自C型肝炎病毒的肽84(HCV-pepNS3 aa 1248-1261)，用ELISPOT培養基稀釋為100μg/ml(10μg/孔)(圖5a)。對於圖5b，使用可溶性HLA A*0201分子，其中加載來源於EBV抗原的肽BMLF1 aa 280-88，來源於流感基質蛋白的肽21，aa 58-66，或者對於陰性對照，加載來源於HIV逆轉錄酶的肽90，aa 476-484。分子的加載基本如段落「肽結合測定」所述進行。
具有匹配的HLA表型、接種BCG、HIV和HCV陰性的健康供體的外周血單核細胞(PBMC)用Leuco Sep試管(來自Greiner)在Lymphoprep(來自Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)上分離，用PBS(來自GIBCOBRL，目錄號14190-094)洗滌3次。
利用MACS技術(Miltenyi，Germany)，按照廠商說明，從PBMC中分離CD4+T細胞(圖5a)或CD8+T細胞(圖5b)。分離的T細胞重懸浮於含有10μg/ml抗CD28單克隆抗體(克隆37407.111，mab 342，來自RD systems)的ELISPOT培養基中，濃度為1Mio/ml。
棄去含有可溶性HLA(sHLA)分子的溶液，將分離的T細胞接種到孔中。向各自的樣品中再添加5μM(圖5a)或10μg/ml(圖5b)相應的肽。
細胞與sHLA分子共培養20小時。通過除去內容物並用洗滌緩衝液(PBS；0.1％Tween 20，來自SIGMA)洗滌6次，停止測定。然後，加入100μl1∶10000稀釋的生物素化抗人IFN-γmab(B308-BT2，來自BMS)，相當於0.015μg/孔，37℃溫育2小時，或者4℃過夜。洗滌後，以1.2μg/ml加入來自DAKO的鏈黴親和素-ALP(目錄號D0396)，37℃1小時。加入100μl/孔來自SIGMA的BCIP/NBT鹼性磷酸酶底物(目錄號B-5655)，使該測定顯色。
用Elispot讀數器(Bioreader 2000，來自Biosys，Germany)計數大小為直徑130μm到2000μm的斑點。由陰性對照樣品(HCV或HIV肽)推斷自發誘導的IFN-γ斑點的平均數量。超過平均自發IFN-γ釋放的每個應答，其中該值加上陰性對照樣品標準差的2倍，被認為是顯著的。
為了篩選9名CMV血清陽性HLA A2健康志願者的PBMC針對CMV pp65抗原的T細胞應答，這次篩選中包括PBMC的收集、製備和凍存。這些供體關於HLA I類A和B的HLA信息可以獲得，但是沒有關於HLA I類C或HLA II類的信息。
將全血收集到ACD Vacutainer管(BectonDickinson，Europe)中。利用Leuco Sep管(來自Greiner)，在Lymphoprep(來自NycomedPharma AS，Oslo，Norway)上從全血中分離PBMC，用PBS(來自GIBCOBRL，目錄號14190-094)洗滌3次，以20Mio c/ml的濃度重懸浮於下列冷凍培養基中4份來自GIBCOBRL的RPMI 1640(目錄號31870-025)，補充有1mM來自GIBCOBRL的丙酮酸鈉(目錄號11360-039)、2mM來自GIBCOBRL的L-穀氨醯胺(目錄號25030-024)、0.1mM來自GIBCOBRL的非必需胺基酸(目錄號11140-035)、50μg/ml來自GIBCOBRL的慶大黴素(目錄號15710-049)、50μM來自GIBCOBRL的2-巰基乙醇(目錄號31350-010)；5份來自PAA的胎牛血清(FCS)(目錄號A11-042)；使用前向細胞培養物中加入1份來自SIGMA的DMSO(目錄號D2650)。
PBMC在冷凍容器(Nalgene 1℃冷凍容器，目錄號5100-0001)中-80℃貯存過夜，然後轉移到液氮容器中。
對單細胞人IFN-γ釋放的ELISPOT測定從冷凍的PBMC中檢測pp65特異的效應細胞該測定基本如Lalvani等人所述進行。簡言之，來自Millipore的多篩選96孔過濾板(目錄號MAHA S4510)在4℃下用10μg/ml來自Bender Med Systems的抗人IFN-γmab B140(1μg/孔)包被，過夜。用PBS(來自GIBCOBRL，目錄號14190-094)洗板2次，用下列ELISPOT培養基封閉來自GIBCOBRL的RPMI 1640(目錄號31870-025)，補充有1mM來自GIBCOBRL的丙酮酸鈉(目錄號11360-039)、2mM來自GIBCOBRL的L-穀氨醯胺(目錄號25030-024)、0.1mM來自GIBCOBRL的非必需胺基酸(目錄號11140-035)、50μg/ml來自GIBCOBRL的慶大黴素(目錄號15710-049)、50μM來自GIBCOBRL的2-巰基乙醇(目錄號31350-010)和10％來自BioWhittaker的人AB型血清(目錄號14-490E)。
凍存的PBMC在37℃水浴中快速融解，用ELISPOT培養基洗滌兩次。在融解後，將PBMC置入孵箱(37℃，5％CO2)中2小時。溫育後，使細胞通過70μm滲濾器(Falcon)過濾，調節到濃度為2Mio/ml，以200000個PBMC/孔平板接種。
PBMC與肽集合(其中含有終濃度為5μg/ml的每種單種肽)或者與終濃度為10μg/ml的個別肽共培養20小時。使用伴刀豆球蛋白A(SIGMA)多克隆誘導IFN-γ的分泌作為測定對照。自發的IFN-γ釋放如下測定溫育PBMC與單獨的培養基，或者由於僅篩選HIV陰性的供體，加入來自HIV的HLA 0201限制的CTL表位(HIV逆轉錄酶，aa 476-484ILKEPVHGV)。該篩選中包括通常識別來自流感基質蛋白的HLA A 0201限制的CTL表位(aa 58-65GILGFVFTL)和EBVBMLF1抗原(aa 280-288GLCTLVAML)的肽，作為陽性對照。
測定如段落「合成酶聯免疫印跡測定」所述顯色。
HLA轉基因小鼠的免疫在第一組免疫原性實驗中，如下將摻入候選表位序列的較長合成肽注射到HLA-DRB1*0401-轉基因小鼠中每組3隻小鼠(雌性小鼠，8周齡)，一次皮下注射到後足墊中(每隻小鼠總共300μg肽和5納摩爾CpG1668)。
在第二組表位作圖實驗中，合成的CMV衍生肽在HLA-DRB1*0401轉基因小鼠中如下檢測每組6隻小鼠(雌性小鼠，8周齡)，以一周間隔分3次皮下注射到脅部(每隻小鼠總共100μg肽和一次50μl CFA、兩次50μlIFA)。
在第三組表位作圖實驗中，合成的CMV衍生肽在HLA-DRB1*0401轉基因小鼠中如下檢測每組8隻小鼠(雌性小鼠，8周齡)，一次皮下注射到後足墊中(對於肽1500，每隻小鼠總共300μg肽和5納摩爾CpG1668，對於肽1503和1504，每隻小鼠相同含量的肽和50μl IFA)。
鼠脾細胞的分離和CD4+/CD8+T細胞的分離在最後一次注射後第7天取出脾臟，每組合併在一起。為了製備單細胞懸液，脾臟在補充了5％FCS、2mmole L-穀氨醯胺、50μg/ml慶大黴素、1％丙酮酸鈉、0.1％2-巰基乙醇和1％非必需胺基酸(PAA Laboratories，Linz，Austria)的DMEM培養基(完全培養基)中破碎，並通過70μm細胞滲濾器過濾。細胞在完全培養基中洗滌(1200轉/分，10分鐘)，沉澱重懸浮於紅細胞裂解緩衝液(Sigma-Aldrich)中，溫育2分鐘除去紅細胞。洗滌後，用KOVA Glasstic載玻片(Hycor，Biomedical INC.)計數細胞，用完全培養基調節為每ml 10×107、3.3×106、1.1×106個細胞的濃度。
為了檢測可能表位的I類或II類限制，利用包括miniMACS和midiMACS柱和抗-CD4和抗-CD8磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)的MACS分離系統，按照廠商推薦的程序，將來自鼠脾臟的總細胞分為CD4+和CD8+群體。染色後通過FACS分析檢查CD4+和CD8+群體的純度，簡述如下來自總脾細胞、CD4+和CD8+級分的2×105細胞等份用抗CD8-PE(53-6-7)和抗CD4-FITC(RM4.4)抗體(PharMingen)在室溫下染色15分鐘。洗滌後，用FACS CALIBUR(BactonDickinson)分析樣品。來自幼稚DRB1*0401轉基因小鼠的脾細胞用類似於實驗樣品的方法染色，並且另外用同型對照抗體染色，根據單染色和雙染色的樣品調節FACS CALUBUR設置。
