免疫原性降低和/或清除率降低的葡激酶衍生物的鑑定、生產和應用的製作方法

2023-05-26 10:12:46

專利名稱：免疫原性降低和/或清除率降低的葡激酶衍生物的鑑定、生產和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫原性降低的新葡激酶衍生物，它們能通過連續輸注或單次靜脈內大劑量注射施用，涉及它們的鑑定、生產和在治療動脈血栓形成中的應用，涉及用於治療動脈血栓形成的藥用組合物的製備。本發明更特別地涉及基因工程葡激酶衍生物在製備治療心肌梗塞的藥用組合物中的應用。
葡激酶，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的某些株產生的一種蛋白質，在超過40年前就證明其具有纖維蛋白溶解特性(1，2)，似乎成為急性心肌梗塞患者中的強溶栓劑(3，4)。已經從噬菌體sakΦC(5)和sak42D(6)中以及從溶原性金黃色葡萄球菌株的基因組DNA(sakSTAR)中(7)克隆了葡激酶基因。葡激酶基因編碼一種163個胺基酸的蛋白質，胺基酸28對應於全長成熟葡激酶的NH2端殘基(6，8，9)。

圖1顯示了野生型變體SakSTAR的成熟蛋白質序列(9)。在sakΦC、sak42D和sakSTAR基因的編碼區中只發現了四個核苷酸差異，其中之一構成沉默突變(6，8，9)。在血漿環境中，葡激酶能夠溶解纖維蛋白凝塊而沒有相關的纖維蛋白原降解(10-12)。葡激酶的這種纖維蛋白特異性是α2-抗纖溶酶對與纖維蛋白結合的纖溶酶。葡激酶複合物抑制降低、α2-抗纖溶酶抑制後葡激酶從纖溶酶。葡激酶複合物中的再循環、以及α2-抗纖溶酶防止循環纖溶酶原。葡激酶轉化為纖溶酶。葡激酶的結果(13-15)。另外，葡激酶對循環纖溶酶原具有弱親和力，但對纖維蛋白原結合的纖溶酶原具有高親和力(16)，葡激酶需要纖溶酶的NH2端加工來顯示其纖溶酶原激活能力(17)。在幾種實驗動物模型中，葡激酶在全血或血漿凝塊的溶解方面與鏈激酶似乎是同等的，但在富含血小板或回縮的血栓溶解方面明顯強於後者(18，19)。葡激酶是一種異源蛋白質，在人中是有免疫原性的。葡激酶的固有的免疫原性，象鏈激酶一樣，顯然阻礙了其非限制性應用。不僅先前存在高抗體效價的患者難以用這些藥劑的溶栓作用治療，而且可能發生變應性副作用和偶然的危及生命的過敏反應(20)。因為鏈激酶和葡激酶都是異源蛋白質，所以顯然它們的免疫原性不能通過蛋白質工程降低。實際上，未曾報導過從鏈激酶產生活性低分子量片段的成功嘗試。對於葡激酶，NH2端17個胺基酸或COOH端2個胺基酸的缺失使分子失活，另外它對位點專一誘變滅活是極敏感的(21)。
因此，本發明的目的在於提供優選地具有較高比活和／或較低血漿清除率和／或增強的溶栓能力的葡激酶的低免疫原性變體。
在最終導致本發明的研究中，已經發現野生型葡激酶變體SakSTAR(9)含有三個非重疊的優勢免疫表位，其中至少兩個可被特殊定點誘變消除，而不滅活分子。這已在EP-95200023．0中公開(22)。正如在兔和狒狒模型中和在外周動脈阻塞患者中所證明的，這些工程化葡激酶變體與用野生型葡激酶治療的患者中產生的抗體是低反應性的，並且比野生型葡激酶有明顯低的免疫原性(22)。
本發明涉及用於鑑定、生產和應用與野生型葡激酶相比顯示降低的抗原性和免疫原性的葡激酶衍生物，及用於用聚乙二醇選擇性衍生的變體的總方法。這些衍生物優選地具有較高的比活和／或較低的血漿清除率和／或增強的溶栓能力。這些衍生物基本上具有野生型葡激酶或其修飾形式的胺基酸序列和基本上完全的生物活性，但與一系列鼠單克隆抗體和／或與用野生型SakSTAR治療在患者中誘導的抗體的反應性降低。聚乙二醇取代(「PEG 化」)的變體具有降低的血漿清除率，使其特別適用於單次靜脈內大劑量施用。也能使用其它藥學可接受的大分子代替PEG。
更特別地，本發明提供葡激酶衍生物SakSTAR(K35X，G36X，E65X，K74X，E80X，D82X，K102X，E108X，K109X，K121X，K130X，K135X，K136X，+137X)，其具有如圖1所示的胺基酸序列，其中位點35的Lys、位點36的Gly、位點65的Glu、位點74的Lys、位點80的Glu、位點82的Asp、位點102的Lys、位點108的Glu、位點109的Lys、位點121的Lys、位點130的Lys、位點135的Lys和／或位點136的Lys中的胺基酸被替換為其它胺基酸，和／或其中在COOH端添加一個胺基酸，從而改變了向患者施用後的免疫原性，而不明顯降低比活。
本發明進一步優選的實施方案是表1、3、4、5、6、7、8、B、19和20中列出的葡激酶衍生物，其具有如圖1所示的胺基酸序列，其中指定的胺基酸被替換為其它胺基酸，從而降低了用葡激酶治療的患者血漿中SakSTAR特異性抗體的吸附，而不降低比活。
