用於中性粒細胞介導的疾病的治療方法的組胺結合化合物的製作方法

2023-06-24 03:55:46

專利名稱：用於中性粒細胞介導的疾病的治療方法的組胺結合化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療中性粒細胞介導的疾病的新方法。該方法包括將組胺結合化合物以治療有效量給予患有這樣一種疾病的患者。
所有此處引用的出版物、專利及專利申請均通過引用完全結合到本文中。
許多炎症的及自身免疫性疾病都以中性粒細胞匯聚於疾病部位為特徵。在一些情況下這種匯聚並不適當而且損害正常組織。
在中性粒細胞-介導的許多類型疾病中，組織損傷被認為與活化的中性粒細胞釋放的氧化自由基有關(Dahlgren C，Karlsson A.Respiratory burst in human neutrophils(人類中性粒細胞中呼吸功能的打斷)，J Immunol Methods 1999 Dec 17；232(1-2)3-14)並且可用組織髓過氧化物酶(MPO)活性對此進行定量。
中性粒細胞介導的疾病的實例包括成人呼吸窘迫症候群(ARDS)；嬰兒呼吸窘迫症候群(IRDS)；嚴重急性呼吸症候群(SARS)；慢性阻塞性氣道疾病(COPD)；囊性纖維化；呼吸機誘發的肺損傷(VILI)；毛細血管漏症候群；再灌注損傷，包括血栓性中風、冠狀動脈血栓形成、心肺分流術(CPB)、冠狀動脈旁路移植術(CABG)、四肢或指(趾)再植術、器官移植術、分流術腸炎、分流術關節炎、熱損傷及擠壓傷之後的損傷；術後炎症或邊緣性浸潤，牛皮癬；牛皮癬性關節病；類風溼性關節炎；Crohn’s病；潰瘍性結腸炎；免疫性血管炎，包括Wegener’s肉芽腫病及Churg-Strauss病；酒精性肝病；中性粒細胞介導的腎小球腎炎；系統性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎；動脈粥樣硬化；系統性硬化病；痛風；牙周病，眼部炎症包括乾眼、Sjogren’s症候群、隱形眼鏡相關的乳頭狀結膜炎(CLAPC)、隱形眼鏡相關的邊緣性浸潤，術後炎症包括白內障、青光眼、角膜移植術及雷射原位角膜磨鑲術(LASIK)的手術後炎症，嚴重過敏性結膜炎，春季角結膜炎(VKC)，瀰漫性片狀角膜炎，傳染性及非特異性結膜炎，角膜炎及瞼炎，及shield ulcers。
雖然已知組胺涉及事實上所有過敏性及炎症性過程，但以前並沒有暗示組胺在中性粒細胞介導的疾病中有任何作用。雖然已有某些抗組胺劑被測試用來拮抗這種天然的疾病，但是這些藥物的靶位是組胺受體，而不是組胺本身。而且，即使被用於聯合其它藥物治療，在內毒素-誘導的肺損害動物模型的測試中這樣的藥物作用也有限(Byrne K，Sielaff TD，Michna B，Carey PD，Blocher CR，Vasquez A，Sugerman HJ.Crit Care Med.1990 Mar；18(3)303-8；Byrne K，SielaffTD，Carey PD，Tatum JL，Blocher CR，Vasquez A，Hirsh JI，Sugerman HJ，Circ Shock.1990 Feb；30(2)117-27；Sielaff TD，Sugerman HJ，Tatum JL，Kellum JM，Blocher CR.，J Trauma.1987 Dec；27(12)1313-22；SielaffTD，Sugerman HJ，Tatum JL，Blocher CR.，Surgery.1987 Aug；102(2)350-7)。人類治療方案不包括用組胺阻斷劑治療這種性質的疾病(Bernard GR，Artigas A，Brigham KL，Carlet J，Falke K，Hudson L，LamyM，Legall JR，Morris A，Spragg R.Am J Respir Crit Care Med 1994 Mar；149(3 Pt 1)818-24)。
中性粒細胞-介導的疾病是重要的健康問題並且與顯著的發病率及死亡率有關。現有的治療這些疾病的方法不是很有效。現在本發明者發現用直接結合於組胺的藥物並逐漸將血管活性胺滴定至系統外可非常有效地治療這些疾病。
因此，本發明提供治療患者中性粒細胞介導的疾病的方法，包括將治療有效量的組胺結合化合物給予病人。
本發明者發現通過將組胺從疾病部位完全清除，就可抵消中性粒細胞-介導的疾病。這種情況只可能發生在用與組胺有高度親和力的藥物結合的時候，這部分解釋了為何先前沒有識別出這些狀態下組胺的作用；這類組胺結合劑只是最近才發現而沒有被廣泛使用。雖然先前的研究利用結合於組胺受體的藥物探討組胺的潛在作用，但只注意到邊緣效應。現回顧分析，沒能影響測試狀態可能是因為存在不同組胺受體(H1、H2、H3、H4及其它可能尚未發現的受體)。藥物的靶位是組胺受體而不是組胺分子本身，因此，藥物無效並忽略了組胺在這些疾病中的作用。
