抗b7-h6多肽的b7-h6治療性活性單克隆抗體的製作方法

2023-05-26 01:21:41 3

抗b7-h6多肽的b7-h6治療性活性單克隆抗體的製作方法
【專利摘要】本發明涉及診斷方法和手段。具體地，本發明涉及抗體，所述抗體特異性結合至B7-H6多肽的胞外域的一部分。本發明還提供所述抗體用於治療或診斷癌症或炎性疾病。本發明還提供用於在疑似患有癌症或炎性疾病的受試者的樣品中診斷癌症的方法。此外，本發明涉及用於診斷癌症或炎性疾病的裝置和試劑盒。
【專利說明】抗B7-H6多肽的B7-H6治療性活性單克隆抗體
【技術領域】
[0001]本發明涉及診斷方法和手段。具體地，本發明涉及抗體，所述抗體特異性結合至B7-H6多肽的胞外域的一部分。此外，提供了所述抗體用於癌症或炎性疾病的治療或診斷。此外，提供了用於在疑似患有癌症或炎性疾病的受試者的樣品中診斷癌症的方法。此外，本發明涉及用於診斷癌症或炎症的裝置和試劑盒。
【背景技術】
[0002]迄今，儘管在降低發病率和死亡率以及提高存活率上已經取得了進展(見Jemal等.2010，CA Cancer J Clin.S印_0ct60 (5): 277-300)，在美國，癌症仍然是導致死亡的首要原因之一。由於癌症的發展通常與缺失免疫系統對腫瘤細胞的特異性識別相關，通過改進診斷方法和手段可以加快進一步進展。
[0003]靶向癌症治療包括幹擾特定靶分子(例如，單克隆或多克隆抗體)以直接阻斷癌細胞生長的藥物。因此，靶向癌症治療可以比傳統的治療方法(例如，切除術、射線療法、化學療法)更有效，並且可以對正常細胞傷害更小。可以設計單克隆抗體(mAb)，以特異性結合至靶細胞的胞外域或細胞表面靶標，從而刺激患者的免疫系統。也可以針對很多嚴重疾病(例如，炎性疾病或不同種類的癌症)創造單克隆抗體。因此，單克隆抗體可以提供可靠和有效的治療和診斷方法和手段，以例如檢測這些疾病的早期發展階段或提供治療方法。
[0004]自然殺傷細胞(NK細胞)構成先天免疫系統的主要成分，其形成炎性和適應性免疫反應(見Vivier等，2008, Nat.1mmun0.9:503-510)，並在排斥轉移的和受病毒感染的細胞中起關鍵作用(見 Smyth 等 ，2002, Nat.Rev.Cancer2:850-861; Lanier2005, Annu.Rev.1mmunol.23:225-274)。NK細胞檢查靶細胞中I型主要組織相容性複合體(MHC)的表達(見Parham2005, Nat.Rev.Tmmunol.5:201-204), I型主要組織相容性複合體保護祀細胞免受NK細胞激活和免受NK細胞攻擊。缺乏I型MHC的靶細胞由於凋亡(程序性細胞死亡)的誘導而直接被NK細胞殺死。NK激活受體(例如，天然細胞毒性受體(NCR)家族，如NKp30)的發現揭示了，NK細胞的激活和腫瘤細胞裂解也需要激活信號(見Pende等，1999，CancerRes.62:6178-6186; Moretta 等，2001, Annu.Rev.Tmmunol.19:197-223)。
[0005]最近，可能證實，人NKp30與B7家族成員B7-H6直接相互作用，其中B7-H6在腫瘤細胞上的表達誘導NKp30依賴的細胞激活和細胞毒性(見Brandt等，2009，J.Exp.Med.206
(7):1495-1503;US2011/0081346)。由此，NKp30的胞外域與僅在幾個腫瘤細胞系的表面上表達的 B7-H6 的胞外域直接相互作用(見 Brandt 等，2009，J.Exp.Med.206 (7): 1495-1503)。
發明概要
[0006]本發明涉及抗體，所述抗體特異性結合至由B7-H6多肽胞外域的一部分形成的表位，所述部分具有SEQ ID N0:22中所示的胺基酸序列。優選地，所述序列為IgV樣結構域。
[0007]在本發明抗體的一個優選實施方案中，所述抗體包含SEQ ID N0s:5、7、9、15、17和19 中所示的互補決定區(CDRs)。根據 MGT-0NT0L0GY(見 Giudicelli 和 Lefrancl999, Bioinformaticsl5:1047-1054),對上述Q)Rs的核酸序列進行了注釋。
[0008]在本發明抗體的一個優選實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。更優選地，所述抗體是根據布達佩斯條約、於2011年2月2日以保藏號DSMACC3117保藏在DSMZ(德國，Braunschweig)的抗體。
[0009]本發明涉及本發明抗體用於癌症的治療或診斷。優選地，所述癌症是T細胞淋巴癌、髓性白血病、結腸癌、B細胞淋巴癌、黑素瘤或宮頸癌。
[0010]此外，本發明涉及本發明的抗體用於炎性疾病的治療或診斷。優選地，所述炎性疾病是病毒感染。
[0011]本發明涉及用於在疑似患有癌症的受試者的樣品中診斷癌症的方法，包括:
[0012]a)在允許本發明抗體與其在B7-H6多肽上的表位結合的條件下，將樣品與本發明抗體接觸；和
[0013]b)測定抗體與所述表位的結合，由此診斷抗體。
[0014]在本發明方法的一個優選實施方案中，癌症是T細胞淋巴癌、髓性白血病、結腸癌、B細胞淋巴癌、黑素瘤或宮頸癌。
[0015]本發明還涉及用於在疑似患有炎性疾病的受試者的樣品中診斷炎性疾病的方法，其包括:
[0016]a)在允許本發明抗體與其在B7-H6多肽上的表位結合的條件下，將樣品與本發明抗體接觸；和
