一種製備無色透明的絲膠蛋白水凝膠的方法與流程

2023-06-24 07:36:11

本發明涉及組織工程材料領域，更特別的，涉及一種製備無色透明的絲膠蛋白水凝膠的方法。

背景技術：

水凝膠(Hydrogel)是以水為分散介質的凝膠，具有網狀交聯結構的水溶性高分子中存在疏水基團和親水基團，親水基團與水分子結合，將水分子連接在網狀內部，而疏水基團遇水膨脹的交聯聚合物。

絲膠蛋白(Silk Sericin)是包裹在絲素纖維表層的一種天然大分子粘性蛋白，約佔蠶繭含量的20-30％，由分子量為24-400kDa的多肽組成，其分子由絲氨酸、天門冬氨酸和甘氨酸等18種胺基酸組成。近年來，由於絲膠蛋白良好的生物相容性、對細胞具有粘附和保護作用等生物學性能，成為生物醫學領域新興的材料。

蛋白質的交聯主要分為兩類方法，化學交聯和酶交聯。常用的化學交聯劑有戊二醛和京尼平。常用於蛋白質交聯的酶有轉穀氨醯胺酶(TG)和多酚氧化酶(PPO)。

目前，主要使用化學交聯劑戊二醛和天然生物交聯劑京尼平將絲膠蛋白交聯成水凝膠支架，未見使用酶催化交聯的方法來製備水凝膠支架。

在中國，癌症已成為疾病死因之首，發病率和死亡率在持續上升，癌症已成為非常重要的公共健康問題。2015年中國預計有429.2萬例新發腫瘤病例和281.4萬例死亡病例。研究腫瘤細胞的生長增殖、侵襲、轉移和耐藥，是找到腫瘤治療靶點和藥物的重要手段。

傳統的針對腫瘤致病機制和腫瘤治療的研究所採用的二維(2D)研究模型是基於二維平面，難以模擬體內真實腫瘤的立體結構和內部環境。如果能建立體外三維(3D)腫瘤模型，並用於研究腫瘤細胞行為和對外界刺激及藥物的響應，則能更精確地反映真實體內腫瘤的情況。然而，目前沒有一種能夠構建體外3D腫瘤模型，並且適用於對這樣的腫瘤模型進行觀察、示蹤和研究的支載材料。

技術實現要素：

為解決以上問題，本發明提供了一種製備無色透明的絲膠蛋白水凝膠的方法，其特徵在於，使用HRP和H2O2催化絲膠蛋白交聯得到。

優選地，所述HRP的工作濃度為0.625-25U/mL。

優選地，所述H2O2的工作濃度為0.00075％-0.03％。

優選地，所述絲膠蛋白的濃度為2.5-40mg/mL。

優選地，所述方法包括以下步驟：

1)使用不含家蠶絲素的蠶絲製備成絲膠蛋白水溶液；

2)向所述絲膠蛋白水溶液中添加H2O2和HRP，得到預成膠液；

3)將所述預成膠液於37℃成膠，得到所述絲膠蛋白水凝膠。

優選地，所述蠶絲為由家蠶絲素缺失型蠶所生產的蠶絲。

本發明的絲膠蛋白水凝膠以及由其製備的支架，是一種全新的生物複合材料，不同於其他交聯劑形成的絲膠蛋白水凝膠，本發明採用全新的交聯劑和交聯方式形成的絲膠蛋白水凝膠為無色透明。基於此優良特性其可用於以下用途：

1.建立3D腫瘤模型，更真實而貼切地模擬體內真實腫瘤的結構，應用於腫瘤致病機制和腫瘤治療的研究；

2.作為細胞培養模型，其無色透明的特性能應用於細胞的直接觀察和示蹤；

3.作為腫瘤耐藥模型，更好地模擬腫瘤耐藥；

4.作為藥物和新合成化合物的篩選和研究平臺，其無色透明特性能夠更好地直接示蹤相應的藥物、新合成化合物。

本發明的絲膠蛋白水凝膠及其所製備的支架能夠更好地模擬體內真實腫瘤的立體結構和腫瘤微環境，為腫瘤致病機制、腫瘤耐藥、腫瘤治療的研究提供更貼近真實腫瘤情況的研究模型，此外還能夠用於3D細胞培養，也能夠應用於藥物和新合成化合物的篩選和示蹤。

