多色螢光物複合擴增str引物設計方法
2023-06-23 20:27:46
專利名稱：多色螢光物複合擴增str引物設計方法
技術領域：
本發明涉及一種體外一次性擴增多個DNA目的片段的引物設計方法。
背景技術：
短串聯重複序列(short tandem repeats，簡稱STR)是由2-7個鹼基對作為核心單位，串聯重複形成的一類微衛星DNA序列，其片段可採用PCR技術擴增。STR主要由於核心重複單位數目的變化形成了STR基因座的遺傳多態性，其等位基因可用銀染、螢光標記和放射顯影等技術分型。人類基因組中，平均每6～10kb就存在有一個STR基因座，為法醫個人識別和親子鑑定提供了高信息基因座的豐富來源。
STR基因座具有如下特點(1)在人類基因組中分布廣泛，(2)基因片段一般小於400bp，易於擴增並適用於陳舊、降解生物檢材的DNA分析，(3)檢測的靈敏度比小衛星VNTR基因座高十倍，適用於微量檢材的鑑定，(4)同一STR基因座的不同等位基因之間片段長度差別不大，優勢擴增不明顯。(5)不同STR基因座之間片段長度差別不大，擴增條件相似，可設計在同一反應體系中進行複合擴增，降低成本和檢材消耗，提高效率，(6)分析方法簡便、判型準確，分型程序明確規範，分型結果圖形簡單，有利於實現DNA分型的標準化和自動化，有利於分型結果的計算機儲存和交換。
複合擴增技術，也叫多重PCR(Multiplex PCR，mpxPCR)，就是在一個反應體系中有多對引物同時擴增多個目標序列。可大幅度地簡化操作程序、節省時間和試劑，特別是在法醫學鑑定中可以用極少量的檢材同時擴增出多個遺傳標誌而更顯其優越性。然而，隨著擴增體系中引物數量的增加，引物之間的相互影響越嚴重，反應動力學變得越複雜，使得複合擴增變得極為困難。目前這種直接混合引物的複合方法使複合的基因位點數目受到限制，已成為進一步增加複合擴增位點的頸瓶和難點，因而探索在不降低靈敏度的情況下複合更多的位點、條件易於優化的新方法對於法醫複合擴增的進一步發展很有必要。
基於檢測體系的不同，目前世界上將複合擴增主要可以分為兩大類銀染複合擴增和螢光複合擴增。銀染複合擴增是複合擴增後的產物利用普通電泳槽分離，利用硝酸銀進行染色檢測的方法。此方法較費時、自動化程度不高，準確性、重複性難以保證。螢光複合擴增是目前世界上用得最普遍的方法。它是在普通的複合擴增的PCR其中一條引物(任何PCR反應都必須有兩條引物)的一端加上螢光標記物，PCR擴增產物利用自動雷射螢光遺傳檢測儀進行檢測。所加的螢光標記物可以是多種，例如，與ABI310遺傳分析儀配套的螢光標記物就有5FAM，JOE，NED，ROX，VIC，PET，LIZ等。
螢光複合擴增較銀染複合擴增有以下幾個優點快速、靈敏、省時、準確、自動化程度高、可重複性強等。基於以上幾個原因，螢光複合擴增已成為目前世界上用得最普遍同時也是最先進的複合擴增方法。現在，國內外大多數實驗室進行螢光複合擴增都採用試劑盒化的方法，即購買試劑公司的螢光複合擴增試劑盒進行實驗。目前應用最多的是美國的Applied Biosystems公司和Promega公司的產品。他們的產品主要有以下幾種1.PowerPlexTM1.1(Promega公司)2.PowerPlexTM1.2(Promega公司)3.PowerPlexTM2.1(Promega公司).4.PowerPlexTM16(Promega公司)5.AmpFlSTR(PE AppliedBiosystems公司)6.AmpFlSTR Identifiler(PE Applied Biosystems公司)7.AmpFlSTR Profiler(PE Applied Bioststems公司)8.AmpFlSTR ProfilerPlus(PE Applied Biosystems公司)9.AmpFlSTR SGM Plus(PE AppliedBiosystems公司)10.Y-PlexTM6(Reliagene Technologies公司)。
但這些試劑盒在法醫學應用實踐中仍然存在以下問題(1)目前應用最多的是美國的Applied Biosystems公司和Promega公司的產品。AppliedBiosystems公司複合最多的商業化螢光複合擴增試劑盒是STRAmpFLSTRIdentifilerTMPCR Amplification Kit，包括15個STR基因座CSF1PO，D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317，D16S539，D18S51，D21S11，vWA，FGA，TH01，TPOX，D2S1338和D19S433；已涵蓋其全部的商業性STR位點。當採用這些試劑盒的客戶做親子鑑定需要增加遺傳標記時則遇到困難。Promega公司情況類似。(2)這些STR基因座都是基於中國群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開發的，其中有些基因座，比如TPOX，在中國群體的基因頻率分布較差，個人識別能力較低。(3)國外商品化試劑盒價格昂貴。
本申請人在中國發明專利申請02133812.4號中公開了一種複合擴增STR的引物設計方法，該方法以兩條非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)，作為一對短引物；同時，在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物對的5′端分別加上該對短引物，得到長引物對。上述方法中短引物的選取是關鍵，在選定短引物之後，一個待擴增的基因座的長引物也就相應被選定。這是因為，長引物中的能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物實際上就是可以與待擴增基因座的人類基因組特異性結合的原始引物，它由待擴增基因座的人類基因組序列所決定，且因待擴增基因座的序列的不同而不同。在上述方法中，所設計的長、短引物能夠用於在同一PCR反應體系中同時對四個基因座的目的基因進行複合擴增。在複合擴增的第一階段，利用長引物擴增出同時帶有目的基因片段和與短引物配對的非人類基因組序列的產物；而在複合擴增第二階段，則利用一對短引物對多個基因座的目的基因片段同時進行擴增。利用上述方法設計的引物能夠大量擴增目的基因片段，且無需在實驗過程中繁瑣地調整各對引物的濃度，簡化了整個實驗過程，從而具有優點。但是，由於上述方法仍然屬於銀染複合擴增方法，在對擴增結果進行檢測時，必然存在著前面述及的費時、自動化程度不高，準確性較差等弊病，雖然其對實驗設備的要求不高，符合當前中國大多數分子生物學實驗室的需要，但卻不能滿足已經具有自動雷射螢光遺傳檢測儀的實驗室的更高要求。因此，上述現有方法仍然有待改進。