鼠脾細胞IFN-γ釋放的ELISPOT測定ELISpot測定板(MAHA S4510，Millipore，Germany)用PBS(200μl/孔)漂洗，用抗小鼠IFN-γ(INF-γ)mAb(克隆R46A2，購自ATCC，Manassas，VA；50μl/孔1μg/ml，溶於0.1M NaHCO3，pH9.2-9.5)包被，4℃溫育過夜。用含有0.1％Tween-20的PBS洗板4次，與補充1％BSA(200μl/孔)的PBS在室溫下溫育2小時，阻斷非特異性結合。細胞以1×106和3.3×105和1.1×105個細胞/孔的總量接種於100μl，在37℃/5％CO2下與分別加到孔中的10μg/ml(終濃度)不同刺激劑溫育過夜，孔中含有體積為100μl的細胞，這些刺激劑是用於接種的長肽(無關肽)或來源於長肽的重疊的15-mers，或並非用於接種的無關肽HA306-318(編號1171)，或培養基對照。隨後，洗板4次，與生物素化抗小鼠IFN-γmAb(克隆AN18.17.24，購自ATCC，Manassas，VA；100ml/孔2μg/ml，溶於PBS/1％BSA)溫育，37℃2小時。洗滌後，加入100μl/孔用PBS(Roche Diagnostics，Vienna，Austria)1∶5000稀釋的鏈黴親和素-過氧化物酶，平板在37℃下再溫育1小時。之後，用PBS/0.1％Tween-20洗板4次，加入100μl/孔底物(10ml 10mM TrispH7.5，補充有200μl 40mg/ml DAB、50ml 80mg/ml NiCl2和5μl30％H2O2)。20-30分鐘後用自來水洗板終止反應。乾燥的平板用BIOREADER 2000(BioSys，Karben，Germany)和MICROSOFTOFFICE EXCEL程序分析。
實施例I.肽混合物中的表位捕獲，以及通過質譜法鑑定在該實施例中，從相對簡單的肽混合物中捕獲與HLA II類分子結合的高親和力肽的能力得到證明。
首先，用直接結合測定檢測某些肽與可溶性DRB1*0401分子的結合親和力(圖1)。與眾所周知的「強」結合劑YAR和HA306-318相比較，肽親和力被定義為高或低(Valli等人(1993)，SDS-穩定性測定(表1)。1242肽的結合親和力被認為是最高的，與YAR肽的親和力相當。
其次，檢測了從兩種高親和力配體的混合物中捕獲與HLA II類分子結合的肽的能力。結合反應含有1μM可溶性DRB1*0401分子和各5μM YAR和1242肽。在HLA-肽複合物形成後，通過過濾層析使它們與過量的游離肽分離。收集含有MHC分子的級分。從複合物中洗脫結合的肽，通過質譜法分析。讀數後，檢測的兩種高親和力配體都在與MHC分子的複合物中顯示(圖2)。
第三，研究了過量的低親和力肽是否影響高親和力配體的結合能力。為此，在含量恆定(100μM)的低親和力肽1236存在下，1μMDRB1*0401分子與加入的濃度為5-50μM的1242肽進行結合反應，使得1236比1242肽過量2-20倍。肽的結合通過SDS-穩定性測定評價，通過MS分析證實(圖3)。該實驗表明20倍摩爾過量的低親和力肽不會阻礙與高親和力配體形成穩定的MHC-複合物。
最後，檢測10種不同結合親和力的肽的集合的結合(見表1)。除了1236肽以55μM的濃度加入以外，結合反應中每種肽的終濃度均為5μM，這意味著每種單個結合肽的濃度比全部肽的終濃度低20倍。DRB1*0401分子以1μM的濃度加入。利用單種肽作為對照，如上所述評價MHC-肽複合物的形成(圖4)。純化DR4捕獲的肽，通過MS分析測序。分析結果產生具有最高結合親和力的兩種肽1242和YAR(見表1)。複合物中沒有發現中親和力和低親和力的肽，這可能是由於該測定中使用了高濃度的強競爭劑。但是當結合肽的濃度降至0.5μM，使得加入的DR4分子比每種肽都過量時，檢測到中親和力的肽(HA306-318)。這些結果證實了從肽混合物中捕獲一種以上的高親和力肽以及中結合親和力的肽的可能性。
表1
#「+++」高結合親和力；「++」中結合親和力；「+」低結合親和力；「-」不結合。
實施例II.通過合成T細胞測定法測定針對捕獲的肽的T細胞應答在該實施例中證實，如實施例I所述鑑定的肽不僅結合MHC分子，而且能夠刺激T細胞，證實它們是T細胞表位。這一問題是相關的，因為肽與MHC分子的結合本身不能確保該肽「在體內」是相關的。該肽在內體蛋白酶(CD4+T細胞的抗原)或蛋白酶體(CD8+T細胞的抗原)加工「體內」抗原過程中可能不產生。甚至「在體內」加工並呈遞的肽能夠不刺激T細胞，代之以使其無反應性(anergize)(拮抗劑)。當讀取T細胞刺激時，選擇一種IFN-γELISPOT測定。
對於圖5a所述的實施例，來自HCV陰性、接種BCG的健康供體的CD4+T細胞從外周血中分離，與加載p1242和p84的sHLADRB1*0401共培養，p84是一種HCV肽，用作陰性對照。加入抗CD28單克隆抗體實現共刺激。圖5a顯示誘導的IFN-γ斑的數量，每個斑點代表一個刺激的T細胞。誘導的數量顯著高於含陰性對照肽的樣品中檢測到的自發IFN-γ分泌。
為了顯示這不只是適用於MHC II類限制的肽，來自最近感染流感的HIV陰性、感染EBV的健康供體的CD8+T細胞與加載來自流感基質蛋白或EBV BMLF1抗原的肽的sHLA A0201分子一起溫育。能夠檢測到針對兩種病毒肽的顯著的T細胞應答(圖5b)。在與CD8+T細胞共培養之前溫育加載的sHLAA0201分子與抗HLAA0201抗體證明了該應答的特異性。這種預溫育幾乎完全消除了IFN-γ分泌，在這些樣品中只檢測到自發的IFN-γ分泌。這些實施例證明，「在體內」存在針對捕獲的肽的功能性T細胞，因此這些肽是表位，在疫苗中可能有用，誘導保護性免疫應答。
實施例III.通過測定以矩陣形式排列的肽集合對HLA結合肽的快速鑑定在證實了使用肽集合檢測各種結合肽的能力後，利用根據本發明的方法從CMV pp65抗原中鑑定能夠結合HLA II類分子的肽。為此，直接肽結合法與以前描述的肽集合陣列法(Kern等人，1999；Tobery等人，2001)相組合。
為了覆蓋長560個胺基酸的完整pp65序列，設計了547種15mers，它們有14個胺基酸重疊。所有肽的序列都在表2中顯示。
表2.覆蓋完整CMV pp65序列的重疊15-mer肽的序列肽編號序列 肽編號 序列肽編號序列1 MESRGRRCPEMISVL83 TGSEVENVSVNVHNP 165 GLAWTRQQNQWKEPD2 ESRGRRCPEMISVLG84 GSEVENVSVNVHNPT 166 LAWTRQQNQWKEPDV3 SRGRRCPEMISVLGP85 SEVENVSVNVHNPTG 167 AWTRQQNQWKEPDVY4 RGRRCPEMISVLGPI86 EVENVSVNVHNPTGR 168 WTRQQNQWKEPDVYY5 GRRCPEMISVLGPIS87 VENVSVNVHNPTGRS 169 TRQQNQWKEPDVYYT6 RRCPEMISVLGPISG88 ENVSVNVHNPTGRSI 170 RQQNQWKEPDVYYTS7 RCPEMISVLGPISGH89 NVSVNVHNPTGRSIC 171 QQNQWKEPDVYYTSA8 CPEMISVLGPISGHV90 VSVNVHNPTGRSICP 172 QNQWKEPDVYYTSAF9 PEMISVLGPISGHVL91 SVNVHNPTGRSICPS 173 NQWKEPDVYYTSAFV10EMISVLGPISGHVLK92 VNVHNPTGRSICPSQ 174 QWKEPDVYYTSAFVF11MISVLGPISGHVLKA93 NVHNPTGRSICPSQE 175 WKEPDVYYTSAFVFP12ISVLGPISGHVLKAV94 VHNPTGRSICPSQEP 176 KEPDVYYTSAFVFPT13SVLGPISGHVLKAVF95 HNPTGRSICPSQEPM 177 EPDVYYTSAFVFPTK14VLGPISGHVLKAVFS96 NPTGRSICPSQEPMS 178 PDVYYTSAFVFPTKD15LGPISGHVLKAVFSR97 PTGRSICPSQEPMSI 179 DVYYTSAFVFPTKDV16GPISGHVLKAVFSRG98 TGRSICPSQEPMSIY 180 VYYTSAFVFPTKDVA17PISGHVLKAVFSRGD99 GRSICPSQEPMSIYV 181 YYTSAFVFPTKDVAL18ISGHVLKAVFSRGDT100 RSICPSQEPMSIYVY 182 YTSAFVFPTKDVALR19SGHVLKAVFSRGDTP101 SICPSQEPMSIYVYA 183 TSAFVFPTKDVALRH20GHVLKAVFSRGDTPV102 ICPSQEPMSIYVYAL 184 SAFVFPTKDVALRHV21HVLKAVFSRGDTPVL103 