中性粒細胞在骨髓中產生及發育成熟並從該組織移行到其作用部位。一旦它們到達這一部位，它們的正常作用是破壞入侵的病原體，表現為通過例如調理作用或補體系統等過程的清除。它們通過釋放細胞毒性氧化自由基及吞噬作用來完成。它們還清除調亡的損傷組織細胞。只有當它們被數量或質量上不適當的化學引誘劑信號吸引時它們才會攻擊正常細胞並引起以中性粒細胞介導疾病為特徵的損害。我們所注意到的是組胺在引發這樣的不適當化學引誘劑信號發生中可能很重要。
已知中性粒細胞表達組胺受體(Wescott S，Kaliner M.，Inflammation1983 Sep；7(3)291-300；Burde R，Seifert R，Buschauer A，SchultzG.，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacoll 989 Dec；340(6)671-8)。但是，因為這種化合物被代謝及從循環中很快清除，所以組胺不可能在中性粒細胞從它們在骨髓中產生及發育成熟的部位移行中起重要作用(Ferreira SH，Ng KK，Vane JR.，Br J Pharmacol.1973 Nov；49(3)543-53)。雖然本發明者不希望受任何特殊理論的約束，但認為更可能的是組胺可能通過吸引中性粒細胞至疾病部位的其它不同機制發揮作用，而已知它們本身至少部分是組胺依賴性的。這些機制可包括，特別是血管內皮細胞粘附分子的表達(Jones DA，Abbassi O，McIntireLV，McEver RP，Smith CW.，Biophys J 1993 Oct；65(4)1560-9)，對趨化因子細胞因子-誘導的中性粒細胞化學引誘劑的抑制(Harris JG，Flower RJ，Watanabe K，Tsurufuji S，Wolitzky BA，Perretti M.，BiochemBiophys Res Commun 1996 Apr 25；221(3)692-6)，LTB4的釋放(Takeshita K，Sakai K，Bacon KB，Gantner F.J Pharmacol Exp Ther.2003 Dec；307(3)1072-8)及T淋巴細胞IL-16的釋放(Gantner F，SakaiK，Tusche MW，Cruikshank WW，Center DM，Bacon KB，J Pharmacol ExpTher.2002 Oct；303(1)300-7)。以前已證明這些活化作用通過不同組胺受體介導並存在相當多重疊以致於，例如，IL-16的釋放可能由H2和H4受體控制。可能還有更多組胺受體有待鑑別。
此外，現在有證據說明在酵母多糖-誘導的中性粒細胞從骨髓移行過程中，在血管內皮及組胺H4受體上L-選擇素粘附分子表達中組胺的重要作用(Takeshita K，Bacon KB，Gantner F.J Pharmacol ExpTher.2004 Mar 2[Epub ahead of print])。這些新近數據共同支持組胺通過許多受體，但最重要的是H4受體，在中性粒細胞募集和活化及它們所涉及的人類疾病不同模式中所發揮的作用。
由於系統的重複和雜亂，所以阻斷單一組胺受體類型不可能防止中性粒細胞的募集而這可能是至今為止測試的組胺拮抗劑明顯失敗的原因之一。相反，清除游離組胺的化合物將防止藥物與其任何受體接觸，包括那些尚未發現的受體。這一特性使其能作為有用的治療劑而起效。
許多疾病由中性粒細胞介導，包括過敏性、炎症性及自身免疫性疾病。具體地說，重要的中性粒細胞-介導的疾病包括成人呼吸窘迫症候群(ARDS)；嬰兒呼吸窘迫症候群(IRDS)；嚴重急性呼吸症候群(SARS)；慢性阻塞性氣道疾病(COPD)；囊性纖維化；呼吸機誘發的肺損傷(VILI)；毛細血管漏症候群；再灌注損傷，包括但不限於血栓性中風、冠狀動脈血栓形成、心肺分流術(CPB)、冠狀動脈旁路移植術(CABG)、四肢或指(趾)再植術、器官移植術、分流術腸炎、分流術關節炎、熱損傷及擠壓傷之後的損傷；術後炎症或邊緣性浸潤，牛皮癬；牛皮癬性關節病；類風溼性關節炎；Crohn’s病；潰瘍性結腸炎；免疫性血管炎，包括但不限於Wegener’s肉芽腫病及Churg-Strauss病；酒精性肝病；中性粒細胞介導的腎小球腎炎；系統性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎；動脈粥樣硬化；系統性硬化病；痛風；牙周病，眼部炎症包括乾眼、Sjogren’s症候群、隱形眼鏡相關的乳頭狀結膜炎(CLAPC)、隱形眼鏡相關的邊緣性浸潤，術後炎症包括白內障、青光眼、角膜移植術及雷射原位角膜磨鑲術(LASIK)的手術後炎症，嚴重過敏性結膜炎，春季角結膜炎(VKC)，瀰漫性片狀角膜炎，傳染性及非特異性結膜炎，角膜炎及瞼炎，及shield ulcers。本領域技術人員將了解其它的中性粒細胞-介導的疾病。根據本發明可治療這些疾病中的任何一種。
