一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因及其用途的製作方法

2023-05-26 10:11:31 2

專利名稱：一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因及其用途。
背景技術：
包蟲病(Hydatid Disease)又稱為棘球蚴病(Echinococcosis)，是棘球絛蟲的中絛期幼蟲寄生於人體和動物所引起的疾病，它是一種嚴重危害人畜健康的人獸共患寄生蟲病。棘球絛蟲種類較多，能感染人類的棘球屬絛蟲有4種細粒棘球絛蟲 (Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球會條蟲(Echinococcus multilocularis, Em) > 少節棘球絛蟲(Echinococcus oligarthrus)禾口伏氏棘球絛蟲(Echinococcus vogeli)。 這4種棘球絛蟲可引起不同類型的棘球蚴病。我國存在兩種棘球蚴病，即細粒棘球蚴病 (echinococcosis granulosa)，又禾爾囊型包蟲病(cystic echinococcosis, CE)禾口多房棘球蝴病(echinococcosis multilocularis),又禾爾泡型包蟲病(alveolar echinococcosis, AE)。包蟲病是一個重要的世界性公共衛生問題，廣泛流行於歐、亞、非和地中海區域沿岸國家，以及澳洲和南美。在我國，包蟲病主要流行於西部的農牧區，其中新疆、青海、甘肅、 寧夏、西藏、內蒙和四川西部最為嚴重，是世界上包蟲病的高流行區。此外，吉林、陝西、雲南、貴州和河南等省局部地區也有小範圍流行，我國流行區受威脅人口約7000萬。衛生部 《全國人體重要寄生蟲病現狀調查》報告顯示，內蒙古、吉林、河南、四川、貴州、雲南、陝西、 甘肅、青海、寧夏、新疆、西藏等12省(區)包蟲病患病率為1.084%，據此推算，目前流行區約有病人38萬人。由於B超診斷結果有一定的漏檢率，實際患病病人數可能達60萬人以上。血清學檢查發現人群的感染率平均為11. 98%，感染人數約為700萬人。包蟲病不但給患者帶來極大的痛苦和沉重的經濟負擔，且發病的高峰為20-50歲的青壯年，給社會帶來極大的壓力，系西部農牧區群眾因病致貧，因病返貧的重要原因。此外，由於包蟲病在牛羊的感染率相當高(可達90%)，每年因包蟲病也給我國畜產品造成的經濟損失達數十億。因此包蟲病不但嚴重危害人民的生命健康，而且嚴重影響社會和經濟發展、邊疆穩定。在政府的重視下，包蟲病的防治工作正在全面開展，為滿足包蟲病診斷和現場流行病學調查的需要，研製合適的包蟲病檢測方法是當務之急。囊型包蟲病的診斷主要依據流行病學史、臨床表現、影像學檢查、病原學檢查和免疫學檢測。目前對囊型包蟲病的診斷極大地依賴影像學方法，如X光檢查、B型超聲檢查、 CT掃描、核磁共振等物理診斷方法。雖然影像學技術已廣泛應用，且能對包塊損害的部位、 大小和物理性狀等做出較為明確的判斷，但不能進行早期診斷(影像學診斷出的囊型包蟲病人大都已不太適合藥物治療)，且不易與一些囊腫、膿腫或腫塊相鑑別。由於影像檢查設備攜帶不便，加之昂貴，且對操作人員的技術要求較高，在疾病診斷與流行病學調查中(特別在邊遠地區連電力供應都受到限制)的應用受到限制。免疫學檢測方法具有敏感特異的特點，且可用於早期診斷，在各種疾病診斷中得到廣泛應用，在囊型包蟲病診斷中的應用也受到高度重視，國內外對其研究也不斷深入，而研究的重點在於獲得合適的抗原以提高診斷產品的性能。棘球蚴病免疫診斷抗原的研究經歷了粗抗原、純化抗原和重組抗原三個階段。總的來說，粗抗原的診斷敏感性高，但是特異性較低；純化抗原在粗抗原的基礎上提高了診斷的特異性，但是敏感性有所降低；而重組抗原的特異性較高，且易於標準化，但目前公認具診斷價值的重組Ag5和AgB與其他寄生蟲的相關分子具有共同表位，存在交叉反應，且高比例的囊型包蟲病患者血清學反應為陰性，不能滿足診斷的需要。因此，進一步開展對細粒棘球絛蟲抗原的篩選研究，尋找具有更高敏感性和特異性的抗原組分，提高對囊型包蟲病的診斷效率，是當前棘球蚴病免疫診斷研究的一項重要內容。構建cDNA文庫並對其進行免疫篩選是獲得新抗原基因的一個重要方法。將某種生物基因組轉錄的全部mRNA經反轉錄產生的cDNA片段分別與克隆載體重組，並將其引入到相應的宿主細胞中(一般為E. coli)繁殖和擴增，理論上此群體就包含有該物種的全部 mRNA信息，稱該生物基因組的cDNA文庫。基因組含有的基因在特定的組織細胞中只有一部分表達，而且處在不同環境條件、不同分化時期的細胞其基因表達的種類和強度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細胞特異性。