[0017]b)確定抗體與所述表位的結合，由此診斷炎性疾病。
[0018]在本發明方法的一個優選實施方案中，所述樣品是組織或體液樣品。
[0019]本發明還包括用於在樣品中診斷癌症或炎性疾病的裝置，其包括:
[0020]a)包含本發明抗體的分析部件；和
[0021]b)檢測分析部件中的抗體與其在B7-H6多肽上的表位結合的檢測器。
[0022]在本發明裝置的一個優選實施方案中，所述樣品是組織或體液樣品。
[0023]最後，本發明涉及用於診斷癌症或炎性疾病的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的抗體、以及優選地用於檢測所述抗體與其在B7-H6多肽上的表位結合的試劑。
[0024]附圖簡述
[0025]圖1顯示B7-H6_Ig融合蛋白的核酸和胺基酸序列。斜體的核酸和胺基酸序列標示限制性酶切位點。人B7-H6胞外域的核酸和胺基酸序列以粗下劃線標示，其中所述Fcm的序列以點下劃線標示。
[0026]圖2顯示人B7-H6多肽胞外域的胺基酸序列，並標示出了 IgV樣結構域和IgC樣結構域。
[0027]圖3顯示，使用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，抗B7-H6克隆1.18與B7-H6反應。
[0028]圖4a顯示，使用熒 光激活細胞分選術(FACS)，抗B7-H6克隆1.18與轉染子(BA/F3-B7-H6)上的B7-H6結合。圖4b顯示，抗B7-H6克隆1.18與細胞系(造血和實體腫瘤起源)上的B7-H6結合而不與健康的外周血單核細胞(PBMCs)結合。
[0029]圖5顯示，B7-H6的IgV結構域的一部分參與抗B7-H6克隆1.18的結合。
[0030]圖6顯示，不同細胞系中由螢光激活細胞分選(FACS)測定的B7-H6的細胞表面表達以及mRNA表達。圖6a顯示造血起源的腫瘤細胞系中B7-H6的表達。圖6b顯示實體瘤起源的腫瘤細胞系中B7-H6的表達。
[0031]圖7顯示，在BA/F-3-B7-H6轉染子的細胞離心塗片(cytospins)(冷凍切片)上抗 B7-H6mAbl.18 檢測 B7-H6。
[0032]圖8顯示，原代自然殺傷(NK)細胞在與BA/F3-B7-H6轉染子共培養後脫粒。
[0033]發明詳述
[0034]本發明涉及抗體，所述抗體特異性結合至由B7-H6多肽胞外域的一部分形成的表位，所述部分具有SEQ ID N0:22中所示的胺基酸序列。優選地，所述序列為IgV樣結構域。
[0035]術語「抗體」指，特異性結合至包含在B7-H6多肽胞外域的一部分中的表位上的所有類型的抗體。優選地，本文所提及的表位由長7至15個，優選8至11個連續胺基酸的區段定義。然而，依據本發明的表位也可以由某種三維結構形成，這樣的結構性表位也包括在本文中。在上下文中，「特異性結合」指，本發明的抗體基本上結合至表位而與B7-H6多肽或其它多肽上的其它表位無顯著的交叉反應性(即，結合)。可以通過本領域熟知的技術確定特異性結合。優選地，抗體特異性結合至所述表位。上述表位應位於B7-H6多肽胞外域的一部分中。優選地，B7-H6多肽具有SEQ ID NO:2中所示的胺基酸序列，所述胞外域對應於所述序列的第58至300位胺基酸(也見圖1和2)。應理解的是，B7-H6多肽也可以是SEQ ID NO: 2的變體序列，該變體序列由於取代、添加和/或缺失一個或多個胺基酸而不同。這樣的變體序列可以是來自其它物種的直系同源胺基酸序列以及上述特定B7-H6的旁系同源序列或其它同源序列。優選地，變體序列與SEQ ID NO: 2在SEQ ID NO: 2的全長或至少50%上具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。本文中使用的術語「序列同一性」指，兩個或更多個多肽序列(即參考序列和待與參考序列進行比較的給定序列)之間的關係。可以在給定序列和參考序列進行最優比對以廣生最聞程度的序列相似性後，通過比較給定序列和參考序列，確定序列同一性，其中最高程度的序列相似性可以通過這些序列的區段之間的匹 配來確定。所述比對可以由本領域技術人員無需過度勞動而完成。由此，序列同一性提供了與所述匹配的總數有關的信息。優選地，可以使用可公開獲取的電腦程式，計算序列同一性，所述電腦程式為技術人員所知，例如BLAST和FASTA。本發明考慮的其它序列變體是由如下核酸分子編碼的序列，所述核酸分子能夠在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO:1中所示的編碼B7-H6的核酸序列雜交。優選地，B7-H6多肽由SEQID NO:1中所示的核酸序列編碼。依據本發明，嚴格雜交條件相當於:在7%十二烷基硫酸鈉(SDS), 0.5M NaP04, ImM EDTA 中於 50°C雜交，在 IX SSC, 0.1%SDS 中於 50°C或 65°C洗滌，其中使用包含SEQ ID NO:1或其反向互補序列的至少100，更優選至少150，甚至更優選至少200，最優選至少250個連續核苷酸的核酸分子探針。應理解的是，在這些序列變體中，胞外域的第一個和最後一個胺基酸可以不同於以上針對SEQ ID N0:2指示的位置。然而，胞外域將開始和結束於與所述位置對應的位置。技術人員可以使用序列分析工具容易地確定這樣的對應位置。