比活升高而免疫原性降低的衍生物是下列衍生物SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(K35A)、saksTAR(E8OA)、SakSTAR(D82A，S84A)、SakSTAR(T90A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(K130A)、SakSTAR(V132A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(G36R)、SakSTAR(H43R)、SakSTAR(G36R，K74R)、SakSTAR(K35E)、SakSTAR(K74Q)、SakSTAR(K130T)、SakSTAR(V132L)、SakSTAR(V132T)、SakSTAR(V132N)、SakSTAR(V132R)、SakSTAR(K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，K13OT，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，H43R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K86A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，T71S，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，V132R，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，T90A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K109A，K130，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E108A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K121A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，+137K)、SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65S，K74R E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(S34G，G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65N，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K57A，E58A，E61A，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，S103A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R，K136A)、SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
其中，編碼為SY19的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和編碼為SY161的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)是特別優選的。
除了上述置換衍生物之外，本發明還涉及另外胺基酸被Cys置換的衍生物。這類置換可導致二聚化和／或增高的比活和／或降低的清除率和／或增強的溶栓能力。當用聚乙二醇取代衍生物時特別獲得降低的血漿清除率。
這些葡激酶衍生物的優選實施方案是其中Cys被分子量可達20kDa的聚乙二醇化學修飾的衍生物。在特別的實施方案中，NH2端區10個胺基酸中選擇的胺基酸被置換為用分子量可達20kDa的聚乙二醇化學修飾的Cys。這些衍生物的特徵在於以降低的劑量單次靜脈內大劑量施用後明顯降低的血漿清除率和保持的溶栓能力。
更特別地，位點2或3的絲氨酸被置換為半胱氨酸，而該半胱氨酸已用分子量5、10或20kDa的聚乙二醇化學修飾。這些衍生物的優選實施方案是如表20所示的SY161(S3C-MP5)、SY161(S3C-P10)、SY161(S3C-P20)、SY19(S3C-MP5)、SY19(S3C-SP5)、SY19(S2C-SP5，S3C-SP5)、SY19(S3C-P20)、SY19(S3C-P10)。
半胱氨酸的存在使得能形成本發明的兩種葡激酶衍生物的二聚體。
本發明也涉及一種生產本發明的衍生物的方法，包括製備至少包含提供生物活性的葡激酶編碼序列部分的DNA片段；對該DNA片段進行體外定點誘變，將野生型胺基酸的一種或多種密碼子替換為另一種胺基酸的密碼子；在適當的載體中克隆突變的DNA片段；用該載體轉化或轉染適當的宿主細胞；在適於表達該DNA片段的條件下培養該宿主細胞；將表達的葡激酶衍生物純化為均一的，和用聚乙二醇衍生該變體。