cDNA文庫比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。但對真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有內含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接、去除了內含子的cDNA。cDNA文庫的構建主要包括mRNA的獲得、cDNA第一鏈的合成、cDNA第二鏈的合成、 雙鏈cDNA的克隆和包裝。cDNA文庫的篩選方法主要有1.核酸雜交是最常用，最可靠的方法之一，可大規模地分析文庫的克隆子。所用的探針主要有1)同源探針至少含有所需CDNA克隆的一部分確切序列。常用於以一個部分克隆分離 cDNA文庫中的全長克隆。2)部分同源探針探針的序列與所要篩選的cDNA克隆的序列相關但不相同。常用於克隆家族基因。3)總cDNA探針通過反轉錄酶均勻摻入放射性核苷酸或通過總的或分級分離得到的poly (A) +mRNA進行末端標記而獲得cDNA探針。4) cDNA扣除探針從第一種mRNA製備cDNA探針，連續多次與20倍過量的第二種mRNA雜交；回收未雜交的cDNA探針，再與100倍過量的第一種mRNA雜交，使得原mRNA中的一些特異序列得到高度富集。主要用於探測cDNA文庫中與調節水平有所差別的mRNA克隆。5)合成寡核苷酸探針2.特異性免疫學檢測在cDNA表達文庫中，目的基因的表達產物能與特異性抗體發生免疫學反應，通過酶學的方法加以檢測3. cDNA克隆的同胞檢測將cDNA文庫分成若干組含有10-100個克隆子的易於處理的亞cDNA文庫，對每組亞cDNA文庫進行檢測，當鑑定出陽性庫後再不斷將其分成更細的庫進行檢測，直到獲得陽性單克隆.

發明內容
本發明的目的在於提供一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因及其用途，所述的這種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因及其用途要解決現有技術中診斷囊型包蟲病的效果不佳，不能進行早期診斷的技術問題。本發明提供了一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因(本發明命名為Li)，其鹼基序列如SEQ ID NO 1所示。其中，29-31位的ATG對應mRNA的起始密碼子AUG，686-688 位的TAG對應mRNA的終止密碼子UAG0本發明提供了上述的細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白質。進一步的，上述的細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示，或者與SEQ ID NO 3所示的1-219位胺基酸序列相同。本發明提供了一種表達載體，含有上述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因。本發明提供了一種融合蛋白，含有上述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白。。本發明提供了一種宿主細胞，由上述的表達載體轉化或者轉導。本發明提供了一種抗體，其能與上述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因編碼的蛋白質特異性結合。本發明提供了上述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因編碼的蛋白質在製備用於免疫囊型包蟲病的疫苗中的應用。本發明提供了上述的一種表達載體在製備用於診斷囊型包蟲病的診斷試劑中的應用。本發明提供了上述的一種融合蛋白在製備用於診斷囊型包蟲病的診斷試劑中的應用。本發明提供了上述的一種抗體在製備用於診斷囊型包蟲病的診斷試劑中的應用。本發明所使用的細粒棘球絛蟲原頭節(Echinococcus granulosus protoscolex) 採自新疆患囊型包蟲病的綿羊。細粒棘球蚴cDNA文庫的構建首先離心分離得到細粒棘球絛蟲原頭節，提取總RNA，純化得到mRNA ；然後合成cDNA第一鏈；合成cDNA第二鏈；將雙鏈 cDNA連接到λ ZAP-II載體中，而後包裝到λ ZAP-II噬菌體中。構建cDNA文庫的庫容量為 1. 