附圖說明

圖1為絲膠濃度對絲膠蛋白水凝膠成膠時間影響的示意圖；

圖2為HRP濃度對絲膠蛋白水凝膠成膠時間影響的示意圖；

圖3為H2O2濃度對絲膠蛋白水凝膠成膠時間影響的示意圖；

圖4為絲膠蛋白水凝膠支架不同pH條件下的吸水膨脹率；

圖5為不同pH條件下絲膠蛋白水凝膠支架的降解情況示意圖；

圖6為不同溫度凍幹的絲膠蛋白水凝膠支架的掃描電鏡微觀結構示意圖；

圖7為不同溫度凍幹的絲膠蛋白水凝膠支架的孔徑統計柱狀圖；

圖8為不同交聯劑製備的絲膠蛋白水凝膠的外觀示意圖；

圖9為絲膠蛋白和絲膠蛋白水凝膠的紅外光譜分析結果；

圖10為絲膠蛋白和絲膠蛋白水凝膠的螢光光譜；

圖11為絲膠蛋白水凝膠搭載細胞的光鏡照片；

圖12為絲膠蛋白水凝膠的粘附細胞數目統計柱狀圖；

圖13為絲膠蛋白水凝膠上搭載細胞活力統計柱狀圖；

圖14為鬼筆環肽對絲膠蛋白水凝膠搭載細胞上的β-actin進行染色的免疫螢光照片；

圖15為絲膠蛋白水凝膠搭載的細胞體面積的柱狀統計圖；

圖16為絲膠蛋白水凝膠搭載的細胞體周長的柱狀統計圖；

圖17為絲膠蛋白水凝膠支架上種植細胞的共聚焦顯微鏡拍照示意圖；

圖18搭載HT-29細胞的3D絲膠蛋白水凝膠支架超微結構的電鏡照片、HE染色照片和結直腸癌組織的HE染色照片；

圖19為搭載HT-29細胞的3D絲膠蛋白水凝膠支架培養的第1天、第5天、第10天的光鏡照片和HE染色照片；

圖20為3D腫瘤模型的立體結構示意圖；

圖21為搭載HT-29細胞的3D絲膠蛋白水凝膠支架和結直腸癌組織的示意圖；

圖22為2D平面培養的細胞和3D絲膠蛋白水凝膠支架培養的細胞在裸鼠皮下成瘤實驗的示意圖；。

圖23為2D平面和3D絲膠蛋白水凝膠支架培養HT-29細胞對5-氟尿嘧啶耐藥情況示意圖；

圖24為2D平面和3D絲膠蛋白水凝膠支架培養HT-29細胞對塞來昔布耐藥情況的示意圖。

具體實施方式

以下結合實例和附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。

絲膠蛋白水凝膠和水凝膠支架的製備

本發明的絲膠蛋白水凝膠和水凝膠支架通過以下方法來製備：

1.製備絲膠水溶液

蠶絲來自家蠶絲素缺失突變品種的蠶繭(購於中國農業科學院蠶業研究所)。通過以下方法從該蠶繭製備絲膠水溶液：

1)稱取家蠶突變品種蠶繭1g並剪成1cm2的碎片，後置於潔淨的燒杯中，用超純水清洗3次，3500rpm離心5分鐘去除水份；

2)向步驟1)中得到的蠶繭碎片中加入55mL的濃度為6mol/L的LiBr水溶液，將該燒杯放入恆溫水浴鍋內35℃水浴24小時，溶解絲膠蛋白；

3)將步驟2)得到溶液轉入離心管內3500rpm離心5分鐘，用濾器去除不溶性物質，得到澄清的溶液；

4)向步驟3)得到的澄清溶液中加入1/4體積的Tris-HCl緩衝液(1mol/L，pH 9.0)；

5)將步驟4)中的溶液轉入到預處理好的透析袋(MWCO 3500)中，然後將透析袋兩端用夾子夾緊，放置於含有pH 9.0的0.001mol/L Tris-HCl緩衝液的燒杯中；將該燒杯置於攪拌器上慢速攪拌透析，每隔3小時換一次水，共透析48小時，其中最後一次使用超純水透析；

6)將5)中透析後的絲膠蛋白水溶液轉到離心管中，4000rpm離心5分鐘，去除沉澱；

7)將絲膠蛋白水溶液再裝入到透析袋中並將透析袋兩端用夾子夾緊，再將透析袋置於質量百分濃度為20％的PEG6000溶液中濃縮；將絲膠蛋白水溶液濃縮到濃度約為2％為止；

8)置於4℃冰箱保存備用。

2.製備H2O2工作液：將30％(v/v)的H2O2儲存液用超純水按1:100的比例稀釋為0.3％(v/v)的H2O2工作液。

3.製備濃度為1.25U/μL的HRP(避光)，1mg HRP相當於250U。

4.製備絲膠蛋白水凝膠

將H2O2工作液，1.25U/μL的HRP和絲膠水溶液(2％，w/v)按1:1:100的比例混勻後置於37℃成膠，置於37℃溫箱至少30分鐘以上，等待其交聯形成水凝膠。