該DNA片段優選地是質粒pMEX602sakB(22，23)的453bpEcoRI-HindⅢ片段，體外定點誘變優選地通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應進行。這種重疊延伸PCR優選地用可獲得的或產生的野生型SakSTAR或SakSTAR變體作為模板，用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)或Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)進行(24)。
本發明也涉及包含至少一種根據本發明的葡激酶衍生物與適當賦形劑的藥用組合物，其用於動脈血栓形成的治療。含有低免疫原性葡激酶變體或「PEG 化」的葡激酶變體作為有效成分，用於治療人的動脈血栓形成或獸醫實踐的藥用組合物，可以採用粉末或溶液的形式，並可用於靜脈內、動脈內或腸胃外施用。這些組合物的製備可通過將活性化合物與藥學可接受的中性賦形劑(如水性或非水性溶劑、穩定劑、乳化劑、去汙劑、添加劑)結合(例如混合、溶解等)，另外，必要時與染料結合。
此外，本發明還涉及葡激酶衍生物治療動脈血栓形成尤其是心肌梗塞的用途，涉及葡激酶衍生物製備用於治療動脈血栓形成尤其是心肌梗塞的藥用組合物的用途。在上文和下文中，術語「衍生物」、「突變體」和「變體」可交換使用。
根據本發明，其它變體和改進對於本領域的技術人員是顯然的。因此隨機誘變可能產生免疫原性降低和功能活性可能升高的其它變體，而缺失或置換為其它胺基酸可產生具有降低的免疫原性的其它變體。
本發明將在下列實施例中更詳細地證明，然而這不是意在限制本發明的範圍。在實施例中，參照下列附圖圖1．野生型葡激酶SakSTAR的蛋白質序列。編號從成熟全長葡激酶的NH2端胺基酸開始。
圖2．對外周動脈阻塞患者動脈內輸注SakSTAR(空心圓，n=9)、SakSTAR(K74A)(實心圓，n=11)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(空心正方形，n=6)後，中和活性(左圖)和抗施用試劑的特異IgG(右圖)的時程。數據表示中值和四分位數間距，單位為μg／ml。
圖3．野生型葡激酶、具有指定的胺基酸置換的SakSTAR的蛋白質序列。
正方形單胺基酸置換；圓形組合的(2-3個)胺基酸向Ala的置換。
圖4．SakSTAR，(A)；SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)，(B)；SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，(C)；和SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)，(D)的溫度穩定性。(○)4℃；(●)20℃；(_)37℃；(_)56℃；(□)70℃。
圖5．對外周動脈阻塞患者動脈內輸注SakSTAR(圓形，n=6)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)(正方形，n=6)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(三角形，n=6)後，中和活性(左圖)和抗施用試劑的特異IgG(右圖)的時程。數據表示中值和15-85百分範圍，單位為μg／ml。
實施例實施例1野生型葡激酶的表位作圖用BIAcore儀器(Pharmacia，Biosensor AB，Uppsala，瑞典)，經實時生物特異性相互作用分析(BIA)，測定抗野生型SakSTAR的一系列15種鼠MAb(22)的表位特異性。如廠商推薦，用胺偶聯試劑盒(Pharmacia，Biosensor AB)如廠商推薦將這些MAb固定於Sencor Chip CM5的表面(25)。在6分鐘內，以5μL／分鐘的流速，以在pH5．0的10mmol／L乙酸鈉中20μg／mL的濃度，從蛋白質溶液中進行固定。這導致5000-10000共振單位(RU)的抗體(相當於0．035-0．07pmol／mm2)的共價連接。SakSTAR溶液在20℃下連續流動通過傳感器表面。溶於10mmol／LHEPES、3．4mmol／L EDTA、0．15mol／L NaCl和0．005％表面活性劑P20，pH7．2中的至少四個濃度的每種分析物(範圍，50nmol／L-50mol／L)在6分鐘內以5μL／分鐘的流速注射到締合相中。然後將樣品替換為緩衝液，同樣是在6分鐘內以5μL／分鐘的流速。每一循環後，傳感器晶片表面通過注射5μL 15mol／L HCl再生。表觀締合(kass)和表觀解離(kdiss)速率常數如另文(26)詳述由sensorgram得出，締合平衡常數(KA)計算為其比率。