8X105pfu/mLo本發明每次用10名囊型包蟲病患者混合血清對細粒棘球絛蟲cDNA文庫進行免疫篩選，獲得了含有細粒棘球蚴基因的陽性噬菌斑，將噬菌斑進行刪除環化，使目的基因連接在環化至E. coli SOLR菌株內的I^bluescript SK-載體上，並將重組載體送生物公司測序， 獲得目的基因的序列。本發明獲得的目的基因長度為849bp，編碼219個胺基酸的蛋白，所編碼細粒棘球絛蟲鈣網織蛋白的分子量約為28032道爾頓。將目的基因的序列在NCBI中進行Blastn比對分析，未發現與其同源性較高的基因，進行Blastx比對分析發現其編碼蛋白為細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶(如SEQ ID NO 3所示)。本發明提取包含目的基因的I^bluescript SK-載體，根據目的基因的序列，選擇合適的核酸內切酶(EcoRI)將目的基因從I^bluescript SK-載體中切下，用同樣的內切酶酶切表達載體pGEX_3x，將酶切產物同時進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下將目的片段切下，純化，將目的基因和表達載體的純化產物連接，轉化E. coli Dffia細胞，挑取單菌落測序檢測連接成功與否，將連接成功的重組載體從E. coli Dffia細胞中提取出來，轉化E. coli BL21(DE3)細胞，表達、純化重組蛋白。本發明獲得的重組蛋白可以用於囊型包蟲病患者的免疫診斷，用該重組蛋白包板，用ELISA方法檢測囊型包蟲病、泡型包蟲病、囊蟲病、其它寄生蟲病患者以及健康人血清，獲得的敏感性和特異性分別為72.41% (63/87)和92. 36 % (133/144)，目前診斷囊型包蟲病效果最佳的天然純化抗原B的診斷敏感性和特異性分別為86. 81% (79/91)和 73.07% (95/130)，可見與天然純化抗原B相比，穀胱甘肽轉移酶的診斷敏感性稍差(P < 0. 05)，但是其診斷特異性優於天然純化抗原B (P < 0. 05)，與其它寄生蟲病的交叉反應較少，可與其它抗原聯合應用診斷囊型包蟲病。


圖1為cDNA文庫在NZY培養基上形成的噬菌斑。圖2為本發明的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因在NCBI上進行Blastx同源性分析，與同源性最高的胺基酸序列比對圖。圖3為本發明的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因編碼蛋白的二級結構分析圖。圖4為本發明的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因編碼蛋白的結構域分析圖。圖5為Pbluescript SK-/L1重組質粒和pGEX_3X表達載體酶切鑑定圖，其中M DNA分子量標準；1 酶切下來的目的片段Ll及I^bluescript SK-載體；2.酶切後的pGEX_3X 載體。圖6為I^bluescript SK-/L1基因重組質粒和pGEX_3X表達載體純化後的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M =DNA分子量標準；1 酶切下來的目的片段Ll ；2.酶切後的pGEX_3X載體。圖7為本發明的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶新基因在E. coli BL21 (DE3) 細胞中誘導表達後進行的的10% SDS-PAGE圖，其中M 標準分子量；1 未誘導的pGEX_3X 空質粒；2 經IPTG誘導的pGEX-3X空質粒；3 未誘導的pGEX_3X/Ll ；4 經IPTG誘導的 PGEX-3X/L1 ；5 :pGEX_3X/Ll表達克隆菌體裂解上清；6 :pGEX_3X/Ll表達克隆菌體裂解沉澱；7 菌體裂解上清經Glutathione Sepharose 4B樹脂吸附後的流出液；8_13 純化柱洗脫液。