發明內容
本發明的目的是在沿用上述現有方法基本思路的基礎上，重新設計出用於螢光複合擴增的短引物。
本發明的方法是以公共的一條短引物YPA′YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，與以下四條在5′端分別加有螢光標記物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一構成短引物對YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)構成與短引物對YPA′、YPB1′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB1-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)構成與短引物對YPA′、YPB2′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB2-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)構成與短引物對YPA′、YPB3′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB3-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)構成與短引物對YPA′、YPB4′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB4-P2。
在本發明中，上述螢光標記物F1、F2、F3、F4的成份和顏色各不相同，它們均可以直接採用前述與螢光遺傳檢測儀配套的現有螢光標記物，如5FAM、VIC、NED、PET等。
此處，我們選取的4條短引物(YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′)不能形成引物二聚體，都是非人類基因組序列，它們的物理動力學特性相似。
上述1條公共短引物分別與4條短引物構成了4對短引物，即YPA′和YPB1′、YPA′和YPB2′、YPA′和YPB3′、YPA′和YPB4′，而除公共短引物YPA′之外的4條不同的短引物上分別加有不同顏色的螢光標記物。
依照前述專利申請所介紹的方法，每對短引物可擴增4個不同的基因座，那麼4對不同的短引物就可以擴增16個不同的基因座。單對短引物的複合擴增過程及原理與前述專利申請完全相同，只是短引物的結構與以前不同，與短引物相對應的長引物也與以前不同。
同時，利用前述專利申請介紹的方法，單個複合PCR反應中可以同時擴增4基因座，此時體系中有1對短引物，4對不同基因座特異性的長引物。依此類推，如果我們想要擴增8個基因座，就需要2對不同的短引物和8對不同基因座特異性的長引物；同理，當擴增12個基因座時，就需要3對不同的短引物和12對不同基因座特異性的長引物；當擴增16個基因座時，則需要4對不同的短引物和16對不同基因座特異性的長引物。當然，此處所使用的短引物對已不再是前述專利申請中所給出的短引物對，而是本發明所給出的短引物對(每個短引物對均由一個公共短引物和一個含有螢光標記物的短引物構成)。同時，雖然此處所使用的長引物對也是按前述專利申請所介紹的方法得到，但其卻是與本發明所給出的短引物對相對應的長引物對。
利用本發明中所提供的短引物和與之對應的長引物對目的基因座進行複合擴增後，擴增產物的DNA的片段的大小不同、相互分離並含有螢光標記物，從而可以利用螢光遺傳檢測儀進行檢測。
在本發明中，分別由上述YPA′和YPB1′、YPA′和YPB2′、YPA′和YPB3、YPA′和YPB4′構成4對短引物之後，具有以下幾個優點(1)4對引物中有一條公共引物YPA′，總的短引物數目是5條，這5條短引物就能實現同時對16個不同的基因座進行擴增；國外其他人用8條短引物擴增16個基因座，本發明方案中的短引物數目有所下降。而在複合擴增體系中，引物數越少越有利於PCR的進行。(2)上述加有螢光標記物的短引物的結構相似，每條引物間只相差5個鹼基，引物間相互的反應的可能性相對較小，有利於複合PCR的進行。
我們是按照如下原則設計公共引物序列的(1)公共引物與人類基因組無同源性；(2)不低於特異引物的退火溫度；(3)公共引物之間及其與特異引物之間不形成引物二聚體；(4)不形成穩定的二級結構。
另外，本發明在公共短引物YPA′的5′端設置了序列GTTCTT。設置該段序列的目的是(1)由於引物對中的另外一條短引物的5′端都加上了螢光標記物，因此加入該段序列可以平衡各個引物對。(2)實驗證明，設置該段序列有利於複合擴增的進行，結果更好。
在本發明中，實際上是將上述公共短引物YPA′中的螢光標記物去掉，就得到長引物中使用的基因組序列YPA。另外，將短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′中的序列GTTCTT去掉，就得到長引物中使用的基因組序列YPB1、YPB2、YPB3、YPB4。