野生型和變體SakSTAR與固定化的(insolubilized)MAb結合的平衡締合常數的測定(表1)得出107-108(mol／L)-1的表觀締合常數，這比以前對這些MAb與固定野生型SakSTAR結合獲得的表觀締合常數(22)低一到兩個數量級。如果固定MAb而非SakSTAR變體是固定化的，則可避免二價MAb的親合作用。該值確實極好地符合MAb的已知締合常數，因此在本發明中使用其「相反」過程。
在表中，標明「變體」的列說明多種葡激酶衍生物，它們的識別方法是在括號中以單字母符號列出被置換的胺基酸，隨後是其在成熟葡激酶序列的位置號，再之後是單字母符號的替換胺基酸；列「Exp．」表明表達水平，單位為mg／L，列「比活」表明如實施例2所述的內部單位(HomeUnit)的比活。標識「17G11」、「26A2」等是指如參考文獻22所述可與指定的表位Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ結合的單克隆抗體。表位I可被抗體簇17G11、26A2、30A2、2B12和3G10識別，而表位Ⅱ可被抗體簇18F12、14H5、28H4、32B2和7F10識別，表位Ⅲ可被抗體簇7H11、25E1、40C8、24C4和1A10識別。人血漿「庫」表明最初16名和隨後10名通過SakSTAR治療免疫的患者的血漿庫，「亞庫B」表明吸附少於50％的用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)誘導抗體的三名患者的血漿庫，「亞庫C」表明吸附＞90％的用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)誘導抗體的三名患者的血漿庫(22)。
在表6、7和8中，也使用通過SakSTAR治療免疫的40名患者血漿的另一種庫(庫40)。實施例2葡激酶「帶電簇-丙氨酸」突變體的「丙氨酸-野生型」回復變體的構建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合併血漿的吸附1．引言如上所述，野生型葡激酶(SakSTAR變體(9))含有三個非重疊的優勢免疫表位，其中的兩個能通過兩個(K35A，E38A或E80A，D82A)或三個(K74A，E75A，R77A)帶電胺基酸簇被替換為Ala的特殊定點置換消除(22)。組合突變體SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)，其中Lys35、Glu38、Lys74、Glu75和Arg77被替換為Ala，和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)，其中Lys74、Glu75、Arg77、Glu80和Asp82被替換為Ala(以前分別稱為SakSTAR．M3．8和SakSTAR．M8．9(22))，發現它們與抗三個優勢免疫表位之中兩個的鼠單克隆抗體的反應性降低，並且平均僅吸附用野生型SakSTAR治療的16名患者中產生的2／3的中和抗體(22)。在兔和狒狒的實驗血栓溶解模型中和在外周動脈阻塞患者中，這些突變體也誘導比野生型SakSTAR更少的抗體形成(22)。然而，它們的比活降低為野生型SakSTAR的大約50％，這將在這些化合物的臨床應用方面受到一定程度的關注。
在提高活性和穩定性而不喪失降低的抗體識別的嘗試中，研究了這些置換胺基酸中的一種或多種向野生型殘基系統回復的影響。構建、純化並在比活、與一系列鼠單克隆抗體的反應性、用野生型SakSTAR治療的患者血漿中抗體的吸附等方面表徵了14個新突變體(表1)，本實施例因此集中於丙氨酸向以上所列SakSTAR的7種胺基酸即K35、E38、K74、E75、R77、E80和D82中的一個或多個野生型殘基的回覆。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報導(22)。限制酶購自Pharmacia(Uppsala，瑞典)或Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)。T4 DNA連接酶、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和鹼性磷酸酶從Boehringer Mannheim獲得。酶促反應用供應商建議的條件進行。質粒DNA用QIAGEN純化方案(Westburg，Leusden，荷蘭提供)分離。pMEX．602sakB(即pMEX．SakSTAR)如另文所述(23)構建。SakSTAR、SakSTAR(K35A，E38A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)如另文所述(22)產生並純化。大腸桿菌的轉化用磷酸鈣法進行。DNA測序用雙脫氧鏈終止反應法和自動雷射螢光A．L．F．TM(Pharmacia)進行。