CPSQEPMSIYVYALP 185 AFVFPTKDVALRHVV22VLKAVFSRGDTPVLP104 PSQEPMSIYVYALPL 186 FVFPTKDVALRHVVC23LKAVFSRGDTPVLPH105 SQEPMSIYVYALPLK 187 VFPTKDVALRHVVCA24KAVFSRGDTPVLPHE106 QEPMSIYVYALPLKM 188 FPTKDVALRHVVCAH25AVFSRGDTPVLPHET107 EPMSIYVYALPLKML 189 PTKDVALRHVVCAHE26VFSRGDTPVLPHETR108 PMSIYVYALPLKMLN 190 TKDVALRHVVCAHEL27FSRGDTPVLPHETRL109 MSIYVYALPLKMLNI 191 KDVALRHVVCAHELV28SRGDTPVLPHETRLL110 SIYVYALPLKMLNIP 192 DVALRHVVCAHELVC29RGDTPVLPHETRLLQ111 IYVYALPLKMLNIPS 193 VALRHVVCAHELVCS30GDTPVLPHETRLLQT112 YVYALPLKMLNIPSI 194 ALRHVVCAHELVCSM31DTPVLPHETRLLQTG113 VYALPLKMLNIPSIN 195 LRHVVCAHELVCSME32TPVLPHETRLLQTGI114 YALPLKMLNIPSINV 196 RHVVCAHELVCSMEN33PVLPHETRLLQTGIH115 ALPLKMLNIPSINVH 197 HVVCAHELVCSMENT34VLPHETRLLQTGIHV116 LPLKMLNIPSINVHH 198 VVCAHELVCSMENTR35LPHETRLLQTGIHVR117 PLKMLNIPSINVHHY 199 VCAHELVCSMENTRA36PHETRLLQTGIHVRV118 LKMLNIPSINVHHYP 200 CAHELVCSMENTRAT37HETRLLQTGIHVRVS119 KMLNIPSINVHHYPS 201 AHELVCSMENTRATK38ETRLLQTGIHVRVSQ120 MLNIPSINVHHYPSA 202 HELVCSMENTRATKM39TRLLQTGIHVRVSQP121 LNIPSINVHHYPSAA 203 ELVCSMENTRATKMQ40RLLQTGIHVRVSQPS122 NIPSINVHHYPSAAE 204 LVCSMENTRATKMQV41LLQTGIHVRVSQPSL123 IPSINVHHYPSAAER 205 VCSMENTRATKMQVI42LQTGIHVRVSQPSLI124 PSINVHHYPSAAERK 206 CSMENTRATKMQVIG43QTGIHVRVSQPSLIL125 SINVHHYPSAAERKH 207 SMENTRATKMQVIGD44TGIHVRVSQPSLILV126 INVHHYPSAAERKHR 208 MENTRATKMQVIGDQ45GIHVRVSQPSLILVS127 NVHHYPSAAERKHRH 209 ENTRATKMQVIGDQY46IHVRVSQPSLILVSQ128 VHHYPSAAERKHRHL 210 NTRATKMQVIGDQYV47HVRVSQPSLILVSQY129 HHYPSAAERKHRHLP 211 TRATKMQVIGDQYVK48VRVSQPSLILVSQYT130 HYPSAAERKHRHLPV 212 RATKMQVIGDQYVKV49RVSQPSLILVSQYTP131 YPSAAERKHRHLPVA 213 ATKMQVIGDQYVKVY50VSQPSLILVSQYTPD132 PSAAERKHRHLPVAD 214 TKMQVIGDQYVKVYL51SQPSLILVSQYTPDS133 SAAERKHRHLPVADA 215 KMQVIGDQYVKVYLE52QPSLILVSQYTPDST134 AAERKHRHLPVADAV 216 MQVIGDQYVKVYLES53PSLILVSQYTPDSTP135 AERKHRHLPVADAVI 217 QVIGDQYVKVYLESF54SLILVSQYTPDSTPC136 ERKHRHLPVADAVIH 218 VIGDQYVKVYLESFC55LILVSQYTPDSTPCH137 RKHRHLPVADAVIHA 219 IGDQYVKVYLESFCE56ILVSQYTPDSTPCHR138 KHRHLPVADAVIHAS 220 GDQYVKVYLESFCED57LVSQYTPDSTPCHRG139 HRHLPVADAVIHASG 221 DQYVKVYLESFCEDV58VSQYTPDSTPCHRGD140 RHLPVADAVIHASGK 222 QYVKVYLESFCEDVP
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肽編號序列 肽編號 序列 肽編號 序列247 GSDVEEDLTMTRNPQ329EVQAIRETVELRQYD411VTTERKTPRVTGGGA248 SDVEEDLTMTRNPQP330VQAIRETVELRQYDP412TTERKTPRVTGGGAM249 DVEEDLTMTRNPQPF331QAIRETVELRQYDPV413TERKTPRVTGGGAMA250 VEEDLTMTRNPQPFM332AIRETVELRQYDPVA414ERKTPRVTGGGAMAG251 EEDLTMTRNPQPFMR333IRETVELRQYDPVAA415RKTPRVTGGGAMAGA252 EDLTMTRNPQPFMRP334RETVELRQYDPVAAL416KTPRVTGGGAMAGAS253 DLTMTRNPQPFMRPH335ETVELRQYDPVAALF417TPRVTGGGAMAGAST254 LTMTRNPQPFMRPHE336TVELRQYDPVAALFF418PRVTGGGAMAGASTS255 TMTRNPQPFMRPHER337VELRQYDPVAALFFF419RVTGGGAMAGASTSA256 MTRNPQPFMRPHERN338ELRQYDPVAALFFFD420VTGGGAMAGASTSAG257 TRNPQPFMRPHERNG339LRQYDPVAALFFFDI421TGGGAMAGASTSAGR258 RNPQPFMRPHERNGF340RQYDPVAALFFFDID422GGGAMAGASTSAGRK259 NPQPFMRPHERNGFT341QYDPVAALFFFDIDL423GGAMAGASTSAGRKR260 PQPFMRPHERNGFTV342YDPVAALFFFDIDLL424GAMAGASTSAGRKRK261 QPFMRPHERNGFTVL343DPVAALFFFDIDLLL425AMAGASTSAGRKRKS262 PFMRPHERNGFTVLC344PVAALFFFDIDLLLQ426MAGASTSAGRKRKSA263 FMRPHERNGFTVLCP345VAALFFFDIDLLLQR427AGASTSAGRKRKSAS264 MRPHERNGFTVLCPK346AALFFFDIDLLLQRG428GASTSAGRKRKSASS265 RPHERNGFTVLCPKN347ALFFFDIDLLLQRGP429ASTSAGRKRKSASSA266 PHERNGFTVLCPKNM348LFFFDIDLLLQRGPQ430STSAGRKRKSASSAT267 HERNGFTVLCPKNMI349FFFDIDLLLQRGPQY431TSAGRKRKSASSATA268 ERNGFTVLCPKNMII350FFDIDLLLQRGPQYS432SAGRKRKSASSATAC269 RNGFTVLCPKNMIIK351FDIDLLLQRGPQYSE433AGRKRKSASSATACT270 NGFTVLCPKNMIIKP352DIDLLLQRGPQYSEH434GRKRKSASSATACTS271 GFTVLCPKNMIIKPG353IDLLLQRGPQYSEHP435RKRKSASSATACTSG272 FTVLCPKNMIIKPGK354DLLLQRGPQYSEHPT436KRKSASSATACTSGV273 TVLCPKNMIIKPGKI355LLLQRGPQYSEHPTF437RKSASSATACTSGVM274 VLCPKNMIIKPGKIS356LLQRGPQYSEHPTFT438KSASSATACTSGVMT275 LCPKNMIIKPGKISH357LQRGPQYSEHPTFTS439SASSATACTSGVMTR276 CPKNMIIKPGKISHI358QRGPQYSEHPTFTSQ440ASSATACTSGVMTRG277 PKNMIIKPGKISHIM359RGPQYSEHPTFTSQY441SSATACTSGVMTRGR278 KNMIIKPGKISHIML360GPQYSEHPTFTSQYR442SATACTSGVMTRGRL279 NMIIKPGKISHIMLD361PQYSEHPTFTSQYRI443ATACTSGVMTRGRLK280 MIIKPGKISHIMLDV362QYSEHPTFTSQYRIQ444TACTSGVMTRGRLKA281 IIKPGKISHIMLDVA363YSEHPTFTSQYRIQG445ACTSGVMTRGRLKAE