[0036]優選地,本發明所述的抗體包括單克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體或這些抗體的具有上述結合特性的任何片段或衍生物。本文中使用的術語「抗體」所涵蓋的片段和衍生物包括合成抗體、Fab、F (ab) 2Fv或scFv片段，或這些抗體之任一的化學修飾衍生物。本發明考慮的化學修飾優選包括旨在將抗體偶聯到可檢測標記(見本說明書其它地方所詳述)的修飾。通常，可以通過使用例如Harlow和Lane《抗體，實驗室手冊》("Antibodies, ALaboratoryManual")，CSH出版社，Cold Spring Harbor, 1988中描述的方法,獲得抗體或其片段。
[0037]有利地，本發明的抗體以高親和力特異性結合至B7-H6。在支持本發明的研究中發現，與現有技術中描述或提出的其它抗B7-H6抗體(Brandt2009，J.Exp.Med.206(7):1495-1503和US2011/0081346)相比較，本發明的抗體尤其適用於體內應用諸如FACS分選和細胞培養、以及體外應用(包括免疫組織化學(在例如冷凍組織切片上))。由於本發明，基於確定B7-H6的癌症診斷將得到改進。此外，旨在將抗腫瘤藥物靶向B7-H6陽性細胞的治療方法變得可行。
[0038]在本發明抗體的一個優選實施方案中，所述抗體包含SEQ ID N0s:5、7、9、15、17和19 中所示的互補決定區(CDRs)。根據 MGT-0NT0L0GY(見 Giudicelli 和 Lefrancl999, Bioinformaticsl5:1047-1054),對上述Q)Rs的核酸序列進行了注釋。
[0039]本文中使用的術語「互補決定區」或「CDR」指抗體中負責抗原結合的特異性的可變區。通常，抗體包含3個⑶Rs (⑶R1，⑶R2和⑶R3)。這些⑶Rs以非連續的方式排列。由於抗體的抗原識別部分通常由重鏈和輕鏈上的兩個可變區組成，在結合時6個CDRs與抗原接觸。可以通過諸如 CDR 移植(見 Ewert2004，Methods34 (2):184-199;Benny K.C.Lo inAntibody Engineering - Methods in Molecular Biology2004, Volume248, II, 135-159, DO110.1385/1-59259-666-5:135)等常規分子生物學技術，將CDRs從一種抗體轉移到另一種抗體上。
[0040]從上文應理解的是，在另一個優選實施方案中，本發明的抗體是單克隆抗體。
[0041]優選地，可以通過給動物(優選小鼠)施用具有如上表徵的胞外域部分的免疫原性多肽，製備這樣的單克隆抗體。更優選地，將免疫原性多肽與載體蛋白，諸如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)綴合。取決於宿主種類，可以使用各種佐劑來增強免疫應答。佐劑優選包括弗氏佐劑(Freund’s adjuvant),礦物凝膠,例如氫氧化招，以及表面活性劑物質,例如溶血卵磷脂,多聚醇(pluronic polyols),聚陰離子,肽,油乳,鑰孔蟲戚血藍蛋白和二硝基酚。隨後，可以使用熟知的雜交瘤技術、人B細胞雜交瘤技術和EBV雜交瘤技術，製備依據本發明的單克`隆抗體。關於製備本發明抗體的更多詳情描述於以下的實施例。
[0042]在本發明抗體的一個更優選實施方案中，所述抗體是由「德國癌症研究中心(Deutsches Krebsforschungszentrum) 」(德國，Heidelberg)、根據布達佩斯條約、於2011年2月2日以保藏號DSM ACC3117保藏在「DSMZ-德意志微生物和培養物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，，(德國，Braunschweig, 38124)的抗體、或是由相應的雜交瘤細胞克隆產生的抗體。
[0043]上述抗B7-H6mAb應包含至少一條重鏈和至少一條輕鏈。優選地，抗B7_H6mAb具有SEQ ID NO:3中所示的重鏈(IGHV/IGHD/IGHJ)胺基酸序列，其中分泌形式(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1)示於SEQ ID NO: 11，膜結合形式(IGHV/IGHD/IGHJ/IGHG1)示於SEQ ID NO: 12。重鏈的構架1-4的核酸序列示於SEQ ID NO: 4, 6，8和10中，重鏈的⑶Rsl_3的核酸序列示於SEQ ID NO:5, 7和9中。此外，所述抗體具有SEQ ID NO: 13中所示的輕鏈(IGLV/IGLJ)胺基酸序列，其中IGLV/IGLJ/IGLC的序列示於SEQ ID NO:21中。輕鏈的構架1_4的核酸序列示於SEQ ID NO: 14, 16，18和20中，輕鏈的CDRsl-3的核酸序列示於SEQ ID NO: 15, 17和19中。應理解的是，抗B7-H6mAb也可以由上述SEQ ID NOs:3_21的變體序列代表，所述變體序列由於取代、添加和/或缺失一個或多個胺基酸而不同。這樣的變體序列可以是來自其它物種的直系同源胺基酸序列、以及上述特定B7-H6mAb的旁系同源序列或其它同源序列。優選地，變體序列在SEQ ID NOs:3-21的全長或其至少50%上與所述序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。說明書的其它地方已對術語「同一性」進行了定義，作必要修改後適用於此。