具體實施例方式下面結合具體實例，進一步闡述本發明，應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例1細粒棘球蚴cDNA文庫的構建1.總RNA的分離和mRNA的純化取約lmL-80 °C凍存的細粒棘球絛蟲原頭節，用Trizol法提取總RNA，用GEHealthcare 公司的 quickpi^p mRNA Purification Kit 純化 mRNA。2. cDNA 合成(1)合成cDNA的第一鏈在一個無RNA的1. 5mLependorf中，加入如下反應體系IOXfirst strand buffer5μ L甲基化 dNTP3μ LLinker-primer (1. 4 μ g/ μ L)2 μ LDETP-treated water14 μ LRnase Block RibonucleaseInhibitor (40U/ μ L)1 μ LmRNA 樣品(5 μ g)22 μ L-------------------------------------47 μ L混合反應物，在室溫中靜置lOmin，允許引物與模板退火，然後加入 3 μ LAccu-Script-RT,使總體積達到50 μ L，輕輕混勻，稍離心，然後在42°C溫育lh，Ih後將反應物從42°C轉移到冰上。(2)合成 cDNA 第二鏈將下列試劑加入第一鏈合成的反應管IOXSecond strand buffer20 μ LSecond strand dNTP mixture6 μ L滅菌雙蒸水114 μ LRNase Η(1· 5U/ μ L)2 μ LDNA Polymerase I (9. OU/ μ L)IlyL-------------------------------------153 μ L輕輕混勻，稍離心，置於16°C水浴中培育2. 5h，2. 5h後，將反應物轉入冰浴中。(3)平端化cDNA末端將23 μ L平端化的dNTP混合物以及2 μ L pfu酶加入已經合成的cDNA雙鏈中，混勻，稍離心，置於72°C水浴中(不超過30min)，然後移出反應物，加入200 μ L苯酚和氯仿混合物(1 1)，混勻，渦旋。室溫下，15000rpm離心aiiin，將上層液轉入一新的離心管中，然後加入同體積的氯仿，渦旋，再次在室溫下15000rpm離心2min，然後將上層液移至一新的離心管中，加入下列試劑沉澱cDNA 3M 乙酸鈉20mL無水乙醇400 μ L混勻，置於_20°C冰箱中過夜。將過夜的cDNA自冰箱中取出，4°C，15000rpm離心lh，棄上清，輕輕加入70%醇洗滌沉澱物(不搖晃)，常溫下，15000rpm離心2min，棄上清，抽乾沉澱(5-lOmin)，用9 μ L EcoRI ligase buffer重新溶解沉澱物，4°C培育至少30min。(4)連接 EcoRI 接頭
將下列試劑加至平端cDNA和連接頭中IOXligase buffer1 μ LIOmM rATP1 μ LT4DNAligase (4U/ μ L)1 μ L簡單離心，8°C培育過夜。(5)磷酸化EcoRI末端將過夜的反應物於70°C水浴中放置30min，終止連接酶活性，簡單離心，在室溫中冷卻反應物5min，然後向反應物中加入下列試劑IOXligase buffer1 μ LIOmM rATP2 μ L滅菌雙蒸水5 μ LT4Polynucleotidekinase (5U/ μ L)2 μ L在37°C水浴中溫育30min，然後移至70°C加熱30min，以滅活激酶。將反應物簡單離心，置於室溫中冷卻5min。(6) Xho I 消化酶切在反應物中加入下列試劑XhoI buffer supplement28 μ LXhoI(40U/y L)3μ L37°C培育1. 5h，然後在反應管內加入下列試劑10XSTE buffer5μ L無水乙醇125 μ L置於-20°C冰箱，過夜沉澱。3.對樣品進行大小分級(1)將反應物從冰箱取出，40C，15000rpm離心15min。棄上清，抽乾沉澱，用14 μ L 1 X STE buffer重新溶解沉澱，加3. 5 μ L裝柱燃料至樣品中。(2)安裝分離柱從ImL移液管的頂部移去塑料包裝，用無菌的鑷子小心地拔出移液管內的棉塞， 使管內剩餘棉塞3_4mm，用無菌的剪刀減去拔出的部分。用洗耳球將管內的3-4mm棉塞推至管的尖部。剪下一段約8mm長的連接管，用其將ImL的移液管和IOmL的注射器針筒連接起來，移液管和針筒間不能有空隙，抽出筒芯，使針筒成為滴柱的貯液庫。然後用架子固定滴柱。(3)加樣裝柱前，通過顛倒kpharose CL-2B凝膠過濾介質，使樹脂混勻，將2mL的移液管插入針筒，加入IXSTE buffer(該步驟不能使液體中出現氣泡)，立即加入混勻的 Sepharose CL-2B凝膠過濾介質，待介質沉下後，再加入剩餘樹脂，直至樹脂平面距移液管於針筒的連接面約為0. 635cm。將IXSTE buffer加入針筒以清洗柱子，清洗時保證buffer 以恆定的速度流出，用至少IOmL的IXSTE buffer來清洗。當樹脂上僅存留約50 μ L的 1 X STE buffer時，立即將cDNA樣品加入柱子，輕輕將cDNA打入柱底，但不能干擾到樹脂以免影響cDNA的分離，一旦樣品進入到kpharose CL-2B凝膠過濾介質，用加樣槍在連接管內加入IX STCbuffer，貼壁，緩慢加入3mL IXSTE buffer於針筒內，當cDNA流過柱底時， 染液將逐步擴散，嚴密跟蹤染液的進程。