顯色底物(S2403)L-焦穀氨醯基-L-苯丙氨醯基-L-賴氨酸-對硝基苯胺鹽酸鹽購自Chromogenix(比利時)。125I標記的纖維蛋白原購自Amersham(UK)。本實施例中使用的其它所有方法都曾在以前描述(22，27)。3．表達質粒的構建以可獲得的或產生的SakSTAR變體作為模板，用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Leusden，荷蘭)，通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(SOE-PCR)(24)構建編碼SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(E75A)的質粒。PCR擴增兩個片段，第一個用引物5』-CAGGAAACAGAATTCAGGAG-3』從葡激酶基因的5』端開始到待誘變區(正向引物)，第二個用引物5』-CAAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC-3』從相同區(反向引物)到葡激酶基因的3』端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區(引物未顯示)。然後用Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)以新的無引物PCR將兩個純化片段裝配在一起。7個循環(94℃1分鐘，70℃1分鐘)後，通過向PCR反應液中加入5』和3』末端引物(見上)並循環25次(94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘)再擴增延伸產物。純化終產物，用EcoRI和HindⅢ消化，並克隆到pMEX602sakB的相應位點。編碼SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)的質粒的裝配方法包括，用BpmI消化pMEX602sakB和pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)，該酶在SakSTAR的K35和E38密碼子之間切開，並連接所需的片段。編碼SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)的質粒的構建方法包括，用BpmI消化pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和pMEX．SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，並再連接所需的片段。編碼SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)的質粒的構建方法是，用pMEX．SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)作為模板進行兩個PCR，隨後是限制連接和向pMEX602sakB的再克隆。4．SakSTAR變體的表達和純化如下所述，從在LB培養基中[SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K74A)、SakSTAR(E75A)和SakSTAR(E75A，D82A)或在優質肉湯(TB)(28)培養基中[SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E80A)和SakSTAR(D82A)]生長的轉化大腸桿菌WK6中表達並純化SakSTAR變體。
對於LB培養基中產生的衍生物，用20mL等份過夜飽和培養物接種2L體積的含100μg／mL氨苄青黴素的LB培養基。37℃溫育3小時後，加入IPTG(200μmol／L)誘導從tac啟動子開始的表達。生產階段可進行4小時，之後以4000轉每分離心20分鐘沉澱細胞，重懸浮於1／20體積(100mL)的0．01mol／L pH6．5磷酸緩衝液中，並通過在0℃超聲處理破碎。20000轉每分離心20分鐘除去細胞碎片，將含有胞質可溶蛋白質部分的上清液貯存於-20℃直到純化。
對於TB培養基中產生的衍生物，用4mL等份過夜飽和LB培養基培養物接種2L含100μg／mL氨苄青黴素的優質肉湯培養液。在30℃劇烈通氣下培養該培養物20小時。離心沉澱細胞，重懸浮於1／10體積(200mL)的0．01mol／L pH6．5磷酸緩衝液中，並通過在0℃超聲處理破碎。然後以20000轉每分離心懸液20分鐘，將上清液貯存於-20℃直到純化。含有SakSTAR變體的澄清細胞裂解液在1．6×6cm SP-Sephadex柱上進行層析，隨後在1．6×5cm Q-Sepharose柱上層析[變體SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)]，或在1．