[0044]本發明還涉及本發明的抗體用於癌症的治療或診斷中。
[0045]本文中所用術語「治療」涵蓋:對本文所述疾病或其症狀的改善，以及治癒疾病，即在具有疾病或其症狀的受試者中重建健康狀況。本文中，「改善」指，相對於疾病或疾病的症狀，顯著改進健康狀況。優選地，該顯著改進在例如為了調查受試者而使用的分期或分級系統中是臨床上明顯的。如本領域技術人員將理解的是，本文中所使用的「治療」通常不旨在指，在給定的治療下對於所有(即100%)的受試者都正確。然而，該術語要求統計上顯著部分的受試者(例如群組研究中的群組)可以被治療。本領域技術人員可以使用各種熟知的統計計算工具，例如置信區間的確定、P值的確定、Student t檢驗、Mann-Whitney檢驗等，無需過度勞動而確定「部分」是否是統計上顯著的。詳細描述可以見於Dowdy和ffearden, Statistics for Research, John ffiley&Sons, New Yorkl983 中。
[0046]優選地，用於治療癌症的本發明抗體與細胞毒性劑或抗腫瘤劑偶聯，或能夠募集適於治療癌症的藥劑。本文中所使用的術語「藥劑/劑」指，元素、化合物或其它分子實體(例如藥物化合物、治療性化合物或藥理化合物)。藥劑可以是天然的、合成的或其組合。本文中所使用的術語「治療劑」指，單獨或與其它藥劑組合時，對細胞或組織顯示出治療效果或有益效果的藥劑。優選地，依據本發明的治療劑應包括藥物、毒素、免疫調節劑、螯合劑、硼化合物、光激活劑或色素、和放射性同位素。本領域技術人員熟知用於將治療劑與多肽例如抗體偶聯的技術(例如，Amon 等，1985，"Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy, ^((Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy〉〉(ReisfeId等編輯，Alan R.Liss，Inc.,1985))。本文中所使用的術語「細胞毒性劑」指，對細胞具有細胞毒性或細胞抑制效應的藥劑，由此耗竭細胞群體中的細胞或抑制其生長。優選地，依據本發明的細胞毒性劑應包括抗微管蛋白劑(例如多拉司他汀(dolastatins)、長春花鹼(vinca alkaloids)、鬼曰毒素(podophyllatoxins)、紫杉醇(taxanes)、眾果赤黴素衍生物(baccatin derivatives)、cryptophysins、美登素類化合物(maytansinoids)和考布他汀(combretastatins)), DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、燒化劑(例如鉬複合物)、蒽環類藥物(anthracyclines)、抗生素、抗葉酸劑(antifolates)、抗代謝物(antimetabolites)、化療增敏劑(chemotherapy sensitizers)、duocarmycins、依託泊苷(etoposides)、氟化U密P定(fluorinated pyrimidines)、離子載體(ionophores)、lexitropsins、亞硝基服(nitrosoureas)、platinols、預形成的化合物(pre-forming compounds)、嘌呤抗代謝物(purineantimetabolites)、嘌呤黴素(puromycins)、放射增敏劑(radiation sensitizers)、類固醇(steroids)、紫杉醇(taxanes)、拓撲異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitors)、長春花鹼(vinca alkaloids)等等。本文中所使用的術語「抗腫瘤劑」指,對癌細胞具有細胞毒性或有害效應的藥劑，由此阻止腫瘤中癌細胞的生長，優選導致細胞死亡。優選地，本發明的抗體結合至靶細胞(例如癌細胞)和表達所述抗體的受體的特定效應細胞(例如，自然殺傷細胞、單核細胞、粒細胞)，從而導致靶細胞死亡。在本發明的另一個優選實施方案中，本發明的抗體通過接頭與細胞毒性劑或抗腫瘤劑偶聯。優選地，依據本發明的接頭包括在細胞內條件下可切開的接頭(例如，可被細胞內蛋白酶切開的肽接頭、二肽接頭、二硫化物接頭、和在例如小於5.5的pH可水解的可水解接頭)。然而，由於其對B7-H6的阻斷和結合特性，本發明的抗體也可以用於治療癌症，作為涉及癌症的信號級聯的調節劑。
[0047]本文中所使用的術語「診斷」指，評估受試者是否患有本文所述的疾病。如本領域技術人員將理解的是，這樣的評估通常不旨在對於所有(即100%)的待檢受試者都正確。然而，該術語要求統計上顯著部分的受試者可以被鑑別(例如群組研究中的群組)。本領域技術人員可以使用各種熟知的統計計算工具(本文中其它地方提及)，無需過度勞動，確定「部分」是否是統計上顯著的。根據本發明的診斷包括將方法應用於監測、確認和亞分類相關疾病中。
[0048]此外，本文中，診斷的建立也包括建立對受試者的預後。預後是預測性指標，指示疾病在未來時窗(即預測窗)中的進一步發展。因此，優選地，本文中所使用的診斷包括:預測受試者在將來在疾病或疾病症狀上是否將得到改善、或疾病或症狀是否將惡化。因此，本發明的抗體也可以用於風險分層方法，並因此用於確定患有本文所述疾病的受試者個體所需的特別護理和住院治療的量。