(4)收集樣品用200 μ L離心管收集分級物，當染液前鋒到達移液管的-0. 5cm處時，開始收集， 每管收集3滴，連續收集至染液尾端到達0. 3cm處，每管收集約100 μ L，將收集得的cDNA樣品(共11管)編號，放入-20°C冰箱。將收集得的cDNA樣品分管進行非變性SDS-PAGE電泳，將能觀察到DNA條帶的 cDNA管中的樣品混合，以備下一步實驗。4.雙鏈cDNA的連接和包裝(1)雙鏈cDNA的連接按下列連接體系將雙鏈cDNA與λ ZAP-II載體連接cDNALOyLIOXligase buffer0. 5 μ LT41igase0. 5 μ LIOmM rATP(PH7. 5)0. 5 μ Lλ ZAP-IIvectorl.OyL滅菌雙蒸水1.5yL-----------------------------5. OyL連接反應4°C水浴連接過夜。(2)連接產物的包裝從-80°C冰箱中快速移出包裝抽提液，用手握住包裝抽提液管，待其剛好融化便立即加入連接好的cDNAl. 0 μ L，輕輕攪拌一下，快速離心3-5秒，然後將包裝抽提液管置於 22°〇水浴中211，而後加入50(^1^ SM buffer和20 μ L氯仿，輕輕混勻，簡單離心以沉澱碎片，取上清液即為cDNA文庫。實施例2cDNA文庫的免疫篩選1.篩庫血清的處理取手術確診的囊性包蟲病患者混合血清IOOyLdO份，每份10 μ L)，加入ImL用 TBSI^tl 10稀釋的Ε. coli XLl-blue MRF，裂解液，於室溫吸附過夜後，5000g離心 lOmin，將上清液轉移至新的離心管中，用抗體稀釋液稀釋，使血清終濃度為1 200，於4°C保存。2. cDNA文庫的免疫篩選2.1 初篩2. 1.1細菌培養用無菌槍頭挑取E. coli XLl-blue MRF，劃線接種於LB培養平板(含15μ g/ mLTet)，37°C倒置培養過夜。次日，挑取E. coli XLl-blue MRF』的單菌落於3mL LB培養基 (含IOmM MgS04，0. 2%麥芽糖，15μ g/mL Tet)中，37°C，200rpm振蕩培養過夜。次日，取培養液100 μ L轉接到新的3mL LB培養基中，37°C，200rpm振蕩培養約池。
將培養液2000rpm，離心lOmin，棄上清液後，用IOmM MgS04重懸沉澱，測定OD值， 並稀釋到0D600 = 0. 5。NZY平板用前於37°C溫育lh，以除去平板表面的水滴。2. 1.2噬菌體感染於微波爐中溶解NZY Top Agar, 50°C水浴溫育。將上述菌液200 μ L和細粒棘球蚴的cDNA文庫(噬菌體液)5 μ L在15mL的培養管內混勻，37°C溫育15min。向上述混合物中加入3mLNZY Top Agar,顛倒混勻，立即鋪在NZY培養基上，輕輕搖晃使其平鋪，室溫下凝固 IOmin0於42°C培養箱育板，直至觀察到可見的噬菌斑出現(約4h20min)(如圖1所示)。2. 1. 3融合蛋白的誘導表達用滅菌的ddH20稀釋IPTG至10mM，使用前20min將硝酸纖維素膜標記後浸泡入 IPTG中，浸透後取出，用濾紙吸乾多餘的溶液，避免噬菌斑間產生交叉。標記平板，將對應的 NC膜覆蓋到平板上(用鑷子夾住NC膜從平板的一邊將膜輕輕放下，避免產生氣泡)，37°C 培育3. 5h。把平板轉移到4°C冰箱，冷卻lOmin，然後用針頭在NC膜，平板上的不對稱三點做好標記後，用鑷子將NC膜從平板上輕輕剝離，平板封口後存放於4°C冰箱。將NC膜放入 TBST (約25mL/膜)中至少洗三次，每次至少15min，除去殘留的NZYTopAgar。將NC膜浸在封閉液中(約8mL/膜)，室溫輕微振蕩，封閉過夜。2. 1. 4表達目的融合蛋白噬菌斑的檢測將NC膜從封閉液中取出，用TBST (約25mL/膜)洗膜兩次，每次至少5min。加入篩庫血清(約8mL/膜)，室溫下輕微振蕩池後將血清回收。再用TBST洗膜3次(約25mL/ 膜)，每次至少lOmin。加入羊抗鼠鹼性磷酸酶結合物(用抗體稀釋液1 8000稀釋)(約 SmL/膜)，室溫下反應lh，用TBST洗膜三次，每次至少lOmin，用TBS洗膜2次，每次5min， 洗去殘留的Tween 20。將NC膜從TBS中取出，用濾紙吸乾多餘的溶液，放入AP Buffer浸泡!Bmin。用Color Development Solution 稀釋 NBT 至終濃度為 0. 3mg/mL, BCIP 終濃度為 0. 15mg/mL (將BCIP逐滴加入NBT中，防止形成沉澱)，配製成NBT-BCIP顯色液。將NC膜浸入NBT-BCIP顯色液中，在暗處進行顯色反應直到陽性斑點清晰可見(一般不超過IOmin)。將NC膜從NBT-BCIP顯色液中取出，加入另一盛有終止液的容器中，終止顯色反應。取出NC膜，室溫下風乾，避光保存。