與前述專利申請相同的是，在本發明中，長引物中能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2實際上就是可以與待擴增基因座的人類基因組特異性結合的原始引物。亦即是說，引物P1、P2的序列由待擴增基因座的人類基因組序列所決定，且因待擴增基因座的序列的不同而不同。同時，對於給定的待擴增基因座來說，其原始引物均已在網際網路上GDB基因資料庫中公布，公眾可以方便地從該基因資料庫查到與待擴增基因座相對應的原始引物。
與前述現有技術相比較，本發明所設計的引物可以在同一反應體系中同時對16個不同的基因座進行擴增，各短引物的結構相似，每條引物間只相差5個鹼基，總的短引物數目僅為5條，引物間相互的反應的可能性相對較小，有利於複合PCR的進行，從而能夠高效率地大量擴增目的基因片段，實驗結果的可重現性極高。
本發明的內容結合以下實施例作更進一步的說明，但本發明的內容不僅限於實施例中所涉及的內容。
具體實施例方式
實施例1在本實施例中，我們選用以下四個基因座DYS434，A10，DYS438，DYS439為一組，標記一種顏色的螢光。短引物對為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)在本實施例的YPB1′中，螢光標記物F1為市售的現有紅色螢光標記物ROX，其分子式為 長引物YPA-P1和YPB1-P2為分別在能夠與基因座DYS434、A10、DYS438和DYS439的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB1而得到的基因組序列。網際網路上GDB基因資料庫中公布的DYS434基因座的原始引物P15』-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3』P25』-GGAGATGAATGAATGGATGGA-3』A10基因座的原始引物P15』-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3』P25』-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3』DYS438基因座的原始引物P15』-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3』P25』-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3』DYS439基因座的原始引物P15』-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3』P25』-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3』在長引物YPA-P1和YPB1-P2中，YPA和YPB1為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)
與之相對應，本實施例中的DYS434、A10、DYS438和DYS439基因座長引物如下表所示基因座 長引物DYS4345′YPA-CACTCCCTGAGTGCTGGATT5′YPB1-GGAGATGAATGAATGGATGGAA10 5′YPA-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT5′YPB1-CCTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATADYS4385′YPA-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA5′YPB1-GTGGCAGACGCCTATAATCCDYS4395′YPA-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT5′YPB1-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT亦即是說，對應於上述各基因座，本實施例中採用的長引物為DYS434基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CACTCCCTGAGTGCTGGATT-3′YPB1-P25′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GGATGAATGAATGGATGGA-3′A10基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTGCCATCTCTATTTATCTTGCATATA-3』YPB1-P25-′TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-ATAAATGGAGATAGTGGGTGGATT-3』DYS438基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TGGGGAATAGTTGAACGGTAA-3』YPB1-P25′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GTGGCAGACGCCTATAATCC-3』DYS439基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TCCTGAATGGTACTTCCTAGGTTT-3』YPB1-P25′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-GCCTGGCTTGGAATTCTTTT-3』為進一步說明本實例中所設計引物的使用方法和使用效果，下面繼續說明本實施例中所設計的引物用於複合擴增反應時的具體過程。
複合擴增反應在Taq酶(華美，國產)PCR反應體系中進行總體積37.5μl，DNA模板約3ng、dNTP 7.5μL(0.2mMol/l)、Taq酶(華美，國產)3u、10Xbuffer 3.75μl、Mg2+3μl(2.25mmol/L)、BSA 3.751μl、引物混合物(*)2.8μL。