本發明的方法中所用的組胺結合化合物應充當組胺清除劑，結合於組胺分子從而將組胺滴定至系統外。這樣的清除劑如此「mopsup」出現在疾病或損傷部位系統的組胺。
優選組胺結合化合物應以至少10-5M的親和力結合於組胺，更優選小於10-6M，小於10-7M，小於10-8M，小於10-9M，小於10-10M或更小。國際專利申請WO97/44451中給出了允許測試試驗化合物對組胺親和力的合適的組胺結合測定法。
優選組胺結合化合物應對血管活性胺，特別是組胺有特異性。測量特異性的方法將為本領域技術人員所了解並包括競爭測定法等。優選地，組胺結合化合物表現出的對組胺的親和力與無關化合物所表現出的相比大100倍，更優選大103倍，104倍，105倍，106倍或更大。
本發明用的組胺結合化合物可以是合成化合物，或天然化合物例如蛋白質。已知許多蛋白質對組胺表現出特異性的高親和力結合。一種可能是用組胺特異性抗體，或抗體片段。優選蛋白質是參考國際專利申請WO97/44451中血管活性胺結合分子的化合物，該專利申請的內容通過引用完全結合到本文中。術語「血管活性胺結合分子」欲包括(a)任何以小於10-7M的解離常數特異結合於組胺、並和國際專利申請號WO97/44451中公開的蛋白MS-HBP1、FS-HBP1及FS-HBP-2屬於同一蛋白質家族的血管活性胺結合蛋白，其中如果蛋白質初級的、成熟的單體序列不超過260個胺基酸並且在該蛋白質全序列中至少30個胺基酸被作為同一殘基保存在那種蛋白質及蛋白質MS-HBP1、FS-HBP1和FS-HBP-2排列中，那麼就認為該蛋白質屬於這個蛋白質家族，優選該排列用ClustalW(Thompson等，1994，NAR，22(22)，4673-4680)或類似的序列排列程序獲得；(b)以小於10-7M的解離常數特異結合於組胺的吸血節肢動物的蛋白質，並且其中包含序列基元D/E AW K/R(優選DAWK，更優選QDAWK)及Y/C E/D L/I/F W(優選Y/C ELW)；(c)上文(a)或(b)中定義的蛋白質的天然生物變異體，例如等位基因變異體或地理學的變異體；(d)上文(a)、(b)或(c)中定義的蛋白質的功能等價物，包括不影響對組胺結合的生物學功能的野生型蛋白質序列中單個或多個胺基酸的取代、添加、插入和/或缺失，和/或化學修飾胺基酸的取代；(e)上文(a)、(b)、(c)或(d)中定義的蛋白質的活性片段，其中「活性片段」表示保留有對組胺結合的生物學功能的截短的蛋白質；和(f)含有與肽或其它蛋白質，例如標記物，可以是例如生物活性的、放射性的、酶的或螢光的、或抗體融合的上文(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中定義的蛋白質的融合蛋白質。
特別優選在WO97/44451中提到的蛋白質FS-HBP2(也稱為EV131)，或其在上文(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中所敘述的變異體或活性片段。該蛋白質以高親和力及特異性結合於組胺並且此處顯示在中性粒細胞-介導疾病的動物模型中是有效的。
根據上文(e)的活性片段應包含至少n個負責結合於組胺的蛋白質序列的連續胺基酸，並根據具體系列，優選n為7或更多(例如，8，10，12，14，16，18，20，50，100，150，200，250或更多)。這樣的片段可以是「獨立存在的(free-standing)」，即不是其它胺基酸或多肽的一部分或不與它們融合，或它們可以形成一個部分或區域被包含在更大的多肽內。當被包含在更大的多肽內時，本發明的片段最優選形成單個連續的區域。此外，幾個片段可以被包含在單個更大的多肽內。
本發明用的組胺結合蛋白可通過它們的編碼核酸分子在宿主細胞內包含的載體的表達製備成重組體的形式。這樣的表達方法已為本領域技術人員所了解並且許多方法由Sambrook等(同上)及FernandezHoeffler(1998，eds.「Gene expression systems，Using nature for the artof expression(基因表達系統。表達領域的使用性能)」。Academic出版社，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)進行了詳細描述。國際專利申請WO97/44451中列出上文提及的血管活性胺結合蛋白的編碼序列。在該專利申請中還描述生產這些分子，包括合適的載體、宿主細胞的方法及蛋白質的純化方法。
組胺結合化合物可配製成藥用組合物，例如，以在單位-劑量或多-劑量容器中的形式出現。例如，密封的安瓿和小玻璃瓶可貯存在冷凍-乾燥的狀態中，使用前只需要立即加入無菌液體載體即可。劑量取決於組胺結合化合物的特異性，並很容易通過常規實驗法確定。