2. 1.5陽性克隆定位根據NC膜上陽性斑點在原始LB培養板上的相應位置，挑取單個陽性噬菌斑，置於 200 μ L SM buffer (含1滴氯仿)中，室溫下放置30min，使噬菌體顆粒擴散出瓊脂塊後，4°C 保存。記錄每個噬菌斑的陽性反應強度。2 復篩將保存有陽性克隆的SM buffer取出1 μ L，用SM buffer稀釋至10 μ L，取1 μ L 按照之前的方法進行噬菌體展示，目的是獲得單一的陽性噬菌斑克隆。3 三篩重複復篩的步驟，直至平板上出現100%的陽性克隆。實施例3陽性噬菌體刪除環化為pbluescript重組質粒挑取LB培養基中的E. coli XLl-blue MRF』單菌落於3mL LB培養基(含IOmMMgS04，0. 2%麥芽糖，lSyg/mL Tet)中，37 °C，200rpm振蕩培養過夜。次日，取培養液 100 μ L轉接到新的3mL LB培養基中，37°C，200rpm振蕩培養約2h。培養液經5000g,5min 離心沉澱細菌，用IOmM MgS04重懸至0D600 = 1.0。在細菌培養管中加入200 μ L Ε. coli XLl-blue MRF，重懸液、50 μ L含有陽性噬菌體的SM buffer和1 μ L輔助噬菌體。將細菌培養管放置於37°C水浴中15min，然後加入3mLLB培養基，於37°C振蕩培養證。取出細菌培養管，在65°C加熱20min，然後3000g離心15min，將上清轉入一個新Ep管中，置於4°C保存。SOLR 菌於 LB 培養基(含有 IOmM MgS04, 50 μ g/mLKan)然後 5000g，5min 離心沉澱細菌，用IOmM MgS04重懸至0D600 = 1. 0，在1. 5mLEP管中加入200 μ LSOLR菌和前面的上清保存液5 μ L，置於37°C水浴中15min，然後取出100 μ L均勻塗布於LB (含100 μ g/mLAmp) 瓊脂平板上，37°C倒置培養過夜。實施例4pblueSCript重組質粒的提取、檢測和分析挑取刪除環化後的SOLR菌單菌落於LB (含100 μ g/mL Amp)液體培養基中，37°C， 200rpm振蕩培養過夜。次日，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit I抽提環化後的質粒DNA， 用30 μ L ddH20將質粒DNA洗脫。將提取的質粒送生工生物技術有限公司進行序列測定(T3，T7通用引物)，將序列在 NCBI 中進行 Blastx 和 Blastn 同源性分析,在 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/ gorf. html在網站進行結構域分析，確定正確的閱讀框架；在http://npsa-pbil. ibcp. fr/ cgi-bin/npsa_automat. pi ？ page = npsa_nn. html 網立佔進 二級結構分析，在 http:// www. ebi. ac. uk/InterProScan/網站進行結構域分析。(如圖2、圖3和圖4所示)。將本發明的基因的鹼基序列在NCBI中進行Blastx分析，未發現具有同源性的基因。如圖2可知，將本發明的基因的鹼基序列在NCBI中做Blastx分析，其編碼蛋白的序列與SEQ ID N0 3的1-219位胺基酸序列相同。如圖3所示，對本發明基因的編碼蛋白進行二級結構分析， 其α-螺旋佔47. 49%，β-片層佔6. 85%，而無規捲曲結構佔45. 66%。由於α-螺旋和 β-片層兩種結構有氫鍵維持，化學鍵鍵能比較高，不易變形，能夠較牢固的維持蛋白的高級結構，很難與適合的抗體結合，且經常位於蛋白質的內部，不易形成抗原表位。而蛋白質的轉角及無規捲曲等柔性結構則比較鬆散，易於發生扭曲、盤旋並容易出現在蛋白的表面， 所以成為表面抗原的可能性較大。而該序列近一半的二級結構為無規捲曲，說明該序列具有含有B細胞表位的結構基礎。如圖4所示，對該發明的基因編碼蛋白進行結構域分析可知，該序列含有穀胱甘肽轉移酶的結構域。實施例5目的基因的克隆、轉化根據目的基因的序列，選擇合適的核酸內切酶(EcoRI)將目的基因從 Pbluescript SK-載體中切下，同時用同樣的內切酶酶切表達載體pGEX_3X，酶切體系如
下
IOXBuffer Tango18 μ L
EcoRI6 μ L