以下為擴增參數(注當體系升溫到94℃時開始加Taq酶)94℃3分鐘94℃30秒56℃1分鐘72℃30秒4個循環90℃30秒56℃30秒72℃30秒22個循環60℃4 30分鐘4℃ 保存在具體進行複合擴增時，每一個複合擴增體系在擴增中實際包含兩個連續的反應過程。
第一個過程基因組模板DNA在94℃變性3分鐘後，94℃30秒、58℃50秒和72℃30秒循環10個周期。這個過程是5』端加有非人類基因組序列的位點特異性引物在起作用，啟動複合擴增反應，將四個目標靶序列擴增，同時將非人類基因組序列整合到所擴增的片段上。
第二個過程上一過程的擴增產物做為PCR反應的模板DNA，90℃30秒、58℃50秒和72℃30秒循環22個周期。這一過程以非人類基因組公共序列主起引發延伸的作用，使得擴增反應繼續進行。這一過程中雖然擴增的目標靶序列長度有所不同，但只有一對引物在起作用，實際上是將四重複合擴增反應轉變成了「一重擴增反應」。最後72℃保溫7分鐘。
上述複合擴增後所得到的PCR產物利用ABI310遺傳分析儀(PE美國)檢測分析。PCR產物0.4μl，GS500 ROX size standard 0.2μl，Hi-DiTMformamide13μl，混勻編號，放入自動進樣盤。電進樣15000V、5s。電泳15000v，24分鐘。Date Collection軟體收集數據，Genescan3.7分析數據，用修改過的ABI AmpFISTR PLUS kit Kazam macro在Genetype3.7自動分型。等位基因的辨認通過與等位基因分型標準物比較來確認，窗口範圍+/-0.5bp。
其間，對PCR產物進行電泳分離用T＝8％、C＝5％長度20cm的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離PCR產物。1×TBE作電泳緩衝液，取2μl擴增產物加等量載樣緩衝液，以GeneRulerTM50bp作為DNA分子鹼基數量標準，以自制等位基因ladder作為分型標準物。恆壓750V電泳2個小時。
實施例2在本實施例中，我們選用以下四個基因座DYS453、DYS513、DYS19和DYS463為一組，標記一種顏色的螢光。
短引物對為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)在本實施例的YPB2′中，螢光標記物F2為市售的現有黃色螢光標記物NED，其分子式為 長引物YPA-P1和YPB2-P2為分別在能夠與基因座DYS453、DYS513、DYS19和DYS463的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB2而得到的基因組序列。網際網路上GDB基因資料庫中公布的DYS453基因座的原始引物P15′-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′P25′-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′DYS513基因座的原始引物P15′-ATTGATCCATCCGTCTGTCC-3′P25′-GTTGGATGAAGGGAGAGCAG-3′DYS19基因座的原始引物
P15′-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′P25′-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′DYS463基因座的原始引物P15′-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGACA-3′P25′-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′在長引物YPA-P1和YPB2-P2中，YPA和YPB2為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)與之相對應，本實施例中的DYS453、DYS513、DYS19和DYS463基因座長引物分別為DYS453基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGTAACAGAACAAGACAGT-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-CTAAAAGTATGGATATTCTTCG-3′DYS513基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-ATTGATCCATCCGTCTGCC-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-GTTGGATAAGGGAGAGCAG-3′DYS19基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CTACTGAGTTTCTGTTATAGT-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGGCATGTAGTGAGGACA-3′DYS463基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AATTCTAGGTTTGAGCAAAGAGA-3′YPB2-P25′-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-ATGAGGTTGTGTGACTTGACTG-3′本實例中所設計引物的使用方法和使用效果與實施例1相類似，擴增體系及擴增參數也與實施例1相同，故從略。