為了治療劑的給藥，藥用組合物還可包含藥學上可接受的載體。這樣的載體包括抗體及其它多肽、基因及其它治療劑例如脂質體，前提是載體本身不會引起對接受組合物的個體產生有害抗體，並且給藥後毒性不會過大。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的高分子例如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物及無活性的病毒顆粒。
其中可用藥學上可接受的鹽，例如，無機酸鹽例如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；及有機酸鹽例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中對藥學上可接受的載體有充分的討論。
治療組合物中藥學上可接受的載體還可包含液體例如水、鹽水、甘油及乙醇。此外，輔助物質，例如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝物質等可出現在這樣的組合物中。這樣的載體使藥用組合物配製成片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿、膏劑、懸浮劑等以便患者攝取。
一旦配製完成，本發明的組合物就可直接給藥於患者。被治療的患者可以是動物；尤其是，可治療人類患者。
本發明所用的組胺結合化合物或藥用組合物可通過任何途徑給藥，包括但不限於，口服、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、經皮或透皮應用(例如，見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸的方式。至於組胺結合蛋白，因為蛋白可在胃內被分解，所以最好胃腸外給藥(例如，皮下、肌內、靜脈內或皮內注射)。適合胃腸外給藥的製劑包括可含有抗氧化劑、緩衝液、制菌劑及使製劑和接受者血液等滲的溶質的含水及非水無菌注射溶液，以及可包括懸浮劑或增稠劑的含水及非水無菌懸浮液。
通常由皮下、腹膜內、靜脈內或肌內注射直接傳遞組合物，或將組合物傳遞至組織間質腔。還可將組合物給藥於損傷部位。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。
本文所用術語「治療有效量」是指治療、改善或預防目標中性粒細胞-介導的疾病，或有能被觀察到的治療或預防效果需要的組胺結合化合物的量。對任何化合物，既可在細胞(例如瘤細胞)培養測定，也可在動物模型(通常是小鼠、兔、狗或豬)中估計最初的治療有效量。還可用動物模型確定合適的濃度範圍及給藥途徑。然後這樣的信息就可用於確定給藥於人體的有用的劑量及途徑。
對人類患者的確切有效量取決於疾病的嚴重度、患者的一般健康情況、及患者的年齡、體重、性別、飲食、給藥時間及頻率、聯合用藥、反應敏感性及對治療的耐受/反應。這個量由常規實驗確定並由臨床醫師判斷。通常，有效的劑量從0.005mg/kg至50mg/kg，優選0.125mg/kg至20mg/kg。例如，血管活性胺結合分子例如本文所提及的EV131及EV504的特別優選劑量為0.1至20mg/kg之間，更優選地，0.5至10mg/kg，而更優選1至2mg/kg。組合物可單獨給藥於患者或可與其它藥劑、藥物或激素聯合給藥。
基因治療可用於影響患者特殊細胞產生內源性組胺結合蛋白。基因治療既可發生在體內也可發生在體外。體外基因治療需要分離及純化患者細胞、引入治療基因及將遺傳學改變後的細胞再引入回到患者體內。相反，體內基因治療不需要分離及純化患者的細胞。
治療的基因通常被「包裝」給藥於患者。基因傳遞的載體可以是非病毒的，例如脂質體，或複製-缺陷病毒，例如Berkner，K.L.，在Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992)描述的腺病毒，或Muzyczka，N.，在Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)及美國專利5,252,479號描述的腺-相關病毒(AAV)載體。例如，編碼組胺結合蛋白的核酸分子可對複製-缺陷逆轉錄病毒載體的表達進行基因工程改造。然後這種表達構成物被分離並引入用含有編碼多肽RNA的逆轉錄病毒質粒載體轉導的包裝細胞(packaging cell)中，以便包裝細胞產生含有所述基因的傳染性病毒顆粒。這些生產細胞可給藥於患者，以便在體內對細胞進行基因工程改造及表達多肽(見20章，基因治療及其它分子遺傳學基礎上的治療方法，(並參考引用其中內容)人類分子遺傳學(1996)，T Strachan和A P Read，BIOS ScientficPublishers Ltd)。
另一方法是「裸DNA」的給藥，其中治療的組胺結合化合物直接注射入血流或肌肉組織內。
根據本發明，還提供上文描述的本發明任一方面所敘述的組胺結合化合物在製造治療中性粒細胞介導的疾病的藥物中的用途，尤其是本文清楚敘述的那些疾病。
現在本發明將以實施例的方式描述，清楚地提及EV131蛋白在內毒素-誘導的ARDS小鼠實驗模型中的使用。應當理解在不脫離本發明範圍的前提下可做細節上的修改。