[0049]優選地，用於診斷的本發明抗體與檢測劑偶聯、或能夠募集這樣的試劑。本文中使用的「檢測劑」涵蓋放射性同位素(例如碘、鎝的放射性同位素)、螢光或化學發光試劑(例如FITC、羅丹明)、能夠通過轉化底物來產生可檢測信號的酶(例如辣根過氧化物酶、螢火蟲螢光素酶、或β半乳糖苷酶)、螢光蛋白(例如綠色、藍色或紅色螢光蛋白)。合適的檢測試劑在本領域熟知。還優選地，應用於本發明方法中的抗體可以與能夠吸引檢測試劑的試劑偶聯。這樣的試劑可以是生物素。在這種情況下，可以使用抗生物素蛋白或鏈黴親和素偶聯的檢測試劑，其在與所結合的抗體上的生物素結合後可以用作可檢測標記物。在這種情況下，合適的可檢測標記物是以上提及的可檢測標記物，更優選地，在這種情況下，酶用作可檢測標記物。此外，可以使用第二抗體檢測第一抗體，第一抗體即待在本發明方法中應用的與樣品中的Β7-Η6多肽結合的抗體。第二抗體應與以上描述的可檢測標記物偶聯。因此，在後一情況下，第二抗體將在與第一抗體結合後產生可檢測信號，並由此使得能夠檢測所結合的第一抗體。以第二抗體檢測所結合的抗體的原理在本領域公知，並常規用於例如確定結合在組織切片上的抗體。取決於可檢測標記物的類型，可以應用不同的檢測方法，使用針對可檢測標記物產生的信號的讀取器系統。這樣的系統包括自動化信號讀取裝置，諸如ELISA或RIA讀取器，也包括用於手動或自動檢測可檢測信號的顯微裝置。此外，讀取器系統可以確定樣品的額外信息，例如顯微系統可以光學展示組織切片的細胞，或者自動化信號讀取器還可以確定樣品包含的其它生物標記物。
[0050]本文中所使用的術語「癌症」指任何惡性腫瘤。惡性腫瘤指，生物中因受損細胞的不需要的生長、侵襲、和在某些條件下的轉移而導致的疾病。導致癌症的細胞在遺傳上受損，且通常已失去了控制細胞分裂、細胞遷移行為、分化狀態和/或細胞死亡機器的能力。大多數癌症形成腫瘤,但一些造血系統癌症例如白血病不形成腫瘤。依據本發明,癌症應包括表達如本文中其它地方詳述的Β7-Η6多肽的癌細胞。優選的癌症類型選自:Τ細胞淋巴癌、髓性白血病、結 腸癌、B細胞淋巴癌、黑素瘤或宮頸癌。不同癌症的症狀和分期系統在本領域公知並描述於標準病理教科書中。本文中所使用的「癌症」涵蓋癌症的任何時期、等級、形態學特徵、侵襲性、攻擊性或惡性、或由此受染的組織或器官。
[0051 ] 本發明還涉及本發明的抗體用於治療或診斷炎性疾病。
[0052]優選地，用於治療炎性疾病的本發明抗體與抗炎劑偶聯，或能夠募集這樣的藥劑(如本文中其它地方所詳述的)。然而，由於其對B7-H6的阻斷和結合特性，本發明的抗體也可以用於炎性疾病，作為涉及炎性疾病的信號級聯的調節劑。
[0053]優選地，用於診斷的本發明抗體與檢測試劑結合、或如本文中其它地方所詳述的，能夠募集這樣的試劑。
[0054]本文中所使用的術語「炎性疾病」指，響應組織損傷或破壞而出現的組織反應，涉及炎性細胞因子和炎性細胞浸潤。依據本發明，炎性疾病應包括病毒感染和細菌感染。此外，還包括諸如糖尿病、多發性硬化和炎症性腸病等自身免疫性疾病。
[0055]從上可知，本發明還涉及用於在疑似患有癌症的受試者的樣品中診斷癌症的方法，包括:
[0056]a)在允許本發明抗體結合至其在B7-H6多肽上的表位的條件下，將樣品與本發明的抗體接觸；和
[0057]b)確定抗體與所述表位的結合，由此診斷癌症。
[0058]本文中所使用的術語「診斷」指，評估受試者是否患有本文中提及的疾病。如本領域技術人員將理解的是，這樣的評估通常不旨在對所有(即100%)待鑑別的受試者都正確。然而，該術語要求統計上顯著部分的受試者可以被鑑別(例如群組研究中的群組)。本領域技術人員可以使用本文中其它地方提及的各種熟知的統計計算工具，容易地確定部分是否是統計上顯著的。根據本發明的診斷包括:將方法應用於相關疾病的監測、確認和亞分類中。此外，本文中，診斷的建立也包括`建立對受試者的預後。預後是預測性指標，指示疾病在未來時窗(即預測窗)中的進一步發展。因此，優選地，本文中所使用的診斷包括:預測受試者在將來在疾病或疾病症狀上是否將得到改善、或疾病或症狀是否將惡化。因此，本發明的抗體也可以用於風險分層方法，並因此用於確定患有本文所述疾病的受試者個體所需的特別護理和住院治療的量。
[0059]優選地，上述用於在受試者的樣品中診斷癌症的方法還包括步驟:基於由該方法獲得的診斷結果，向受試者建議抗癌療法。本文中所使用的術語「建議」指，向受試者提出抗癌療法的建議或排除(即不推薦)某種抗癌療法。這樣的建議應可選地與其它信息(例如來自組織病理學調查的信息)一同作為臨床醫生對受試者個體應用或不應用某種抗癌療法的基礎。基於本發明的診斷，即癌症或非癌症的診斷，作出抗癌療法的建議。應理解的是，僅在通過本發明方法確定了癌症的診斷情況下，才應進行抗癌療法的推薦。在基於本發明方法沒有癌症被確診的情況下，建議將是避免抗癌療法。如上文所提出的，還可以使用來自樣品來源的受試者的其它信息來完善建議。在一方面，如果本發明方法鑑別到癌細胞，但如果例如通過組織病理學分析在所調查的癌症中檢測到了本發明方法沒有鑑別到的其它癌細胞，則可以建議組合抗癌療法，例如與不同的抗腫瘤藥物組合。
[0060]術語「樣品」指，分離的細胞樣品或來自組織或器官的樣品。組織或器官樣品可以獲自任何組織或器官，例如通過活檢獲得。分離的細胞可以自諸如淋巴液、血液、血漿、血清、液體等體液、或自組織或器官、通過諸如離心或細胞分選等分離技術而獲得。優選地，樣品是表達或產生本文中所述多肽的組織或體液樣品。可以通過本領域技術人員熟知的常規技術從受試者獲取樣品，例如開放性活檢(open biopsy),包括從受試者抽吸組織或細胞材料。對於那些通過開放性活檢不容易到達的區域，可以進行外科手術，優選微創外科手術。