6×6cm苯基-Sepharose柱上層析[變體SakSTAR(K35A，E38A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(K74A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)和SakSTAR(E75A，D82A)]。合併經SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用於進一步分析。5．物理化學和生物化學分析根據Bradford(29)測定蛋白質濃度。SakSTAR溶液的比活用顯色底物試驗測定，該試驗用80μL SakSTAR溶液和如另文所述(30)製備的100μL Glu-纖溶酶原溶液的混合物(終濃度0．5μmol／L)在微量滴定板中進行。37℃溫育30分鐘後，通過加入20μL S2403(終濃度1mmol／L)並測定405nm的吸光度定量產生的纖溶酶。活性以內部單位(HU)表示，比較根據胺基酸組成測定(7)，每mg蛋白質推定100，000HU(100kHU)活性的內部標準(lot STAN5)。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進行SDS-PAGE。通過在1％ SDS和1％二硫蘇糖醇存在下於100℃加熱3分鐘進行樣品的還原。用顯色底物試驗測定的不同SakSTAR突變體的比活總結於表1中。6．與鼠單克隆抗體的結合與以前的發現(22)一致，SakSTAR(K74A，E75A，R77A)不與識別表位Ⅰ的5種MAb中的4種反應，而SakSTAR(K35A，E38A)不與識別表位Ⅲ的5種MAb中的3種反應，SakSTAR(E80A，D82A)不與這5種中的4種反應。這些降低的反應性在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)中累加。SakSTAR(K74A，E75A，R77A)的降低的反應性在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)和SakSTAR(K35A，E75A，R77A)中完全保留，在SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)和SakSTAR(E75A)中大部分保留，但在SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)和SakSTAR(K74A)中保留很少，表明E75是識別SakSTAR表位I的4種MAb結合的主要貢獻者。然而，令人吃驚地，表位Ⅰ抗體與SakSTAR(E75A，D82A)的結合在由具有確定DNA序列的表達質粒的兩種獨立製備中正常。表位Ⅲ的3種MAb與SakSTAR(K35A，E38A)的降低的反應性需要K35和E38兩者，這用SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)，用SakSTAR(E38A，E75A)和SakSTAR(K35A，E75A)，用SakSTAR(E38A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E75A，R77A)得到證明。簇Ⅲ的4種MAb與SakSTAR(E80A，D82A)的降低的反應性在SakSTAR(D82A)中保留，但在SakSTAR(E80A)中不保留。7．通過用野生型SakSTAR治療在患者中產生的抗體的吸附使用用SakSTAR治療(4，31)數周后獲得的16名急性心肌梗塞患者的血漿樣品。這些樣品的葡激酶中和活性如下測定。向300μL檸檬酸鹽人血漿和50μL緩衝液或待測血漿的混合液中加入漸增濃度的野生型或變體SakSTAR(50μL體積，含有0．2-1000μg／mL)，隨後立即加入100μL含有凝血酶(50NIH單位／mL)和CaCl2，(25mmol／L)的混合液。測定血漿凝塊溶解時間，並對SakSTAR部分的濃度作圖。從該曲線確定20分鐘後引起完全凝塊溶解的葡激酶部分的濃度。中和活性效價確定為待測血漿與緩衝液值之間的差，並以μg每mL待測血漿表示。另文(22)曾報導了個體患者的結果。對於本發明，製備三種血漿庫，一種來自於可獲得充足殘餘血漿的10名患者，一種來自於用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附少於50％抗體的三名患者(亞庫B)，一種來自於用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞90％抗體的三名患者(亞庫C)。稀釋這些血漿庫(1／30-1／200)直到它們在BIAcore儀器中與SakSTAR置換晶片的結合總計達大約2000RU。用另外一系列兩倍稀釋液從該稀釋液中構建抗體結合的校準曲線。這些血漿庫用100nmol／L SakSTAR變體吸附10分鐘，測定與固定化SakSTAR的殘餘結合。用校準曲線以未吸附血漿的百分數表示殘餘結合。