附圖簡述

圖1內毒素(LPS)誘發支氣管狹窄及被EV131抑制。LPS 1mg經鼻內途徑給藥而EV131為360μg、180μg及90μg。測量PenH值3小時。在3小時時分析對乙醯甲基膽鹼的反應。代碼S01、S02等各自代表一個小鼠個體(souris)。
圖2EV131抑制BAL中內毒素-誘導的中性粒細胞募集。LPS以1μg經鼻內途徑給藥而EV131為360μg、180μg及90μg。總細胞數不變，而180μg及90μg EV131降低BAL中的中性粒細胞。
圖3經MPO活性測定，EV131抑制內毒素-誘導的肺內中性粒細胞募集。EV131在180μg及90μg而不在360μg水平抑制肺內MPO活性。
圖4內毒素(LPS)誘發支氣管狹窄並被腹膜內注射給予的EV131抑制。LPS 1μg經鼻內途徑給藥而EV131為182μg。測量PenH值3小時。
圖5當rEV131及布地奈德腹膜內給藥時BAL液中募集的細胞總數。
圖6當rEV131及布地奈德腹膜內給藥時BAL液中募集的細胞，根據細胞類型區分。
圖7當rEV131及布地奈德腹膜內給藥時BAL液中募集的所有細胞。
圖8rEV131腹膜內給藥後BAL液中TNF減少。
圖9在背部皮膚皮內注射1-8個位點的示意圖。1、2陰性對照(生理鹽水)；7、8陽性對照(抗-Ova)；3-6與抗-Ova血清皮內注射同時給藥的EV蛋白(濃度逐漸下降)對Ova效應的抑制。
圖10WB/ReJ C57B1/6j-kitw小鼠(w/w)中rEV131對血管漏的抑制。
圖11免疫複合物介導血管漏的分光光度定量。EV131及EV504抑制效應的劑量依賴。
圖12Arthus反應部位的PMN浸潤。在6小時對注射部位的顯微鏡觀察。陰性對照(生理鹽水；A)；陽性反應(抗-Ova；B)；EV131總的抑制(抗-Ova+EV131；C)；及EV504的部分抑制(抗-Ova+EV504；D)。
圖13淚液樣本的中性粒細胞計數提示未防腐的rEV131在人類患者受到結膜過敏原攻擊時或之後立即明顯減少募集於眼部的中性粒細胞的數量。
實施例1過敏性哮喘重組體，節肢動物衍生的組胺結合蛋白EV131與組胺高親和力結合(Paesen，G.C.，P.L.Adams，K.Harlos，P.A.Nuttall，和D.I.Stuart.1999，Mol Cell 3661；Paesen，G.C.，P.L.Adams，P.A.Nuttall，和D.L.Stuart.2000，Biochim Biophys Acta 148292)。
最初，進行測試是為了確定EV131能否抑制組胺介導的病理學變化。因此用EV131測試過敏性哮喘。在接種的小鼠接受抗原攻擊之前給予EV131，發現可預防70％氣道高反應性，消除支氣管周的炎症、肺的嗜酸性粒細胞增多、粘液分泌過多及IL-4分泌(Couilllin等提出)。EV131對支氣管高反應性的抑制作用可與糖皮質激素相比。這些結果證明組胺是過敏性哮喘的重要介質。
這些測試結果促使我們研究急性呼吸窘迫症候群(ARDS)，其表現出某些與過敏性哮喘相同的特性。用E.coli(大腸桿菌)內毒素單獨給予建立ARDS模型(Lefort，J.，L.Motreff，和B.B.Vargaftig.2001，AmJ Respir Cell Mol Biol 24345.)。此處顯示EV131明顯抑制支氣管狹窄及中性粒細胞募集。
方法大腸桿菌內毒素誘發急性支氣管狹窄能產生最大氣道反應而又不致死小鼠的內毒素最佳劑量首先通過單獨用鹽水作為對照來確立。確定最佳劑量為1μg(數據未顯示)。使大腸桿菌內毒素(O55:B5，Sigma)溶於鹽水並以1μg溶於40μl鹽水的劑量經鼻內途徑給予靜脈注射氯胺酮麻醉(防止咳嗽)的C57BL/6小鼠。經相同途徑在給予內毒素之前立即將三種劑量水平(90、180及360μg，4.5-18mg/Kg)rEV131給予不同組別小鼠，對照組只接受鹽水。
在採用該模型的第二組實驗中，腹膜內注射350μg布地奈德(陽性對照)、鹽水(陰性對照)及182μg rEV131，1小時後給予1μg LPS，也是經鼻吸入給予。
氣道阻力體積描記器內毒素給藥後用全身體積描記器評價氣道阻力3小時。在恢復期後觀察對氣霧化乙醯甲膽鹼的支氣管高反應性(BHR)。首先將接受內毒素及活性或對照藥物的不受限制的清醒小鼠放於全身體積描記室中(Buxco Electronic，Sharon，CO，USA)。小鼠被放在兩個測定氣壓的體積描記室中的一個，這些室與抽吸泵相連以保證恆定氣流。動物被引入與第二室分離的第一室，其中壓力相當於大氣壓。每一隔室都與一個微分壓力捕獲器的兩部分相連，壓力捕獲器本身與電子放大器連接並由軟體對信號進行分析。該系統允許在連續的呼吸周期過程中對許多參數進行定量。用該系統以增強的呼吸暫停(Penh)為氣道阻力指標評估支氣管狹窄3小時。