282 IKPGKISHIMLDVAF 364 SEHPTFTSQYRIQGK 446 CTSGVMTRGRLKAES283 KPGKISHIMLDVAFT 365 EHPTFTSQYRIQGKL 447 TSGVMTRGRLKAEST284 PGKISHIMLDVAFTS 366 HPTFTSQYRIQGKLE 448 SGVMTRGRLKAESTV285 GKISHIMLDVAFTSH 367 PTFTSQYRIQGKLEY 449 GVMTRGRLKAESTVA286 KISHIMLDVAFTSHE 368 TFTSQYRIQGKLEYR 450 VMTRGRLKAESTVAP287 ISHIMLDVAFTSHEH 369 FTSQYRIQGKLEYRH 451 MTRGRLKAESTVAPE288 SHIMLDVAFTSHEHF 370 TSQYRIQGKLEYRHT 452 TRGRLKAESTVAPEE289 HIMLDVAFTSHEHFG 371 SQYRIQGKLEYRHTW 453 RGRLKAESTVAPEED290 IMLDVAFTSHEHFGL 372 QYRIQGKLEYRHTWD 454 GRLKAESTVAPEEDT291 MLDVAFTSHEHFGLL 373 YRIQGKLEYRHTWDR 455 RLKAESTVAPEEDTD292 LDVAFTSHEHFGLLC 374 RIQGKLEYRHTWDRH 456 LKAESTVAPEEDTDE293 DVAFTSHEHFGLLCP 375 IQGKLEYRHTWDRHD 457 KAESTVAPEEDTDED294 VAFTSHEHFGLLCPK 376 QGKLEYRHTWDRHDE 458 AESTVAPEEDTDEDS295 AFTSHEHFGLLCPKS 377 GKLEYRHTWDRHDEG 459 ESTVAPEEDTDEDSD296 FTSHEHFGLLCPKSI 378 KLEYRHTWDRHDEGA 460 STVAPEEDTDEDSDN297 TSHEHFGLLCPKSIP 379 LEYRHTWDRHDEGAA 461 TVAPEEDTDEDSDNE298 SHEHFGLLCPKSIPG 380 EYRHTWDRHDEGAAQ 462 VAPEEDTDEDSDNEI299 HEHFGLLCPKSIPGL 381 YRHTWDRHDEGAAQG 463 APEEDTDEDSDNEIH300 EHFGLLCPKSIPGLS 382 RHTWDRHDEGAAQGD 464 PEEDTDEDSDNEIHN301 HFGLLCPKSIPGLSI 383 HTWDRHDEGAAQGDD 465 EEDTDEDSDNEIHNP302 FGLLCPKSIPGLSIS 384 TWDRHDEGAAQGDDD 466 EDTDEDSDNEIHNPA303 GLLCPKSIPGLSISG 385 WDRHDEGAAQGDDDV 467 DTDEDSDNEIHNPAV304 LLCPKSIPGLSISGN 386 DRHDEGAAQGDDDVW 468 TDEDSDNEIHNPAVF305 LCPKSIPGLSISGNL 387 RHDEGAAQGDDDVWT 469 DEDSDNEIHNPAVFT306 CPKSIPGLSISGNLL 388 HDEGAAQGDDDVWTS 470 EDSDNEIHNPAVFTW307 PKSIPGLSISGNLLM 389 DEGAAQGDDDVWTSG 471 DSDNEIHNPAVFTWP308 KSIPGLSISGNLLMN 390 EGAAQGDDDVWTSGS 472 SDNEIHNPAVFTWPP309 SIPGLSISGNLLMNG 391 GAAQGDDDVWTSGSD 473 DNEIHNPAVFTWPPW310 IPGLSISGNLLMNGQ 392 AAQGDDDVWTSGSDS 474 NEIHNPAVFTWPPWQ311 PGLSISGNLLMNGQQ 393 AQGDDDVWTSGSDSD 475 EIHNPAVFTWPPWQA312 GLSISGNLLMNGQQI 394 QGDDDVWTSGSDSDE 476 IHNPAVFTWPPWQAG313 LSISGNLLMNGQQIF 395 GDDDVWTSGSDSDEE 477 HNPAVFTWPPWQAGI314 SISGNLLMNGQQIFL 396 DDDVWTSGSDSDEEL 478 NPAVFTWPPWQAGIL315 ISGNLLMNGQQIFLE 397 DDVWTSGSDSDEELV 479 PAVFTWPPWQAGILA316 SGNLLMNGQQIFLEV 398 DVWTSGSDSDEELVT 480 AVFTWPPWQAGILAR317 GNLLMNGQQIFLEVQ 399 VWTSGSDSDEELVTT 481 VFTWPPWQAGILARN318 NLLMNGQQIFLEVQA 400 WTSGSDSDEELVTTE 482 FTWPPWQAGILARNL319 LLMNGQQIFLEVQAI 401 TSGSDSDEELVTTER 483 TWPPWQAGILARNLV320 LMNGQQIFLEVQAIR 402 SGSDSDEELVTTERK 484 WPPWQAGILARNLVP321 MNGQQIFLEVQAIRE 403 GSDSDEELVTTERKT 485 PPWQAGILARNLVPM322 NGQQIFLEVQAIRET 404 SDSDEELVTTERKTP 486 PWQAGILARNLVPMV323 GQQIFLEVQAIRETV 405 DSDEELVTTERKTPR 487 WQAGILARNLVPMVA324 QQIFLEVQAIRETVE 406 SDEELVTTERKTPRV 488 QAGILARNLVPMVAT325 QIFLEVQAIRETVEL 407 DEELVTTERKTPRVT 489 AGILARNLVPMVATV326 IFLEVQAIRETVELR 408 EELVTTERKTPRVTG 490 GILARNLVPMVATVQ327 FLEVQAIRETVELRQ 409 ELVTTERKTPRVTGG 491 ILARNLVPMVATVQG328 LEVQAIRETVELRQY 410 LVTTERKTPRVTGGG 492 LARNLVPMVATVQGQ肽編號序列 肽編號序列 肽編號序列493 ARNLVPMVATVQGQN 520 IYRIFAELEGVWQPA 544 QDALPGPCIASTPKK494 RNLVPMVATVQGQNL 521 YRIFAELEGVWQPAA 545 DALPGPCIASTPKKH495 NLVPMVATVQGQNLK 522 RIFAELEGVWQPAAQ 546 ALPGPCIASTPKKHR496 LVPMVATVQGQNLKY 523 IFAELEGVWQPAAQP 547 LPGPCIASTPKKHRG497 VPMVATVQGQNLKYQ 524 FAELEGVWQPAAQPK498 PMVATVQGQNLKYQE 525 AELEGVWQPAAQPKR499 MVATVQGQNLKYQEF 526 ELEGVWQPAAQPKRR500 VATVQGQNLKYQEFF 527 LEGVWQPAAQPKRRR501 ATVQGQNLKYQEFFW 528 EGVWQPAAQPKRRRH502 TVQGQNLKYQEFFWD 529 GVWQPAAQPKRRRHR503 VQGQNLKYQEFFWDA 530 VWQPAAQPKRRRHRQ