XhoI6 μ L
重組載體/PGEX-3X載體9μ L
滅菌雙蒸水51 μ L
------------------------------------------90 μ L酶切反應條件37°C酶切16h如圖5和圖6所示，將酶切產物分別進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下將凝膠中的目的片段( 1400bp)和表達載體( 5000bp)切下，用Solarbio公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，將目的基因和表達載體用T4連接酶連接，連接體系如下T4 Iigase1 μ LΤ4 ligase buffer1 μ LpGEX_3X 載體4μ L目的基因4yL-----------------------------10 μ L連接反應條件16°C下過夜連接取5μ L連接產物轉化E. coli Dffia細胞，具體方法為將5 μ L的連接產物與 200 μ L Ε. coli DH5a感受態細胞混勻，冰浴30分鐘，之後於42°C水浴熱休克90秒鐘，再置於冰上1-2分鐘，然後加入800 μ L預熱的SOC培養基，370C，200rpm震蕩培養45分鐘，取 200 μ L菌液塗LB+Amp平板，倒置於37°C溫箱過夜培養。在平板中挑取5-10個單菌落，分別置於5mLLB+Amp液體培養基中，37°C，200rpm 過夜震蕩培養，送生工生物技術有限公司測序檢測連接是否成功，將連接成功的重組載體，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit I抽提質粒，取1 μ L質粒照以上方法轉化Ε. coli BL21 (DE3)細胞。同時取1 μ L pGEX-3X空載體轉化E. coliDH5a細胞。實施例6重組蛋白的表達和純化1.重組蛋白的小量表達分別取轉化重組載體及含有PGEX-3X空載體的E.coli BL21 (DE!3)單菌落於 3mLLB (含100μ g/mL Amp)培養基，37°C，200rpm振蕩培養過夜，而後將ImL菌液加入到2mL 新鮮LB (含100μ g/mLAmp)培養基中，37°C，200rpm振蕩培養2h，而後加入IPTG至終濃度為ImM，37°C，200rpm誘導表達3h。離心收集菌體，用PBS溶液洗兩次，將兩者同時進行10 % SDS-PAGE電泳，觀察重組蛋白是否表達。2.重組蛋白的大量表達取確定表達的E.coli BL21(DE3)單菌落於 IOOmLLB (含 100 μ g/mL Amp)培養基，37°C，200rpm振蕩培養過夜，而後將IOOmL菌液加入到IOOOmL新鮮LB (含IOOyg/ mL Amp)培養基中，37°C，200rpm振蕩培養濁，而後加入加入IPTG至終濃度為ImM，， 200rpm誘導表達4h。離心收集菌體，用PBS溶液洗兩次，而後在液氮和37°C水浴中反覆凍融三次，加入20倍壓積的PBS溶液，超聲8次(每次30s，間隔lmin)，而後加入4mL 20% TritonX-100溶液至終濃度為1 %，冰上攪拌Ih後，20000g離心30min，收集上清和沉澱，進行10% SDS-PAGE電泳，以檢驗蛋白的溶解性。如圖7所示。3.重組蛋白的純化由於該蛋白存在於上清中，故用GE Healthcare公司的Glutathione Sepharose4B 純化柱純化上清獲得重組蛋白，具體操作方法按照純化柱的說明書進行，獲得重組蛋白的濃度為3. 7mg/mL。實施例7重組蛋白的實驗室評價1.天然AgB的純化取新鮮羊肝包囊液，以IOOOg離心30min，吸上清液入透析袋，用pH5. 0的 5mM乙酸緩衝液於4 °C下透析過夜，50000g離心30min，棄上清以除去白蛋白。沉澱用 0. 2MPBS (pH8. 0)溶解，加40 %飽和硫酸銨，離心除去沉澱球蛋白。隨後樣品(上清)在水浴中煮沸15min，50000g離心1小時。棄沉澱，上清為AgB02. ELISA以pH9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋的純化的天然AgB和重組蛋白L1包被96孔酶標板， 每孔100 μ 1 (每孔抗原量為1 μ g)，4°C過夜。PBS-T緩衝液洗滌3次，每次五分鐘，之後用含 5%脫脂奶粉的PBS溶液37°C封閉lh。同法用PBS-T緩衝液洗滌3次後每孔加入1 200 稀釋的囊型包蟲病、泡型包蟲病、囊蟲病、其它寄生蟲病患者以及健康人血清100μ 1，37°C 孵育1小時。PBS-T洗滌後加入用PBS稀釋(1 30，000)的羊抗人IgG辣根過氧化物酶結合物，每孔100μ 1，37°C孵育1小時。