實施例3在本實施例中，我們選用以下四個基因座DYS456、DYS520、DYS447和DYS552為一組，標記一種顏色的螢光。
短引物對為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)
YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)在本實施例的YPB3′中，螢光標記物F3為市售的現有綠色螢光標記物JOE，其分子式為 長引物YPA-P1和YPB3-P2為分別在能夠與基因座DYS456、DYS520、DYS447和DYS552的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB3而得到的基因組序列。網際網路上GDB基因資料庫中公布的DYS456基因座的原始引物P15』-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3』P25』-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3』DYS520基因座的原始引物P15』-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3』P25』-ACCATCATGCCCTGCAATA-3』DYS447基因座的原始引物P15』-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3』P25』-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3』DYS552基因座的原始引物P15』-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3』P25』-AACACCTGATGCCTGGTTG-3』在長引物YPA-P1和YPB3-P2中，YPA和YPB3為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)與之相對應，本實施例中的DYS456、DYS520、DYS447和DYS552基因座長引物分別為DYS456基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCCATCAACTCAGCCCAAAAC-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGACCTTGTGATAATGTAAGATA-3′DYS520基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-AACAGCCTGCCCAACATAGT-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-ACCATCATGCCCTGCAACA-3′DYS447基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGGCTTGCTTTGCGTTATCT-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-GGTCACAGCATGGCTTGGTT-3′DYS552基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CCATAGTGCCGAGGTCAAGT-3′YPB3-P25′-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-AACACCTGATGCCTGGTTG-3′本實例中所設計引物的使用方法和使用效果與實施例1相類似，擴增體系及擴增參數也與實施例1相同，從略。
實施例4在本實施例中，我們選用以下四個基因座DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510為一組，標記一種顏色的螢光。
短引物對為YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；在本實施例的YPB4′中，螢光標記物F4為市售的現有藍色螢光標記物FAM，其分子式為
長引物YPA-P1和YPB4-P2為分別在能夠與基因座DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510的原始引物P1、P2的5′端加上YPA、YPB4而得到的基因組序列。網際網路上GDB基因資料庫中公布的DYS523基因座的原始引物P15′-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′P25′-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′DYS443基因座原始引物P15′-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′P25′-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′YGATA-A8基因座原始引物P15′-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′P25′-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′DYS510基因座原始引物P15′-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′P25′-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′在長引物YPA-P1和YPB4-P2中，YPA和YPB4為YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