5.將上述絲膠蛋白水凝膠放入模具中，製成厚度1cm直徑1cm的圓柱體形，成膠後置於-80℃，冷凍24h後取出；將樣品置於冷凍真空乾燥機中乾燥(根據樣品大小確定適宜的乾燥時間)，得到絲膠蛋白水凝膠支架。

不同絲膠濃度，不同濃度HRP，不同H2O2濃度對成膠時間的影響

按照上述方法和參數，分別使用不同的絲膠工作濃度(2.5、5、10、20、28和40mg/mL)，不同的HRP工作濃度(0.625、1.25、1.875、2.5、3.125、6.25、12.5和25U/mL)以及不同的H2O2工作濃度(0.00075％、0.0015％、0.00225％、0.00375％、0.0075％、0.015％和0.03％)，最終按照上述方法製備不同的絲膠蛋白水凝膠，測定其成膠時間。結果如圖1-3所示，在所測量絲膠的濃度內成膠時間隨著絲膠蛋白的濃度升高而縮短，約為6-80s，在所測量HRP的濃度內成膠時間隨著HRP的濃度升高而縮短，約為6-130s，在所測量H2O2的濃度內成膠時間隨著H2O2的濃度升高而延長，約為44-120s。

支架的37℃吸水膨脹率

將以上製備的支架稱重，並分別浸泡於pH 3，pH 7.4，pH 11的PBS中，置於37℃浸泡24h後取出，按以下公式測定：

其中，Ws為膨脹狀態下的重量，Wd為乾重。

結果如圖4所示，支架的吸水性能適中。

支架的降解

將支架置於pH3，pH7.4，pH11的PBS緩衝液中，每天更換pH緩衝液，在所示的時間點將樣品取出，乾燥，稱重和初始重量相比，計算降解率。結果如圖5所示，在pH7.4和pH11的緩衝液中，在前30天左右降解較快，在第100天左右完全降解。

支架的超微結構

將絲膠蛋白水凝膠分別在-20℃，-80℃，-196℃冷凍後再凍幹得到支架，採用掃描電子顯微鏡觀察其超微結構，結果如圖6所示，絲膠蛋白水凝膠支架存在大量微觀孔洞結構，這些孔洞結構能作為細胞外基質，提供細胞生長的微環境、促進營養物質的交換。

不同溫度凍幹對孔洞大小的影響

通過掃描電鏡觀察在-20℃，-80℃，-196℃冷凍後凍幹的支架的孔洞，測量並統計其孔洞大小。結果如圖6和7所示，隨著凍幹溫度降低，支架孔洞的孔徑越小。支架的孔洞結構是作為藥物載體和細胞載體進行營養和氣體交換的條件。

絲膠蛋白水凝膠的外觀

採用前述方法合成的絲膠蛋白水凝膠的外觀如圖8所示，採用HRP/H2O2交聯的絲膠蛋白水凝膠外觀無色透明，能夠作為細胞培養模型直接觀察細胞，也能夠應用於螢光或標記物質的直接觀察和示蹤，而採用戊二醛交聯的絲膠蛋白水凝膠有一定顏色會影響細胞培養的直接觀察和示蹤，採用京尼平交聯的絲膠蛋白水凝膠呈黑藍色無法進行細胞的直接觀察和示蹤，不適用於腫瘤培養模型。

絲膠蛋白和絲膠蛋白水凝膠的紅外光譜分析

利用傅立葉變換紅外光譜儀(Nexus,Thermal Nicolet,USA)測定絲膠蛋白和絲膠蛋白水凝膠的特徵峰。

如圖9所示：用HRP/H2O2交聯的絲膠蛋白水凝膠中的絲膠蛋白二級結構無明顯變化，絲膠蛋白水凝膠能很好地保持天然絲膠的構象。從特徵峰AmideⅠ,Amide Ⅱ,Amide III，Amide IV可以看出，絲膠蛋白和絲膠蛋白水凝膠的圖譜基本相同，上述特徵峰沒有明顯改變，表明絲膠蛋白水凝膠中的多肽二級結構與純絲膠蛋白中的相似，表明絲膠蛋白水凝膠能很好的維持絲膠蛋白的天然構象。

絲膠蛋白和絲膠蛋白水凝膠的螢光光譜測試

採用不同波長的激發光，分別測定絲膠蛋白和絲膠蛋白水凝膠的全光譜的發射光強度，結果如圖10所示，絲膠蛋白形成絲膠蛋白水凝膠後螢光強度減弱，而且其螢光波譜稍微紅移。

絲膠蛋白水凝膠搭載C2C12細胞(小鼠成肌細胞)