504 QGQNLKYQEFFWDAN 531 WQPAAQPKRRRHRQD505 GQNLKYQEFFWDAND 532 QPAAQPKRRRHRQDA506 QNLKYQEFFWDANDI 533 PAAQPKRRRHRQDAL507 NLKYQEFFWDANDIY 534 AAQPKRRRHRQDALP508 LKYQEFFWDANDIYR 535 AQPKRRRHRQDALPG509 KYQEFFWDANDIYRI 536 QPKRRRHRQDALPGP510 YQEFFWDANDIYRIF 537 PKRRRHRQDALPGPC511 QEFFWDANDIYRIFA 538 KRRRHRQDALPGPCI512 EFFWDANDIYRIFAE 539 RRRHRQDALPGPCIA513 FFWDANDIYRIFAEL 540 RRHRQDALPGPCIAS514 FWDANDIYRIFAELE 541 RHRQDALPGPCIAST515 WDANDIYRIFAELEG 542 HRQDALPGPCIASTP516 DANDIYRIFAELEGV 543 RQDALPGPCIASTPK517 ANDIYRIFAELEGVW 544 QDALPGPCIASTPKK518 NDIYRIFAELEGVWQ 545 DALPGPCIASTPKKH519 DIYRIFAELEGVWQP 546 ALPGPCIASTPKKHR520 IYRIFAELEGVWQPA 547 LPGPCIASTPKKHRG521 YRIFAELEGVWQPAA 519 DIYRIFAELEGVWQP522 RIFAELEGVWQPAAQ 520 IYRIFAELEGVWQPA523 IFAELEGVWQPAAQP 521 YRIFAELEGVWQPAA524 FAELEGVWQPAAQPK 522 RIFAELEGVWQPAAQ525 AELEGVWQPAAQPKR 523 IFAELEGVWQPAAQP526 ELEGVWQPAAQPKRR 524 FAELEGVWQPAAQPK527 LEGVWQPAAQPKRRR 525 AELEGVWQPAAQPKR528 EGVWQPAAQPKRRRH 526 ELEGVWQPAAQPKRR529 GVWQPAAQPKRRRHR 527 LEGVWQPAAQPKRRR530 VWQPAAQPKRRRHRQ 528 EGVWQPAAQPKRRRH531 WQPAAQPKRRRHRQD 529 GVWQPAAQPKRRRHR532 QPAAQPKRRRHRQDA 530 VWQPAAQPKRRRHRQ533 PAAQPKRRRHRQDAL 531 WQPAAQPKRRRHRQD534 AAQPKRRRHRQDALP 532 QPAAQPKRRRHRQDA535 AQPKRRRHRQDALPG 533 PAAQPKRRRHRQDAL536 QPKRRRHRQDALPGP 534 AAQPKRRRHRQDALP537 PKRRRHRQDALPGPC 535 AQPKRRRHRQDALPG538 KRRRHRQDALPGPCI 536 QPKRRRHRQDALPGP539 RRRHRQDALPGPCIA 537 PKRRRHRQDALPGPC540 RRHRQDALPGPCIAS 538 KRRRHRQDALPGPCI541 RHRQDALPGPCIAST 539 RRRHRQDALPGPCIA542 HRQDALPGPCIASTP 540 RRHRQDALPGPCIAS543 RQDALPGPCIASTPK 541 RHRQDALPGPCIAST544 QDALPGPCIASTPKK 542 HRQDALPGPCIASTP545 DALPGPCIASTPKKH 543 RQDALPGPCIASTPK546 ALPGPCIASTPKKHR 544 QDALPGPCIASTPKK547 LPGPCIASTPKKHRG 545 DALPGPCIASTPKKH493 ARNLVPMVATVQGQN 546 ALPGPCIASTPKKHR494 RNLVPMVATVQGQNL 547 LPGPCIASTPKKHRG495 NLVPMVATVQGQNLK 519 DIYRIFAELEGVWQP496 LVPMVATVQGQNLKY 520 IYRIFAELEGVWQPA497 VPMVATVQGQNLKYQ 521 YRIFAELEGVWQPAA498 PMVATVQGQNLKYQE 522 RIFAELEGVWQPAAQ499 MVATVQGQNLKYQEF 523 IFAELEGVWQPAAQP500 VATVQGQNLKYQEFF 524 FAELEGVWQPAAQPK501 ATVQGQNLKYQEFFW 525 AELEGVWQPAAQPKR502 TVQGQNLKYQEFFWD 526 ELEGVWQPAAQPKRR503 VQGQNLKYQEFFWDA 527 LEGVWQPAAQPKRRR504 QGQNLKYQEFFWDAN 528 EGVWQPAAQPKRRRH505 GQNLKYQEFTWDAND 529 GVWQPAAQPKRRRHR506 QNLKYQEFFWDANDI 530 VWQPAAQPKRRRHRQ507 NLKYQEFFWDANDIY 531 WQPAAQPKRRRHRQD508 LKYQEFFWDANDIYR 532 QPAAQPKRRRHRQDA509 KYQEFFWDANDIYRI 533 PAAQPKRRRHRQDAL510 YQEFFWDANDIYRIF 534 AAQPKRRRHRQDALP
511 QEFFWDANDIYRIFA535 AQPKRRRHRQDALPG512 EFFWDANDIYRIFAE536 QPKRRRHRQDALPGP513 FFWDANDIYRIFAEL537 PKRRRHRQDALPGPC514 FWDANDIYRIFAELE538 KRRRHRQDALPGPCI515 WDANDIYRIFAELEG539 RRRHRQDALPGPCIA516 DANDIYRIFAELEGV540 RRHRQDALPGPCIAS517 ANDIYRIFAELEGVW541 RHRQDALPGPCIAST518 NDIYRIFAELEGVWQ542 HRQDALPGPCIASTP519 DIYRIFAELEGVWQP543 RQDALPGPCIASTPK由於要檢測大量的肽，這些肽組合成42個集合，每個集合含有以矩陣形式排列的21種肽，如圖6所示。製備混合物，使得每一種肽恰好包含於一「行」集合和一「列」集合中。
通過SDS-穩定性測定檢測每個矩陣集合與DR4分子的結合親和力；HA306-318用作參照肽(圖7a)。在第一次篩選中，發現42個陽性肽集合中的18個來自「行」集合的2、3、6、15、16、19、20號和來自「列」集合的28-38號(參見圖6)。通過發現陣列中反應性集合的交叉，確定77種肽為可能的結合劑。然後檢測每個15mer分別與DR4分子的結合(圖7b，表3)。因此，在第一次篩選中選擇的20種肽在第二次篩選中證實是結合劑。在陣列的行中通常發現一種以上的陽性肽。這些重疊14個胺基酸的肽可能代表被CD4+T細胞上TCR受體識別的較長的表位。
以前描述了4種含有部分或全部相同序列的肽(肽177、361、507、508)，能夠在暴露於CMV的健康人類受試者中引發特異性CD4+T細胞應答(Khattab等人，1997；Bitmansour等人，2001)。這證實了我們的方法的有效性。
一些鑑定的DRB1*0401結合肽，以及通過預測算法選擇的其它肽，也檢測它們與下列不同等位基因的可溶性HLA分子的結合DRB1*0101、DRB1*0404、DRB1*0701和DRB1*1101(表3)。證明有7種肽(58、177、559、360、452、470和496)具有對至少兩種HLA分子的親和力，這支持這些表位的混雜性(promiscuity)。
也發現與DRB1*0404結合的3種肽(421、469和470)能誘導來自CMV血清陽性供體的T細胞分泌IFN-γ(參見實施例IV)，再次表明這第二種反向免疫學方法也能鑑定真正的T細胞表位。
總之，鑑定了來源於CMV pp65抗原的幾個新序列，它們能夠與HLA II類分子結合，考慮作為II類表位的候選物(表3中帶陰影的)。包含所述表位的肽的免疫原性，以及它們的CD4+特異性，通過檢測它們在來自體內地刺激CMV血清陽性供體和/或HLA-DRB1*0401轉基因小鼠的T細胞後誘導IFN-γ產生的能力得到證實(參見實施例V、VI和VII)。
表3.CMV pp65蛋白的各種15mer肽與可溶性HLA分子的結合。新鑑定的結合劑帶有陰影。
#「-」未結合；「+/-」弱結合；「+」中度結合；「++」強結合；「nd」未測定。肽不溶於水。
實施例IV通過測定對排列為矩陣的15-mer肽集合的細胞因子應答對T細胞表位的鑑定，以及各種肽的證實設計547種肽，每種肽由15個胺基酸組成，15個胺基酸中的14個與其前體重疊，覆蓋CMV pp65抗原的完整序列。所有肽的序列都在表2中顯示。