Penh可理解為胸廓氣流及鼻氣流流量曲線的相移；相移增加與呼吸系統阻力增加相關。Penh通過公式Penh＝(Te/RT-1)×PEF/PIF計算，其中Te為呼氣時間，RT為鬆弛時間，PEF為呼氣峰流速，而PIF為吸氣峰流速。Penh值相應於在觀察期間每5秒11個事件(周期)的平均數。
180分鐘後終止實驗，在測定殘留BHR之前可允許小鼠高濃度氧通氣以便恢復。
在實驗的這個時期300mM乙醯甲膽鹼被氣霧化並引入體積描記室20秒，並在一段15分鐘的時間(乙醯甲膽鹼誘發BHR的持續時間)後獲得由Penh測定的平均氣道支氣管狹窄讀數。
經數據分析，內毒素給藥後36個時間點及乙醯甲膽鹼噴霧後5個時間點的Penh值如圖1所示。每一點的Penh值對應於該點之前5分鐘及之後3分鐘之間的平均Penh值。(NB在圖1中恢復期對應於180分鐘時Penh的明顯下降)。
支氣管肺泡灌洗(BAL)內毒素鼻內給藥後3.5小時在大量氯胺酮及賽拉嗪麻醉下進行BAL，將4倍體積0.5ml冰冷卻磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)灌洗氣道。將灌洗液離心，再懸浮，用血細胞計數儀進行總細胞計數並用Shandon細胞離心儀製備細胞離心標本。在用May-Gruenwald-Giemsa染色區分之後，分析細胞。
肺髓過氧化物酶測定(MPO)如前所述，為測定肺內中性粒細胞含量我們分析肺內髓過氧化物酶(中性粒細胞主要的酶)的量(也可見Hoy A，Leininger-MullerB，Kutter D，Siest G，Visvikis S.Clin Chem Lab Med 2002；40(1)2-8.)肺組織學在支氣管肺泡灌洗後，致死小鼠。摘除全肺並固定在4％緩衝甲醛中以用HE染色進行標準顯微鏡分析。由兩個獨立的觀察者用半定量評分(0-3)評價支氣管周浸潤及平滑肌異常增生。
結果內毒素誘發的支氣管狹窄被EV131抑制首先我們建立一種誘發非致死性支氣管狹窄的內毒素劑量-反應作用(1-100μg)。發現內毒素在15-30分鐘內誘發實質上的支氣管狹窄(數據未顯示)。我們選擇劑量為1μg的內毒素做進一步實驗以測定rEV131的作用。
在對照組LPS誘發實質上的支氣管狹窄，在約80分鐘達到高峰並持續180分鐘直到小鼠被允許在高濃度氧中恢復。當鼻內給予劑量為360μg的rEV131時部分抑制這種反應，而90μg和180μg抑制作用更大(圖1)。起初這結果使人感到奇怪，但隨後認識到給予360μg rEV131的小鼠遭受感染及可能受到中性粒細胞預處理，因此這種情況不認為是典型的。隨後的分析不包括該小鼠的結果。
這些數據提示內源性組胺在內毒素誘導的支氣管狹窄中有作用，因此用rEV131中和組胺可改善ARDS。
圖4顯示腹膜內給予rEV131有類似作用，說明rEV131不能直接結合於LSP。這也證明rEV131經這種途徑給藥是有效的。
支氣管高反應性(BHR)被EV131抑制我們還在內毒素給藥及在高濃度氧下恢復後3小時測試乙醯甲膽鹼-誘發的BHR。首先我們證明與鹽水對照相比在內毒素給藥後發生乙醯甲膽鹼-介導的BHR(數據未顯示)。此後我們觀察在給予rEV131及對照小鼠中乙醯甲膽鹼的作用。在對照小鼠中乙醯甲膽鹼激發支氣管狹窄而在用任何劑量水平rEV131處理的小鼠中則沒有激發(圖1)。因此，該數據提示內毒素-誘發的高反應性是組胺依賴性的並能被rEV131減弱。
BAL及肺內中性粒細胞募集減少內毒素的給予導致BAL液中中性粒細胞明顯募集。內毒素吸入後3小時在對照動物的BAL液中我們回收到約105個白細胞。rEV131的給藥沒有改變BAL液中總細胞數，但相反，180及90μg的rEV131減少中性粒細胞募集，即使這種減少沒達到統計學差異(p＜0.2)。雖然360μg劑量沒有效應(圖2)；但是，在該劑量只有一個動物接受評價並且如上文所說，該動物隨後被認定罹患感染。
我們還觀察肺內活化中性粒細胞的募集是否改變。為定量中性粒細胞募集，我們測試新鮮肺組織勻漿的MPO活性。顯示180μgrEV131(p＜0.05)及90μg rEV131(p＜0.01)明顯降低中性粒細胞活性(圖3)。在感染的小鼠中，給藥360μg沒有效應。
圖5、6及7都是在腹膜內給予rEV131及布地奈德時為評價BAL液中細胞募集所進行的等同實驗。從這些圖中明顯看出，rEV131明顯減少BAL中總細胞數，尤其是中性粒細胞。而且，rEV131還減少BAL液中TNF的量(見圖8)。
肺組織病理學接受內毒素小鼠的肺臟顯示支氣管周顯著浸潤大量中性粒細胞(數據未顯示)。rEV131基本上在180μg及90μg劑量減少中性粒細胞募集(數據未顯示)。
結論本數據證明在ARDS鼠科模型中組胺結合蛋白rEV131明顯抑制內毒素-誘發的支氣管狹窄、BHR及中性粒細胞募集。這種作用在鼻內給藥及腹膜內給藥時都很明顯。