採用前述的方法製備絲膠蛋白水凝膠，將其均勻地鋪在細胞培養皿中，待其成膠後用無菌PBS緩衝液輕柔地洗三次，再用75％的乙醇浸泡數小時，然後再用無菌PBS緩衝液洗三次，將培養的細胞收集、重懸，以1×106的細胞數目種植於上述已經預包被絲膠蛋白水凝膠的培養皿中，以無絲膠蛋白水凝膠的培養皿為對照，置於37℃，CO2濃度為5％的細胞培養箱中培養，在0，1，2天採用顯微鏡在普光下對細胞進行拍照並計數統計，結果如圖11所示，絲膠蛋白水凝膠能很好地支持細胞粘附和增殖。

分別在第4小時，第8小時統計對照組和絲膠蛋白水凝膠組的粘附細胞數目，結果如圖12所示，絲膠蛋白水凝膠有良好的生物相容性且能夠支持細胞粘附。

分別在第2天，第3天採用MTT方法測定細胞活力，結果如圖13所示，與對照組相比，絲膠蛋白水凝膠生物相容性良好與正常培養皿相比無統計學差異。

種植細胞在絲膠蛋白水凝膠上粘附和存活

採用以上方法將細胞種植於已經預包被絲膠蛋白水凝膠的培養皿中，以未包被絲膠蛋白水凝膠的培養皿作為對照，置於37℃，CO2濃度為5％的細胞培養箱中培養10天後，採用4％多聚甲醛固定，進行鬼筆環肽染色顯示β-actin，並用DAPI標記細胞核，採用雷射共聚焦顯微鏡觀察拍照，結果如圖14所示，統計所有拍照視野的細胞體積並用Photoshop測量細胞大小，統計結果如圖15和圖16所示。與對照組相比，絲膠蛋白水凝膠能很好地支持細胞粘附和存活。

種植細胞在絲膠蛋白水凝膠支架上的增殖

採用前述的方法製備凍幹支架，將凍幹支架切成厚度為1mm，直徑為4.8mm的形狀，收集培養的細胞，用10μL培養基重懸細胞，按2×104的細胞數目種植於支架中央。種植的穩轉GFP的SHY5Y細胞用雷射共聚焦顯微鏡分別在第1天、第5天和第10天拍照後顯示細胞種植情況。結果如圖17所示細胞在支架中能夠立體分布生長。

在水凝膠支架上構建腫瘤模型

將HT-29細胞按照前述的方法種植到上述絲膠蛋白水凝膠支架中，培養10天後，採用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，進行HE染色，對照組是將HT-29細胞以1×106/只的細胞數目接種於裸鼠(6-8周的雄鼠)背部皮下，結果如圖18顯示採用絲膠蛋白水凝膠支架種植的腫瘤細胞與腫瘤組織的結構相似，與腫瘤組織一樣具有細胞外基質，能夠貼切地模擬腫瘤組織的立體結構和腫瘤微環境。分別在第1天、第5天和第10天進行拍照，結果如圖19所示。

以上構建的腫瘤模型的結構

將以上建立的腫瘤模型與腫瘤組織的立體結構相比較，如圖20的模式圖所示，在絲膠蛋白水凝膠支架建立的3D腫瘤模型中(圖21)，內部為壞死區，外部為增殖區，此結果與腫瘤組織的結構完全一致。

腫瘤模型的生長速度

分別採用前述的方法在普通細胞培養皿(2D)和3D絲膠蛋白水凝膠支架上培養細胞，在第5天和第10天採用MTT法測定細胞活力。將HT-29細胞以1×106/只的細胞數目接種於裸鼠背部皮下，所採用的裸鼠為6-8周的雄鼠，待成瘤後計為第0天，此後每天測量腫瘤的大小，以每天的腫瘤大小與第0天的腫瘤大小作比值，計算腫瘤的體內增殖作為體內組(in vivo)如圖22所示，結果顯示3D絲膠蛋白水凝膠支架建立的腫瘤模型反映的腫瘤增殖情況更接近於體內真實腫瘤的生長情況。

腫瘤細胞的耐藥性實驗

分別採用前述的普通細胞培養皿(2D平面)和3D絲膠蛋白水凝膠支架培養HT-29細胞，並分別用劑量為圖18所示的5-氟尿嘧啶(5-FU)和塞來昔布處理細胞，採用MTT法測定細胞活力來反映細胞耐藥情況，結果如圖23和24所示，相同劑量的5-氟尿嘧啶(5-FU)和塞來昔布作用於細胞後3D模型培養的細胞比2D培養的細胞存活率更高，說明3D絲膠蛋白水凝膠支架培養的細胞更加耐藥，更貼近真實腫瘤細胞耐藥的情況。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。