因為可以獲得的用於篩選T細胞應答的PBMC的數量通常有限，肽不單個使用，而是與以矩陣形式排列的列集合或行集合組合(圖6)。首先，各種肽以5mg/ml的濃度溶解於100％DMSO中。然後製備21種肽的混合物，使得每種肽恰好包含於2個集合中。為了再刺激人PBMC，肽混合物用測定培養基稀釋，使得每種肽的終濃度為5μg/ml。該濃度高於Maecker等人(Maecker論文)發現對於CD4和CD8陽性T細胞應答而言飽和的1.75μg/ml的濃度。每個樣品中DMSO的終濃度為2.1％。
總之，來自10名CMV血清陽性、HLA-A2陽性的健康供體的PBMC用於篩查圖6所示的42個肽集合。為了證實通常短於15個胺基酸的I類表位是否在15mer肽內被適當識別，以及高DMSO含量不損害T細胞的激活和功能，在每次篩選中包含一種良好表徵的來自CMV pp65的免疫顯性CD8限制的9-mer表位(NLVPMVATV，位點495-503)，其濃度為10μg/ml(DMSO終濃度為0.1％)。
當讀取T細胞再激活時，使用人IFN-γElispot。圖8a顯示與極少肽集合反應的供體。陽性列與行集合的交叉點鑑定肽490-492。這3種肽含有良好表徵的免疫顯性CD8限制的9-mer最小表位NLVPMVATV，位點495-503。這些肽集合引發的應答大部分等於9-mer最小表位引發的應答(圖8a)。這表明，較短的表位在15-mer肽內被適當識別，高DMSO含量不損害T細胞應答。
大多數其它供體顯示針對幾種表位的更複雜的應答。一個例子如圖8b所示。用所有10名供體進行的第一次篩選的結果總結於表4中。
表4.第一次篩選的總結
在第二次篩選中，重新檢測對應於陽性行和列集合的交叉點的所有肽。在此情況下，相同供體的PBMC與終濃度為20μg/ml的各種肽溫育20小時。再次用人IFN-γElispot測定讀取T細胞再激活。
圖9顯示供體10736的結果，他在第一次篩選中鑑定為一名具有高度集中的T細胞應答的個體(圖8a)。用肽489-495重新檢測證實了肽490-492的反應性，另外也鑑定了肽493是IFN-γ分泌的誘導劑。對15mer肽的反應程度與9-mer最小表位相當。在第一次篩選中包括隨機選擇的對應於陰性行和列混合物的交叉點的肽作為陰性對照；不誘導任何IFN-γ分泌(圖9)。
這第二次篩選的全部結果和由它確定的所有表位都總結於表5(表位已經在文獻中描述)和表6(新型表位通過根據本發明的方法鑑定)中。
在已知的表位中，引人注目的是，良好表徵的CD8限制的9-mer最小表位(NLVPMVATV，位點495-503)在10名供體中的9名中被識別，證明它是CMV pp65抗原中最常被識別的HLA-A*0201限制的表位之一。在10名HLA A2供體中，有2名也表達HLA-B7。根據文獻已知兩種HLA-B7限制的表位pp65 265-274和pp65 417-426。這兩種都在HLA B7陽性供體中發現，特別是pp65 417-426表位似乎比HLA-A*0201限制的pp65 495-503表位誘導更多的IFN-γ分泌。該數據與下列發現相一致對CMV pp65抗原的T細胞應答與HLA-A2和/或HLA-B7表位的表達強烈相關(Eur.J.Immunol.，2000，30，2531-2539)。除了這些所謂的「免疫顯性」表位之外，再次發現了pp65內描述的大多數其它表位(表5)。這證明該方法既是非常靈敏的又是廣泛適用的，因此適於檢測免疫顯性和亞顯性的表位。
表5a.發現的表位與文獻中所知的I類表位的比較
1)重新發現的數量/表達各自HLA類型的供體的數量表5b.發現的表位與文獻已知的II類表位的比較
1)沒有關於供體的MHC II類表型的信息可以獲得。
表6列出了如實施例I和II所述通過根據本發明的方法鑑定的所有新型T細胞表位。
第一組表位(肽262、394、395、411、415、416、417)含有已經在文獻中描述為T細胞表位的序列，雖然它們具有與此處發現的不同的HLA限制。這些結果表明，這些表位在與以前所知不同的HLA內容中也能夠被T細胞識別。該發現是新的發現，擴展了這些肽的有效性，例如作為適用於表達這些具體HLA的個體的疫苗的一部分。
第二組表位(肽213、214和216)已經在文獻中描述為與HLA-A*0201分子結合，然而在我們的工作之前，沒有數據證明這些肽能夠激活T細胞。一種肽的結合是被T細胞激活/識別的前提條件，但是不能確保這種激活/識別。首先，一種抗原內不是所有可能的肽序列都同樣較好地產生，或者在體內抗原加工和呈遞過程中根本不產生。因此，與HLA結合的合成肽不一定是一種天然存在的表位。即使通過主動接種能夠引發針對這些肽的T細胞，它們也不能用於對抗病原體，因為感染的細胞不在其表面展示這些肽。其次，即使結合的肽對應於一種天然存在的表位，這也不能確保它能夠誘導功能性T細胞。相反，某些肽能夠作為拮抗劑，使T細胞無反應性。這些數據第一次顯示，由於病毒感染，這些肽能夠在人體中誘導分泌IFN-γ的功能性T細胞。這一發現是新的發現，為針對CMV的疫苗中包含這些肽提供了理論基礎。
第三組表位(肽211、476、477、479、421、422、423、424、469、470、503、506)迄今為止根本沒有描述。由於這些數據顯示，由於病毒感染，這些肽能夠誘導的分泌IFN-γ的功能性T細胞，它們本身就是或者在其序列內含有新的T細胞表位。它們尤其可用於包含於針對CMV的疫苗中。
由於該實施例描述的篩選使用全部PBMC，因此分析對所有15mers的全部T細胞應答。該應答可能限於各自供體表達的任何一種HLA-等位基因。在每種情況下包括HLA-A、-B、-C(I類)和HLA-DR、-DP、-DQ(II類)中的至少兩種可能的等位基因。為了進一步表徵此處提供的新型表位，人們可以定義這些表位的準確HLA限制，和T細胞識別的序列內的最小表位。它們都能用本領域技術人員公知的多種已經建立的方法完成(《現代免疫學方法》(Current Protocols inImmunology)，John Wiley Sons，Inc.)。
首先，能夠利用可以公開獲得的程序根據結合基序預測T細胞表位。例如包括http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/(Parker等人1994)，http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.htm(Rammensee等人1999)，http://mypage.ihost.com/usinet.hamme76/(Sturniolo等人1999)。後一種預測算法使得可能鑑定混雜的T輔助表位，即可與幾種HLA II類分子結合的肽。用最高概率預測的各自的HLA分子在表4中列出。通過檢測肽與各自HLA的結合能夠證實這些預測。對於預測可能是II類表位的序列，檢測它們與DRB1*0101、*0401和*0404分子的結合(見實施例III)。發現肽421、469、470(覆蓋胺基酸421-438、469-484和470-485)與DRB1*0404結合(見表5)。
快速辨別對一種肽的應答是I類還是II類限制的一種方法是用純CD4+或CD8+T效應細胞群體重複ELIspot測定。其實現方法例如是利用磁性細胞分選分離各自的亞組。純CD8+T細胞也能夠與只表達一種目的HLA分子的人工抗原呈遞細胞一起在ELIspot測定中檢測。一個例子是HLA-A*0201陽性T2細胞(174CEM.T2，Nijman等人，1993)。此外，也能夠在特異阻斷CD4+或CD8+T細胞亞群的單克隆抗體存在下，用全PBMC進行ELIspot測定。準確的HLA限制能夠用類似的方法測定，使用對某種等位基因特異的阻斷單克隆抗體。例如，加入HLA-A24特異的單克隆抗體能夠特異地阻斷對HLA-A24限制的表位的應答。
為了確定T細胞識別的肽序列內的最小表位，例如能夠合成一系列重疊的和截短的肽(例如8-、9-、10-mers)並分別重新檢測。實施例V通過T2-ELIspot對新型HLA-A*0201表位的證實為了證實預測的陽性15mer內的HLA-A2表位，合成9-或10-mer肽，並分別檢測。用T2細胞作為抗原呈遞細胞以及從幾名供體中分離的CD8+T細胞進行ELIspot測定。在該設置中，只有從外部與HLA-A*0201結合的最佳長度的表位能夠觸發IFN-γ分泌。有5種新HLA-A*0201表位能夠用這種方法證實(表6)。該測定如前所述進行(Herr 1997)。簡言之，T2細胞(Nijman 1993)在ELIspot培養基中生長(參見MM部分)，在使用前3天調節為4×105/ml。在洗滌2次後(PBS；1％人白蛋白，來自SIGMA)，細胞以2.5×106/ml的濃度接種到ELIspot培養基中，加入10μg/ml肽培養過夜。次日，T2細胞用ELIspot培養基洗滌一次，100μl(1×106T2細胞/ml)接種包被並封閉的ELIspot板(見上)，其中補充了20μg/ml肽。為了分離CD8+淋巴細胞，1×107PBMNC與20μl抗人CD8+微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)混合，終體積為100μl，在冰上溫育15分鐘。之後，細胞用過量的MACS緩衝液洗滌10次，CD8+細胞在磁性微型柱(Miltenyi)上分離。每孔加入調節為1×106c/ml的100μl CD8+淋巴細胞。在培養20小時後，用PBS，0.05％Tween 20洗滌4次分離細胞，如MM部分所述進行測定。