PBS-T洗滌後，每孔加入100 μ 1 3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺(TMB)底物系統室溫反應5min後，加100 μ 1 2mol/L H2SO4終止反應。在酶標儀上以 450nm波長讀取OD值。以60個非疫區健康人血清的酶標OD值均值加3個標準差(X+3SD) 定為陽性閾值。每份血清做兩個孔，如果兩孔的平均值大於或等於陽性閾值判為陽性。3.結果用本發明實施例6製備的重組蛋白L1進行實驗室評價結果如表1所示。由表1 可以看出本發明的重組蛋白L1獲得的敏感性和特異性分別為72. 41% (63/87)和92. 36% (133/144)，目前診斷囊型包蟲病效果最佳的天然純化抗原B的診斷敏感性和特異性分別為87. 36% (76/87)和84. 72% (122/144)，兩者的敏感性和特異性均沒有顯著性差異(P > 0. 05)。表1重組蛋白L1和天然純化AgB對包蟲病患者和其它寄生蟲病患者血清的反應性
抗貞類型
血清類型纖純化AglT,抗
W9200000 7617500000 87202512108960
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8 -01 可見與天然純化抗原B相比，穀胱甘肽轉移酶的診斷敏感性稍差(P < 0. 05)，但是其診斷特異性優於天然純化抗原B (P < 0. 05)，與其它寄生蟲病的交叉反應較少，可與其它抗原聯合應用診斷囊型包蟲病。
權利要求
1.一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因，其鹼基序列如SEQ ID N0:1所示。
2.權利要求1所述的細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白質。
3.如權利要求2所述的細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示，或者與SEQ ID NO 3所示的1-219位胺基酸序列相同。
4.一種表達載體，其特徵在於含有權利要求1所述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因。
5.一種融合蛋白，其特徵在於含有權利要求1所述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白。
6.一種宿主細胞，其特徵在於由權利要求4所述的表達載體轉化或者轉導。
7.一種抗體，其能與權利要求2所述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因編碼的蛋白質特異性結合。
8.權利要求2所述的一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因編碼的蛋白質在製備用於免疫囊型包蟲病的疫苗中的應用。
9.權利要求4所述的一種表達載體在製備用於診斷囊型包蟲病的診斷試劑中的應用。
10.權利要求5所述的一種融合蛋白在製備用於診斷囊型包蟲病的診斷試劑中的應用。
11.權利要求7所述的一種抗體在製備用於診斷囊型包蟲病的診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物工程領域，提供了一種細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因，其鹼基序列如SEQ ID NO1所示。本發明還提供了上述的細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白質。上述的細粒棘球絛蟲穀胱甘肽轉移酶基因所編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示，或者與SEQ ID NO3所示的1-219位胺基酸序列相同。本發明獲得的重組蛋白可以用於囊型包蟲病患者的免疫診斷，用該重組蛋白包板，用ELISA方法檢測囊型包蟲病、泡型包蟲病、囊尾蚴病、其它寄生蟲病患者以及健康人血清，獲得的敏感性和特異性分別為72.41％和92.36％。
文檔編號C12N1/21GK102168100SQ20111003774
公開日2011年8月31日 申請日期2011年2月14日 優先權日2011年2月14日
發明者朱慧慧, 楊玥濤, 汪俊雲, 石鋒, 高春花 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所