[0061]本文中所使用的術語「受試者」涉及動物，優選哺乳動物和更優選人。本發明的方法適用於疑似患有癌症的受試者。疑似患有癌症的受試者是在表現出臨床上明顯的癌症症狀的受試者、或是患癌症的傾向性增加的受試者。在大規模診斷篩選試驗中，疑似患有癌症的受試者甚至可以是健康的受試者，即沒有顯示疾病症狀的受試者或沒有疾病傾向性的受試者。
[0062]本文中所使用的術語「接觸」和「接觸樣品」指，使抗體和樣品進行物理接觸，由此允許抗體特異性結合至B7-H6多肽(如果樣品中包含的話)上的表位。應理解的是，本文中所指的接觸以足夠允許抗體特異性結合至B7-H6多肽的時間和條件進行。取決於樣品的性質，可能需要預處理步驟，以釋放B7-H6多肽或使B7-H6多肽中的表位去隱藏，以便抗體可以接近和特異性結合。此外，取決於樣品的類型，處理方式也可能不同。例如，優選地，待分析其中是否存在B7-H6多肽的組織樣品優選被均質化，並例如通過SDS PAGE或本領域技術人員所知的其它蛋白質分離方法，分離組織中包含的蛋白質。通過使用上文中定義的抗體，進行諸如Western印跡等免疫學方法，分析所分離的蛋白質中是否存在B7-H6多肽。這些方法還包括允許抗體特異性結合至B7-H6多肽的孵育步驟。為了增加特異性，可以進行洗滌步驟。本領域技術人員熟知怎樣實施這些措施。如果使用組織切片作為樣品(即組織切片樣品)，應理解的是，可以考慮不僅分析是否存在B7-H6多肽，還可以分析其細胞或亞細胞定位。因此，在抗體結合前或後，組織應保持完整並可使用組織化學染色技術對其進行染色。本領域技術人員熟知進行組織切片免疫染色的合適技術。取決於組織切片樣品是否已經被包埋在諸如石蠟等包埋介質中，可能需要除去所述包埋介質。相關技術在本領域公知。
[0063]本文中所使用的術語「確定」指，檢測與樣品中包含的B7-H6多肽(如果有的話)特異性結合的抗體。與抗原特異性結合的抗體的檢測方法在本領域公知。優選地，可以將待在本發明方法中應用的抗體本身與可檢測標記物偶聯，所述可檢測標記物例如放射性同位素(例如碘、鎝的放射性同位 素)、螢光或化學發光試劑(例如FITC、羅丹明)、能夠通過轉化底物來產生可檢測信號的酶(例如辣根過氧化物酶、螢火蟲螢光素酶或β半乳糖苷酶)、螢光蛋白(例如綠色、藍色或紅色螢光蛋白)。合適的可檢測標記物在本領域熟知。還優選地，應用於本發明方法中的抗體可以與能夠吸引檢測試劑的試劑偶聯。這樣的試劑可以是生物素。在這種情況下，可以使用抗生物素蛋白或鏈黴親和素偶聯的檢測試劑，所述試劑在與結合後的抗體上的生物素結合後將充當可檢測標記物。在這種情況下，合適的可檢測標記物是以上提及的可檢測標記物，更優選地，在這種情況下，將酶用作可檢測標記物。此外，可以使用第二抗體檢測第一抗體，第一抗體即待在本發明方法中應用的與樣品中的Β7-Η6多肽結合的抗體。第二抗體應與以上描述的可檢測標記物偶聯。因此，在後一情況下，第二抗體將在與第一抗體結合後產生可檢測信號，並由此使得能夠檢測所結合的第一抗體。以第二抗體檢測所結合的抗體的原理在本領域公知，並常規用於例如確定結合在組織切片上的抗體。取決於可檢測標記物的類型，可以應用不同的檢測方法，使用針對可檢測標記物產生的信號的讀取器系統。這樣的系統包括自動化信號讀取裝置，諸如ELISA或RIA讀取器，也包括用於手動或自動檢測可檢測信號的顯微裝置。此外，讀取器系統可以確定樣品的其它信息，例如顯微系統可以光學展示組織切片的細胞，或者自動化信號讀取器還可以確定樣品包含的其它生物標記物。
[0064]在本發明方法的一個優選實施方案中，癌症是T細胞淋巴癌、髓性白血病、結腸癌、B細胞淋巴癌、黑素瘤或宮頸癌。
[0065]本發明還提供了在疑似患有炎性疾病的受試者的樣品中診斷炎性疾病的方法，其包括:
[0066]a)在允許本發明抗體結合至其在B7-H6多肽上的表位的條件下，將樣品與本發明的抗體接觸；和
[0067]b)確定抗體與所述表位結合，由此診斷炎性疾病。
[0068]除非在下文中另有說明，否則，與癌症診斷方法或本文其它地方的其它實施方案結合所進行的術語解釋，經適當修改後，也適用於上述方法中的術語。
[0069]本文中所使用的術語「受試者」涉及動物，優選哺乳動物和更優選人。本發明的方法適用於疑似患有炎性疾病的受試者。疑似患有炎性疾病的受試者是表現出臨床上明顯的炎性疾病症狀的受試者、或是患炎性疾病的傾向性增加的受試者。在大規模診斷篩選試驗中，疑似患有炎性疾病的受試者甚至可以是健康的受試者，即沒有顯示疾病症狀的受試者或沒有疾病傾向性的受試者。
[0070]如本文中其它地方所述及的，以上所提及的炎性疾病優選是病毒感染。
[0071]本發明還涉及用於在樣品中診斷癌症或炎性疾病的裝置，其包含:
[0072]a)包含本發明抗體的分析部件；和
[0073]b)檢測分析部件中抗體與其在B7-H6多肽上的表位結合的檢測器。