實施例2反向被動阿圖斯氏反應(Arthus reaction)方法經典的反向被動阿圖斯氏反應(局部過敏反應)在小鼠中進行，表示經皮膚內注射抗血清，然後靜脈內注射抗原誘發的局部免疫複合物病理學。所用方法如下被動Arthus反應的誘發C57/BL6(129或FVB)小鼠(6-8周齡，雄性或雌性)背部備皮。首先，在異氟烷麻醉下將25μl小雞抗-卵清蛋白IgG(抗-Ova)(12.5-200μg)或鹽水皮內注射於背部皮膚。其後立即將100μl卵清蛋白(Ova)(1mg含有0.2％伊凡斯藍)注射於尾部靜脈內。對照小鼠接受皮內注射鹽水或小牛血清白蛋白或靜脈內注射BSA鹽水(0.2％伊凡斯藍)。
在圖9中描述的圖敘述了用於測試EV蛋白對被動Arthus反應抑制作用的方案將最佳數量的用於被動Arthus抑制的抗-卵清蛋白IgG(25μg)或鹽水伴或不伴測試蛋白進行皮內注射。
血管漏的定量免疫複合物的形成及局部沉澱誘發急性炎症反應。作為與血管舒張及內皮損害相連續的血漿蛋白滲出的徵候，15分鐘內在接受靜脈注射含有0.2％伊凡斯藍的Ova小鼠的皮內注射抗-Ova血清部位可看到藍色褪色。用數位相機記錄褪色情況(圖10)。
30分鐘時切除注射部位，剪刀絞碎並在甲醯胺中消化過夜，並用ELISA讀數平板測量在OD 610nm的吸收值。
顯微鏡評價注射部位細胞的反應在注射後6小時切除注射部位，固定在4％緩衝甲醛中，植入石蠟中，在Leica切片機上作5μm切片，用HE染色並用顯微鏡以評分系統(0，無浸潤，1，最輕度，2，中度及3多形核中性粒細胞(PMN)重度浸潤)進行半定量分析。
結果血管漏陽性對照。在缺乏測試蛋白的情況下皮膚注射部位15分鐘內染成深藍色說明存在血管漏(結果未顯示)。
陰性對照。靜脈內注射含有0.2％伊凡斯藍的鹽水(無抗原)不引起任何血管漏，例如沒有藍色褪色(結果未顯示)。
EV131及EV504對血管漏的抑制將測試蛋白單獨或與抗-Ova抗體(每部位12.5μg)一起注射於皮膚。當與抗-Ova抗體一起注射時，幾乎全部保護作用都由EV131產生，而只有一部分保護作用由EV504產生(未顯示)。估計EV131及EV504的IC50各自為16及31μg範圍。這些實驗結果的重複性很高。相反，單獨皮內注射測試蛋白，沒有導致任何血管漏(數據未顯示)。
EV131及EV504的劑量依賴性抑制抑制作用的劑量依賴由切除及消化皮膚的分光光度測定來定量。EV131及EV504的IC50各自為20μg及60μg範圍(圖11)。
中性粒細胞浸潤在抗-Ova注射後6小時切除皮膚注射部位並作組織學處理。注射抗-Ova的對照小鼠真皮顯示明顯外周血管中性粒細胞浸潤。注射鹽水的對照小鼠沒有發現浸潤(圖12)。EV131及EV504明顯減少免疫複合物誘發的PMN皮膚內募集(62.5μg)，其中EV504作用程度較小。為精確定量，由於在皮膚取樣過程中出現一些技術失敗需要重複進行實驗。該實驗結果總結在以下表1中。
因此，兩種測試蛋白對反向Arthus反應早期血管漏均有抑制作用。EV131看來在這種免疫複合物小鼠模型中比EV504更有效。EV131及EV504抑制血管漏的IC50各自為20μg及60μg(圖11)。在高劑量時PMN浸潤幾乎消失。
表1PMN浸潤(反向Arthus反應)
實施例3過敏性結膜炎有研究評估FS-HBP2(rEV131)在預防結膜過敏原刺激模型誘發過敏性結膜炎的先兆及症狀中的安全性及有效性(Abelson MB，Chambers WA和LM Smith；眼科學，1990；10884-88)。應用4種治療方法，包括將rEV131溶媒與3種濃度rEV131(0.06％、0.12％及0.24％眼科用溶液)比較。本研究包括60名患者。
測量的初級有效性變量包括眼癢及發紅。測定中性粒細胞計數作為次級有效性變量的一部分。收集23名參與本研究的患者的淚液標本。在那些標本中，19名患者有可檢測的中性粒細胞計數。在一側眼接受濃度為0.12％(N＝3)及0.24％(N＝7)rEV131而另一側眼接受安慰劑的患者中，藥物治療的眼的中性粒細胞計數明顯減少(見圖13)。然而，在一側眼接受0.06％rEV131而另一側眼接受安慰劑的組中，接受藥物的眼中的中性粒細胞計數明顯增加。在雙側接受溶媒的眼睛(N＝5)中，中性粒細胞計數沒有發現顯著差異。
這些結果提示未防腐的rEV131可在結膜過敏原攻擊時或之後立即明顯減少中性粒細胞募集於眼部的數量。
結合在實施例1及2中出現的結果，這些結果提示未防腐的rEV131(即不包含可能有合成蛋白質的防腐劑苯扎氯銨的rEV131溶液)可能在眼部急性過敏反應中，在減輕炎症及隨後的與更多具體中性粒細胞-介導的疾病相關的組織損傷中發揮重要作用。晚期過敏反應由白細胞通過肥大細胞在急性反應早期釋放的趨化因子浸潤進入組織來介導。在眼部，雖然可能存在細胞浸潤生理學晚期，但多數過敏性結膜炎病例並沒有相應的臨床晚期。在眼部，只有重度、慢性過敏性反應包括晚期反應，其達到某一閾值並誘發臨床先兆及症狀，例如在春季角結膜炎中看到的角膜炎及shield ulcers。但是，鼻及肺顯示臨床晚期反應比眼更明顯。這可以解釋先前一個臨床研究在結膜過敏原攻擊(CAC)誘發鼻症狀中所看到的rEV131的作用。在CAC之後鼻內的過敏反應，及滴入眼部藥劑對鼻症狀的作用均是意料不到的，因為過敏原、調節劑及活性藥物都可從眼表面，通過鼻淚管，進入鼻腔的下鼻甲，在此其可對鼻組織發揮作用。