表6針對HLA-A*0201限制的CMV pp65表位的CD8+T細胞應答，通過對IFN-γ的T2 ELIspot測定評價。
1)除第一次矩陣篩選外新血液抽取3-6個月2)新表位以黑體字顯示3)每100,000個CD8+T細胞的斑點數量；＜低於背景(含HIV陰性對照肽的斑點)加兩個標準差。
實施例VI使用人PBMC通過表位捕獲方法鑑定的新型II類(HLA-DR4)表位的證實其中，15mer 55-61通過表位捕獲法確定為可溶性HLA-DRB1*0401的強結合劑(圖7a，7b)。各種重疊15mer 55-61的結合確定胺基酸序列YTPDSTPCH為LILVSQYTPDSTPCHRGDNQL的核心結合區，它可含有幾種形式的II類表位。眾所周知，II類表位含有可變長度的末端，伸出於MHC結合溝槽。有趣的是，供體10788顯示對15mer 57和59的強T細胞應答(圖10)，通過如實施例IV所述的IFN-γELIspot測定。這證實LILVSQYTPDSTPCHRGDNQL是或者含有至少一種HTL表位，該表位至少可與最初通過本發明的表位捕獲法發現的HLA-DRB1*0401結合。
圖10使用CMV pp65 15mers 57、59和對照(med不含肽，HIV無關HIV衍生肽，ConA多克隆刺激)的IFN-γELIspot使用來自受試者10788的PBMC。
作為另一個實施例，對於通過本發明的表位捕獲法確定為與DRB1*0404弱結合的15mer 469和470(表3)，檢測它與人PBMC的反應性。為了辨別CD8陽性CTL介導的或CD4-陽性HTL介導的反應性，進行細胞內細胞因子染色聯合表面標誌物染色融解後，PBMNC在含有10％人AB型血清(BioWhittaker)的RPMI1640中保存過夜(37℃，5％CO2)。次日，2百萬個PBMNC的等份與肽(80μg/ml)或伴刀豆球蛋白A(SIGMA)一起溫育。1小時後，加入10μg/ml布雷菲德菌素A(SIGMA)，繼續溫育5小時。對CD4(藻紅蛋白)、CD8(細胞色素)、CD69(別藻藍蛋白)的表面染色用如述標記的抗體(Pharmingen，San Diego，CA，USA)進行。在用1％低聚甲醛PBS溶液固定後，通過在0.5％BSA/0.1％疊氮鈉/0.1％皂苷PBS溶液中溫育15分鐘使細胞透化。細胞內細胞因子用抗-IFN-γ(FITC)抗體4S.B3(Pharmingen)染色。樣品(淋巴細胞門中的100,000個事件)用FACScalibur(Becton Dickinson)讀數。
覆蓋DEDSDNEIHNPAVFTW469-484的15mer 469和470含有A*0201和II類結合基序，並可與可溶性DRB1*0404結合(表3)。細胞內細胞因子染色證實，對於供體10788，在CD8和CD4陽性T細胞區室中有顯著的IFN-γ分泌(圖11，下面兩張圖)。相反，供體10687隻顯示針對15mer 489 AGILARNLVPMVATV489-503的CD8介導的IFN-γ分泌，表明在這種情況下只有HLA-A2表位NLVPMVATV495-503被靶向。這些結果證實，肽DEDSDNEIHNPAVFTW469-484含有I類和II類限制的表位。
圖11通過細胞內IFN-γ染色證實針對CMV pp65 15mer 469、470的同時的CD4+和CD8+T細胞應答。來自兩名供體(10687、10788)的PBMC用ConA作為陽性對照(第一列)、含有推斷的I類和II類表位的15mer(第2列和第3列)或培養基作為陰性對照(右列)刺激。對胞內IFN-γ(x軸)或表面T細胞分化標記CD4或CD8(y軸)染色細胞。標出了右上四分之一的百分數，顯著高於背景的數字用黑體顯示。
實施例VII利用HLA-DR4轉基因小鼠，通過表位捕獲法鑑定的新型II類(HLA-DRB1*0401)表位的證實為此，在表達DRB1*0401分子的HLA-DR4轉基因小鼠中進行DRB1*0401結合實驗，其中檢測CMV血清陽性個體不能證明T細胞的反應性。合成覆蓋可與DRB1*0401分子結合的所有候選表位的較長肽(1500-1505)(見表7)，並注射到小鼠中。最後一次注射一周後，總鼠脾細胞用下列成分來自體內地再刺激用於接種的相同肽，以及代表相應較長肽的重疊15-mer，和一種無關的流感血凝素衍生肽(1171)作為陰性對照。T細胞反應性通過INF-γELISpot試驗檢測(圖12)，結果6種較長肽中有5種顯示免疫原性。而且，代表較長的肽並顯示與DRB1*0401分子的親和力的大多數15-mer也已經證實再激活DRBI*0401轉基因小鼠的來自體內的T細胞。有一種肽(1503)至少在這些研究使用的免疫條件下不誘導免疫應答。
為了免疫原性肽的精確表位作圖和CD4+特異性的體內檢測，小鼠接種較長的肽，如上所述將脾細胞分成CD4+和CD8+T細胞群體(CD4+級分的純度為92-94％)，待測IFN-γ的產生。圖12顯示該ELISpot測定的結果。在所有情況下，用脾細胞測定的T細胞應答能夠用CD4+細胞證實。CD8+應答通常可以忽略。肽1502同時所見的CD4+和CD8+應答可能是由於肽序列內所含的另一種I類小鼠表位。
表7a總結了用可溶性DR分子進行的肽結合研究和小鼠實驗的所有數據。觀察到肽對DRB1*0401分子的親和力與HLA-DR4轉基因小鼠中CD4+細胞的特異性刺激之間的良好相關性。例如，肽1500-1502和1504在兩種方法中顯示相似的結果。肽1505在結合測定中不是很好，在肽注射後引起小鼠產生最高頻率的T細胞。在體外與DRB1*0401分子有弱親和力的肽1503在注射CpG1668或CFA/IFA的小鼠中沒有免疫原性。在此也應當提到，根據用於注射的佐劑不同，有些肽顯示可變的免疫原性和特定的CD4+頻率。根據使用CD4+細胞富集級分的小鼠ELISpot測定和使用可溶性DRB1*0401分子的肽結合測定的結果，能夠確定可被攜帶DRB1*0401的T細胞識別的表位核心序列(參見表7和表7a)。其中4種與通過TEPITOPE算法序列預測的恰好一致，除了沒有預測到肽1501可與DRB1*0401分子結合之外。
表7.DRB1*0401配體在轉基因小鼠中作為候選表位的證實突出了提出的DRB1*0401核心結合基序。
「-」不結合/T細胞應答；「+/-弱結合/T細胞應答；「+」中度結合/T細胞應答；「++」強結合/T細胞應答。
總之，對於用「反向免疫學」方法發現是可溶性DRB1*0401分子的配體的大多數肽，證實它在DRB1*0401轉基因小鼠中引發特異的CD4+應答。因此，6個候選表位中有5個是真正的DRB1*0401表位。另外，它們是混雜的(見表7和表7a)。其中3個(1501、1502、1503)已經在以前的文獻中描述，但不是作為DRB1*0401特異的表位。也發現2種DRB1*0401結合劑(57和59)和與DRB1*0404結合的3種肽(421、469、470)在來自CMV血清陽性供體的PBMC中可誘導INF-γ的產生(見實施例IV和VI)。總之，表明該表位捕獲方法能夠鑑定真正的T細胞表位。
表7a.使用可溶性DRB1*0401分子和HLA DR4轉基因小鼠鑑定人II類表位的總結
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1.分離具有結合MHC/HLA分子的能力的配體或含有該配體和該MHC/HLA分子的複合物的方法，其特徵在於下列步驟—提供配體集合，該集合含有可與該MHC/HLA分子結合的配體和不與該MHC/HLA分子結合的配體，—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合，從而使具有結合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結合，形成含有該配體和該MHC/HLA分子的複合物，—檢測該複合物，任選地使該複合物與不與該MHC/HLA分子結合的配體分離，和—任選地從該複合物中分離並表徵配體。