[0074]本文中所使用的術語「裝置」涉及，至少包含可操作地互相連接的上述分析部件和評估部件的系統。如何以操作方式連接裝置的部件將取決於裝置中所包括的部件的類型。例如，在採用樣品自動分析部件時，通過所述自動操作分析部件獲得的數據可以經例如電腦程式處理，以通過評估部件獲得期望的結果。優選地，在這樣的情況下，這些部件包含在單個裝置中。分析部件可以包含固定在固體支持物上的抗體。這樣的分析部件對液體樣品特別有用。待以本發明裝置調查的樣品優選是組織樣品，更優選是組織切片樣品。因此，在另一方面，抗體可以包含在檢測溶液中，所述檢測溶液可以由分析部件施加於諸如組織切片的組織樣品上。檢測溶液可以保存在分析部件中或分開的小瓶中，甚至保存在裝置之外。評估部件，優選計算機或數據處理裝置，包含執行規則，即算法，用於評估由分析部件確定的結合，由此根據信號的類型、強度和(在組織樣品的情況下)信號在組織中的位置，評估結合是否顯著。對於經評估顯示非顯著結合的樣品，將確立不是癌症的診斷。如果經評估得到顯著結合，則將確立是癌症的診斷。
[0075]優選地，裝置在其評估部件中還包含附帶算法的執行專家系統，該系統適應於根據所確立的診斷給出合適的療法或治療的建議(見本文中其它地方的詳細描述)。
[0076]在本發明裝置的一個優選實施方案中，所述樣品為組織或體液樣品。
[0077]最後，本發明涉及用於診斷癌症或炎性疾病的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的抗體和優選地用於檢測所述抗體與其在B7-H6多肽上的表位的結合的試劑。
[0078]本文中所使用的術語「試劑盒」指，以即用形式提供的、用於在樣品中診斷癌症的上述抗體和用法說明的集合。優選地，在單個容器中提供抗體和用法說明。優選地，試劑盒還包含進行診斷所必需的其它組件。這樣的組件可以是檢測抗體結合必需的輔助劑、用於預處理待分析樣品的試劑或校正標準。
[0079]本說明書引用的所有參考文獻，就其全部公開內容以及在本說明書中特別提到的公開內容，而特此併入作為參考。
實施例
[0080]以下實施例僅對本發明進行舉例說明。無論在什麼情況下，它們都不應解釋為限制本發明的範圍。
[0081]實施例1:獲得抗B7-H6單克隆抗體(mAb) 1.18的免疫方法:
[0082]用完全弗氏佐劑中的IOOyg B7-H6_Ig融合蛋白皮下(s.c.)注射到4個不同部位，免疫6周齡的BALB/c小鼠，所述B7-H6-1g融合蛋白由B7-H6的胞外域融合至IgGl-Fc域組成(B7-H6-1g-FP)(見圖1中所示)。3周後，以PBS中的100 μ g B7-H6_Ig-FP進行腹膜內(1.P.)注射。3周後，以PBS中的BA/F3(pro-B細胞)-Β7-Η6轉染子(2xl07個細胞)進行腹膜內注射。2個月後，以PBS中的IOOyg B7-H6_Ig-FP進行腹膜內注射。3周後，以PBS中的BA/F3-B7-H6轉染子(2xl07個細胞)進行腹膜內注射，5天後，將脾細胞與Ag8小鼠骨髓瘤細胞融合。以流式細胞儀篩選910個雜交瘤細胞，選擇所產生的免疫球蛋白與BA/F3-B7-H6細胞結合的雜交瘤細胞。此外，以ELISA，基於與B7-H6_Ig-FP的結合，對480個克隆進行篩選。選擇抗B7-H6克隆1.18用於進一步研究，原因是其以高水平染色BA/F3-B7-H6轉染子而不染色對照載體轉導的BA/F3細胞、並且其以高水平結合內源性表達B7-H6的細胞系。
[0083]實施例2:通過ELISA檢測抗B7-H6mAbl.18與B7-H6_Ig-FP的結合以及通過流式細胞儀檢測與BA/F3-B7-H6轉染細胞的結合:
[0084]ELISA檢測:將B7-H6_Ig-FP `(3 μ g/ml)固定在ELISA板上，與所示濃度的抗B7-H6mAbl.18孵育，用HRP綴合的mAbs進行顯色。
[0085]流式細胞儀檢測:以抗B7-H6mAbl.18 (2 μ g/ml)、同種型對照、NKp30_FP以及對照FP和PE綴合的第二 mAbs，染色BA/F3或BA/F3-B7-H6轉染子。
[0086]數據描述了通過ELISA檢測的抗B7-H6mAbl.18與B7-H6_Ig-FP的結合、以及通過流式細胞儀檢測的與BA/F3-B7-H6轉染細胞的結合。
[0087]實施例3:抗B7-H61.18mAb的結合涉及B7-H6的IgV域:
[0088]基於pcDNA3.1製備以下帶⑶8引導肽和C末端HA標籤、編碼B7-H6的以下部分的下述構建體:
[0089]B7-H6_l (胺基酸 24_4δ4)
[0090]Β7-Η6_2 (胺基酸 83_4δ4)
[0091 ] Β7-Η6_3 (胺基酸 141-454)
[0092]B7-H6_4 (胺基酸 190_4δ4)
[0093]Β7-Η6_5 (胺基酸 239_4δ4)
[0094]將得到的質粒瞬時轉染到HEK細胞中，隨後以實施例2中描述的抗Β7-Η61.18mAb染色。如圖5可見，抗B7-H61.18mAb與B7_H6_1(胺基酸24-454)和B7_H6_2(胺基酸83-454)結合，而不與B7-H6_3(胺基酸141-454)結合，表明B7-H6的胺基酸83-141 (O)HQEAFRPGAIVSPWRLKSGDASLRLPGIQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLEVV，如 SEQ ID NO:22 和圖1與2中所示)參與抗B7-H6mAbl.18的結合。表達了所有截短的B7-H6蛋白，其均可以通過western印跡使用抗HA標籤mAb檢測到。
[0095]實施例4:抗B7-H6mAbl.18與不同來源細胞系的結合:
[0096]如實施例2中所述，以抗B7-H6mAbl.18染色不同來源的細胞系並以流式細胞儀進行分析。數據揭示了抗B7-H6mAbl.18與不同來源細胞系的結合。