以後的研究將集中在組胺結合分子例如rEV131減少特別是中性粒細胞-介導的反應例如術後炎症或邊緣性浸潤的效能。
權利要求
1.一種在患者中治療由中性粒細胞介導的疾病的方法，它包括給予患者治療有效量的組胺結合化合物。
2.一種根據權利要求1的方法，其中所述疾病是過敏性疾病、炎性疾病或自身免疫性疾病。
3.一種根據權利要求1或權利要求2的方法，其中所述疾病選自成人呼吸窘迫症候群(ARDS)；嬰兒呼吸窘迫症候群(IRDS)；嚴重急性呼吸症候群(SARS)；慢性阻塞性氣道疾病(COPD)；囊性纖維化；呼吸機誘發的肺損傷(VILI)；毛細血管漏症候群；再灌注損傷，包括血栓性中風、冠狀動脈血栓形成、心肺分流術(CPB)、冠狀動脈旁路移植術(CABG)、四肢或指(趾)再植術、器官移植術、術後炎症或邊緣性浸潤、分流術腸炎、分流術關節炎、熱損傷及擠壓傷之後的損傷；牛皮癬；牛皮癬性關節病；類風溼性關節炎；Crohn’s病；潰瘍性結腸炎；免疫性血管炎，包括Wegener’s肉芽腫病及Churg-Strauss病；酒精性肝病；中性粒細胞介導的腎小球腎炎；系統性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎；動脈粥樣硬化；系統性硬化病；痛風；牙周病，眼部炎症包括乾眼、Sjogren’s症候群、隱形眼鏡相關的乳頭狀結膜炎(CLAPC)、隱形眼鏡相關的邊緣性浸潤，術後炎症包括白內障、青光眼、角膜移植術及雷射原位角膜磨鑲術(LASIK)的手術後炎症，嚴重過敏性結膜炎，春季角結膜炎(VKC)，瀰漫性片狀角膜炎，傳染性及非特異性結膜炎，角膜炎及瞼炎、shield ulcers。
4.一種根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述組胺結合化合物是組胺清除劑。
5.一種根據權利要求4的方法，其中所述組胺清除劑以大於10-7/M的解離常數與組胺結合。
6.一種根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述組胺結合化合物是蛋白質。
7.一種根據權利要求6的方法，其中所述組胺結合蛋白是血管活性胺結合蛋白。
8.一種根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述血管活性胺結合蛋白是(a)任何以小於10-7M的解離常數特異性結合於組胺、並和國際專利申請號WO97/44451中公開的蛋白MS-HBP1、FS-HBP1及FS-HBP-2屬於同一蛋白質家族的血管活性胺結合蛋白，其中如果所述蛋白質初級的、成熟的單體序列不超過260個胺基酸並且在該蛋白質全序列中的至少30，優選至少40、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸被作為同一殘基保存在該蛋白質及蛋白質MS-HBP1、FS-HBP1和FS-HBP-2的排列中，那麼就認為該蛋白質屬於這個蛋白質家族，優選該排列用ClustalW(Thompson等，1994，NAR，22(22)，4673-4680)獲得；(b)以小於10-7M的解離常數特異性結合於組胺，並且包含序列基元D/E A W K/R(優選DAWK，更優選QDAWK)及Y/C E/D L/I/F W(優選Y/C ELW)的來自吸血節肢動物的蛋白質；(c)如在上文(a)或(b)中所定義的蛋白質的天然生物變異體，例如等位基因變異體或地理上的變異體；(d)如在上文(a)、(b)或(c)中所定義的蛋白質的功能等價物，其包含不影響對組胺結合的生物學功能的野生型蛋白質序列中單個或多個胺基酸的取代、添加、插入和/或缺失，和/或化學修飾胺基酸的取代；(e)如在上文(a)、(b)、(c)或(d)中所定義的蛋白質的活性片段，其中「活性片段」表示保留有對組胺結合的生物學功能的截短的蛋白質；和(f)含有與肽或其它蛋白質，或抗體融合的如在上文(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中定義的蛋白質的融合蛋白質，所述蛋白質，例如標記物，可以是例如生物活性的、放射性的、酶的或螢光的。
9.一種根據權利要求7或權利要求8的方法，其中所述血管活性胺結合蛋白是EV131或其片段。
10.前述權利要求中任一項所述的組胺結合化合物在製備治療由中性粒細胞介導的疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種治療中性粒細胞介導的疾病的新方法。該方法包括將組胺結合化合物以治療有效量給予患有這種疾病的患者。
文檔編號A61P37/08GK1795008SQ200480014569
公開日2006年6月28日 申請日期2004年4月1日 優先權日2003年4月1日
發明者W·維斯頓－達維斯 申請人:發展技術有限公司