)與之相對應，本實施例中的DYS523、DYS443、Y-GATA-A8和DYS510基因座長引物分別為DYS523基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-GGTCAGCAGTGAAAGATAGGC-3′YPB4-P25′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCCATCCATCCATCTACCTG-3′DYS443基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTCATTGGCCACCTGACATTAC-3′YPB4-P25′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-CGCTTCCATTTACACTTCCTGTG-3′Y-GATA-A8基因座長引物YPA-P15′ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-CGGCATCTATCTATGTGTCTGTC-3′YPB4-P25′TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-AGTAGATACAAAGAGAGCATAGACAAAT-3′
DYS510基因座長引物YPA-P15′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-TTTTTCCTCCCTTACCACAGA-3′YPB4-P25′-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-TCTGGAGAAGACAGAACTTGTCA-3′本實例中所設計引物的使用方法和使用效果與實施例1相類似，擴增體系及擴增參數也與實施例1相同，從略。
需要說明的是，也可以將以上實施例1、實施例2、實施例3和實施例4中所給出的長、短引物放在一個擴增體系中使用，利用它們在同一體系中同時對實施例1、2、3、4中所涉及的16個不同的基因座進行複合擴增。同時，各短引物中的螢光標記物可以互換，如在實施例1中，YPB1′中的螢光標記物F1採用的是市售的現有螢光標記物ROX，但該螢光標記物F1也可採用實施例2中所給出的螢光標記物NED、實施例3中所給出的螢光標記物JOE和實施例4中所給出的螢光標記物FAM。依次類推，實施例2、3、4中的螢光標記物F2、F3、F4也可進行更換。
權利要求
1.一種多色螢光物複合擴增STR引物設計方法，其特徵是以公共的一條短引物YPA′YPA′(5′--GTTCTT-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)，與以下四條在5′端分別加有螢光標記物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一構成短引物對YPB1′(5′--F1-TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)YPB2′(5′--F2-TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)YPB3′(5′--F3-TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)YPB4′(5′--F4-TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB1(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)構成與短引物對YPA′、YPB1′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB1-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB2(5′--TAATACGACTCAGTATAGGGACAG-3′)構成與短引物對YPA′、YPB2′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB2-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB3(5′--TAATACGACTCAATATAGGGATAA-3′)構成與短引物對YPA′、YPB3′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB3-P2；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB4(5′--TAATACGACTCATTATAGGGAAAT-3′)構成與短引物對YPA′、YPB4′配合使用的長引物對YPA-P1和YPB4-P2。
全文摘要
一種多色螢光物複合擴增STR的引物設計方法，其特徵是以公共的一條短引物YPA′與四條在5′端分別加有螢光標記物F1、F2、F3、F4的短引物YPB1′、YPB2′、YPB3′、YPB4′之一構成短引物對；分別在能夠與人類基因組序列特異性結合的寡核苷酸引物P1、P2的5′端加上一段非人類的基因組序列構成與短引物對配合使用的長引物對。與現有技術相比較，本發明所設計的引物可以在同一反應體系中同時對16個不同的基因座進行擴增，各短引物的結構相似，每條引物間只相差5個鹼基，總的短引物數目僅為5條，引物間相互的反應的可能性相對較小，有利於複合PCR的進行，從而能夠高效率地大量擴增目的基因片段，實驗結果的可重現性極高。
文檔編號C12Q1/68GK1477207SQ0313537
公開日2004年2月25日 申請日期2003年7月9日 優先權日2003年7月9日
發明者侯一平, 吳謹, 應斌武, 張, 李英碧, 石美森, 顏靜 申請人:四川大學