[0097]實施例5:定量實時PCR測定B7_H6mRNA表達:
[0098]使用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)從腫瘤細胞系中提取RNA，使用TURBO DNA酶(Ambion)去除汙染的DNA,使用ProtoScript M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(NEB)反轉錄 RNA。使用 SYBR Green I Master 和 LightCycIer480 (Roche)進行定量實時PCR0使用針對B7-H6的特異引物(GACCTGGAGCCATTGTGTCT，如SEQ ID N0:23中所示，和AAGCTGGACTGTTCCCTGTG，如SEQ ID N0:24中所示)和針對看家基因GAPDH的特異性引物(GCAMTTCCATGGCACCGT JBSEQ IDN0:25 中所示，和 TCGCCCCACTTGATTTTGG，如 SEQ ID NO: 26中所示)，以計算B7-H6mRNA相對於GAPDH的表達水平。數據顯示了，以抗B7-H6mAbl.18染色的不同來源細胞系以不同量表達B7-H6mRNA。
[0099]實施例6:B7-H6在Ba/F3_B7_H6轉染子的細胞離心塗片上的免疫組織化學染色: [0100]使用Dual Envision+System-HRP (Dako)，對 Ba/F3 和 Ba/F3-B7_H6 細胞 1:1 混合物的丙酮固定細胞離心塗片，進行染色。在阻斷內源過氧化物酶活性後，以10%的山羊血清和0.lmg/ml人IgG,封閉細胞離心塗片。在Dako抗體稀釋液中細胞離心塗片與5 μ g/ml抗B7-H6mAbl.18或小鼠IgGl同種型對照(克隆11711，R&D)孵育，洗滌，並與山羊抗小鼠和山羊抗兔免疫球蛋白綴合的Dako過氧化物酶標記的聚合物孵育。在與3，3』 - 二氨基聯苯胺(3,3，-diaminobenzidine) (DAB)底物溶液孵育後，以蘇木精(Hematoxylin)對細胞核進行復染色，以光學顯微鏡分析封裝後的細胞離心塗片。數據揭示，在細胞離心塗片上，抗B7-H6mAbl.18 染色 B7-H6Ba/F3-B7_H6 轉染子。
[0101]實施例7:原代NK細胞在與轉導了 B7-H6的BA/F3細胞共培養後的脫粒:
[0102]以IL-2 擴增 14 天的 NK 細胞，與 BA/F3、BA/F3-B7-H6 (NKp30 的配體)或 BA/F3-MICA (激活受體NKG2D的配體)細胞，在培養基中，於存在PE綴合的抗CD107mAb的條件下，培養5小時。在共培養後，以流式細胞儀，按CD107陽性NK細胞的比例確定NK細胞的脫粒。誤差條表示三次重複培養的平均值+/-SD。數據揭示，BA/F3-B7-H6細胞誘導原代NK細胞的脫粒。
【權利要求】
1.特異性結合至由B7-H6多肽的胞外域的一部分形成的表位的抗體，所述部分具有SEQ ID N0:22中所示的胺基酸序列。
2.權利要求1的抗體，其中所述抗體包含SEQID NOs: 5, 7，9，15，17和19中所示的互補決定區(⑶Rs)。
3.權利要求1或2的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.權利要求1至3之任一的抗體，其中所述抗體是根據布達佩斯條約、於2011年2月2日以保藏號DSM ACC3117保藏在德國不倫瑞克DSMZ的抗體。
5.權利要求1至4之任一的抗體用於癌症的治療或診斷。
6.權利要求4的抗體，其中癌症是T細胞淋巴癌、髓性白血病、結腸癌、B細胞淋巴癌、黑素瘤或宮頸癌。
7.權利要求1至4之任一的抗體用於炎性疾病的治療或診斷。
8.權利要求7的抗體，其中炎性疾病是病毒感染。
9.用於在疑似患有癌症的受試者的樣品中診斷癌症的方法，包括: a)在允許權利要求1至4之任一的抗體結合至其在B7-H6多肽上的表位的條件下，將樣品與所述抗體接觸；和 b)確定抗體與所述表位的結合，由此診斷癌症。
10.權利要求9的方法，其中癌症是T細胞淋巴癌、髓性白血病、結腸癌、B細胞淋巴癌、黑素瘤或宮頸癌。`
11.用於在疑似患有炎性疾病的受試者的樣品中診斷炎性疾病的方法，包括: a)在允許權利要求1至4之任一的抗體結合至其在B7-H6多肽上的表位的條件下，將樣品與所述抗體接觸；和 b)確定抗體與所述表位的結合，由此診斷炎性疾病。
12.權利要求9至11之任一的方法，其中所述樣品是組織或體液樣品。
13.用於在樣品中診斷癌症或炎性疾病的裝置，其包含: a)包含權利要求1至4之任一的抗體的分析部件；和 b)檢測分析部件中抗體與其在B7-H6多肽上的表位的結合的檢測器。
14.權利要求13裝置，其中所述樣品是組織或體液樣品。
15.用於診斷癌症或炎性疾病的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求1至4之任一的抗體、以及優選地，用於檢測所述抗體與其在B7-H6多肽上的表位的結合的試劑。
【文檔編號】G01N33/483GK103797032SQ201280044703
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年9月10日 優先權日:2011年9月13日
【發明者】A·塞勒溫卡, G·莫爾登豪爾 申請人:德國癌症研究中心