2.分離具有結合MHC/HLA分子的能力的T細胞表位或含有該表位和該MHC/HLA分子的複合物的方法，其特徵在於下列步驟—提供配體集合，該集合含有可與一種MHC/HLA分子結合的配體和不與該MHC/HLA分子結合的配體，—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合，從而使具有結合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結合，形成含有該配體和該MHC/HLA分子的複合物，—檢測該複合物，任選地使該複合物與不與該MHC/HLA分子結合的配體分離，—任選地從該複合物中分離並表徵配體，—用T細胞測定法測定任選地分離的該配體或該複合物之T細胞激活能力，和—提供具有T細胞激活能力的任選地分離的配體作為T細胞表位或複合物。
3.根據權利要求1或2的方法，其特徵在於該配體集合選自肽集合，特別是重疊肽的集合，蛋白質片段集合，糖脂的集合，鞘糖脂的集合，脂肽的集合，脂類的集合，聚糖的集合，修飾肽的集合，由抗原呈遞細胞獲得的集合，優選地是其總裂解物或級分的形式，特別是從這些細胞的表面或MHC/HLA分子上洗脫的級分，包含細胞特別是病原體細胞、腫瘤細胞或組織之片段的集合，包含肽庫的集合，由重組DNA文庫產生的，特別是來源於病原體或腫瘤細胞的(多)肽的集合，來自具體病原體的蛋白質和/或蛋白質片段的集合，或其混合物。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其特徵在於該MHC/HLA分子選自HLA I類分子、HLA II類分子、非傳統MHC/HLA和MHC/HLA-樣分子或其混合物，或它們的混合物。
5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其特徵在於利用一種方法表徵該複合物的配體，該方法選自質譜法，多肽測序，結合測定，特別是SDS-穩定性測定，通過用層析，特別是HPLC測定其保留因子鑑定配體，或其它光譜技術，特別是紫外線(UV)、紅外線(IR)、核磁共振(NMR)、圓二色性(CD)或電子自旋共振(ESR)，或其組合。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其特徵在於它與細胞因子分泌測定組合，優選地與Elispot測定、細胞內細胞因子染色、FACS或ELISA組合。
7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其特徵在於該T細胞測定包括該複合物與分離的T細胞混合併溫育，隨後測定分離的T細胞的細胞因子分泌或增殖。
8.根據權利要求1-6中任一項的方法，其特徵在於該T細胞測定包括測定激活標記特別是CD69、CD38的上調，或表面標記特別是CD3、CD8或TCR的下調。
9.根據權利要求1-8中任一項的方法，其特徵在於該T細胞測定包括特別是通過實時RT-PCR測定與T細胞激活有關的mRNAs的上調/下調。
10.根據權利要求1-8中任一項的方法，其特徵在於該T細胞測定選自測定T細胞受體下遊成分，特別是p56 lck、TCR的ITAMS和zeta鏈、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn和lyn的磷酸化/去磷酸化的T細胞測定，測定細胞內Ca++濃度或Ca++-依賴蛋白質激活的T細胞測定，測定免疫突觸形成的T細胞測定，測定效應分子特別是穿孔素、粒酶或granulolysin釋放的T細胞測定，或這些T細胞測定的組合。
11.可通過根據權利要求2-10中任一項的方法鑑定的T細胞表位，該T細胞表位選自含有序列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA或其組合的多肽。
12.具有T細胞激活能力的HLA A0201結合表位，其可以利用HLA A0201分子作為MHC/HLA分子，通過根據權利要求2-10中任一項的方法鑑定，該HLA A0201結合表位選自含有序列RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLES FCEDV或其組合的多肽。
13.含有序列RPHERNGFTV的肽在製備用於在B7陰性個體中激活T細胞的組合物中的用途。
14.含有序列DDVWTSGSDSDE的肽在製備用於在B35陰性個體中激活T細胞的組合物中的用途。
15.含有序列TPRVTGGGAM的肽在製備用於在B7陰性個體中激活T細胞的組合物中的用途。
16.可與II類HLA分子結合的肽，其選自根據表3的肽55-64、109、383、384、421、449-454、469和470。
17.根據權利要求11-16中任一項的表位或肽，其特徵在於它進一步含有1-30個、優選地2-10個、特別是2-6個天然存在的胺基酸殘基，特別是在N端、C端或在N端和C端。
18.根據權利要求11-17中任一項的表位或肽，其特徵在於它進一步在N端、C端或在N端和C端含有非天然存在的胺基酸，優選地1-1000個，更優選地2-100個，特別是2-20個非天然存在的胺基酸殘基。
19.根據權利要求11-18中任一項的表位或肽在製備用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的HLA限制疫苗中的用途。
20.根據權利要求11、17或18中任一項的表位在製備用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的疫苗中的用途。
21，用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的疫苗，其含有根據權利要求11、17或18中任一項的表位。
22.用於治療或預防巨細胞病毒(CMV)感染的HLA特異的疫苗，其含有根據權利要求11-18中任一項的表位或肽。
23.如權利要求19-22中任一項所述的疫苗，其特徵在於它進一步含有免疫調節物，優選地選自聚陽離子物質，特別是聚陽離子多肽，免疫調節核酸，特別是含有寡脫氧核苷酸的脫氧尿苷和/或脫氧肌苷，或其混合物。
24.如權利要求19-23中任一項所述的疫苗，其特徵在於它進一步含有一種藥學可接受的載體。
25.如權利要求19-24中任一項所述的疫苗，其特徵在於該表位以一種選自下列的形式提供肽、肽類似物、蛋白質、裸DNA、RNA、病毒載體、病毒樣顆粒、重組/嵌合病毒、重組細菌或用蛋白質/肽/RNA脈衝或用含有該表位的DNA轉染的樹突細胞。
26.T細胞、T細胞克隆或T細胞群體或製品，其特異識別根據權利要求11-18中任一項的表位或肽。
27.根據權利要求26的T細胞、T細胞克隆或T細胞群體或製品在鑑定不規則表位中的用途。
28.根據權利要求26的T細胞、T細胞克隆或T細胞群體或製品在製備用於治療CMV患者的組合物中的用途。
29.根據權利要求1-10中任一項的方法，其特徵在於抗原的配體或片段，特別是來自下列生物的抗原人類免疫缺陷病毒(HIV)，A型肝炎和B型肝炎病毒，C型肝炎病毒(HCV)，勞斯肉瘤病毒(RSV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，輪狀病毒，金黃色葡萄球菌，肺炎衣原體，沙眼衣原體，結核分枝桿菌，肺炎鏈球菌，炭疽芽孢桿菌，霍亂弧菌，瘧原蟲屬的種(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲等)，麴黴屬的種或白色念珠菌，腫瘤抗原或自身免疫抗原。
30.根據權利要求1-10和29中任一項的方法，其特徵在於該配體是具有結合MHC/HLA分子的能力的HCV-肽、HIV-肽、HAV-肽、HBV-肽、RSV-肽、EBV-肽、流感病毒肽或輪狀病毒肽。
全文摘要
描述了一種分離具有結合MHC/HLA分子的能力的配體和含有該配體和該MHC/HLA分子的複合物的方法，該方法包括下列步驟—提供配體集合，該集合含有可與該MHC/HLA分子結合的配體和不與該MHC/HLA分子結合的配體，—使該MHC/HLA分子接觸該配體集合，從而使具有結合該MHC/HLA分子的能力的配體與該MHC/HLA分子結合，形成含有該配體和該MHC/HLA分子的複合物，—檢測該複合物，任選地使該複合物與不與該MHC/HLA分子結合的配體分離，—任選地從該複合物中分離並表徵該配體，以及一種分離具有結合MHC/HLA分子的能力的T細胞表位的方法。
文檔編號A61K38/00GK1659436SQ03804846
公開日2005年8月24日 申請日期2003年2月27日 優先權日2002年2月28日
發明者C·克拉德, J·沙裡尚, O·維圖斯卡, W·扎內爾, M·伯恩斯特爾, G·艾奇格爾, A·奧塔維, F·瑪特尼爾 申請人:英特塞爾股份公司