結果總結於表1中。野生型SakSTAR吸附10名患者合併血漿中超過95％的結合抗體，用SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，R77A)、SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A)、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A，E80A，D82A)觀察到不完全的吸附(＜60％)，但用SakSTAR(K35A，E38A)、SakSTAR(K35A，E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A，R77A)、SakSTAR(E38A，E75A)、SakSTAR(K35A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)和SakSTAR(E75A，D82A)吸附幾乎是完全的。這些結果令人驚奇地證明，由於用野生型SakSTAR治療在患者中產生的抗體的大約40％在結合方面依賴於K74(表1)。用3名患者的合併血漿-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＜50％的抗體(亞庫B)-的吸附證實了K74對於抗體識別的重要作用。如預期的，對於所有待測變體，用3名患者的合併血漿-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞90％的抗體(亞庫C)-的吸附幾乎是完全的。實施例3SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A)與SakSTAR在外周動脈阻塞患者中的溶栓能力和免疫原性比較1．體內應用的SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K74A)的純化如上所述，變體SakSTAR(K74A，E75A，R77A)或SakSTAR(K74A)的12-24L培養液(2L每批)在補加有100μg／mL氨苄青黴素的LB培養基中培養並IPTG誘導，沉澱，重懸浮，超聲處理破碎並澄清。通過用另文(22，23)所述的緩衝系統在5×20cm SP-Sephadex柱、5×10cm Q-Sepharose柱和／或5×13cm苯基-Sepharose柱上層析純化這些化合物。然後在無菌Superdex 75上凝膠過濾該物質，進一步降低其內毒素含量。合併含SakSTAR變體的級分，將蛋白質濃度調節為1mg／mL，並將該物質通過0．22μm Millipore濾器過濾除菌。用來測定體內應用所需最終物質的生物性質的方法在以上和另文(22)中有描述。2．材料與方法如上所述測定血漿中的葡激酶中和活性。抗原特異性IgG和IgM抗體的定量基本如前所述(22)，用酶聯免疫吸附測定法在聚苯乙烯微量滴定板中進行。在IgG測定中，每板包括親和特異性抗SakSTAR IgG抗體的稀釋曲線。這些抗體分離自從3名患者中獲得的血漿，方法是在用野生型SakSTAR溶栓治療後，在蛋白A-Sepharose和固定化的SakSTAR上層析，並用0．1mol／L甘氨酸-HCl，pH2．8洗脫結合的抗體。IgG製品的純度通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳確定。在IgM測定中，測定效價，效價被定義為492nm的吸光率等於1／640稀釋的合併血漿吸光率時的血漿稀釋度，並將其與治療前基線樣品的效價相比較(中值1／410，四分位數間距1／120-1／700)。3．溶栓能力在閉塞性血栓近端處或之中以2mg大劑量動脈內施用野生型SakSTAR或變體SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，隨後對每組6-12名血管造影證實為外周動脈阻塞或少於120天持續時間的旁路移植患者以1mg／小時輸注(在某些患者中過夜降至0．5mg／小時)。給予書面承諾後研究患者，方案由Leuven大學的人類研究委員會批准。包含和排除標準、聯合抗血栓治療(包括連續靜脈內肝素)和研究方案基本如前所述(22)。
表2顯示了個體患者的有關基線特徵。大多數PAO在股骨膕水平。包括兩個髂支架和8個移植物阻塞。8名患者顯示致殘性跛足，5名顯示慢性缺血性靜止痛，7名顯示亞急性缺血，7名顯示急性缺血。一名兩年前用SakSTAR治療的患者(POE)包括於SakSTAR(K74A)組中。該患者不包括於統計分析中。
表2也總結了各治療和結果。劑量6．0-25mg、持續時間4．0-23小時的動脈內輸注在24名患者中誘導完全的再通，在3名患者中誘導部分再通。在17名患者中進行補充的血管內方法(主要是PTA)，在3名患者中在血栓溶解後進行補充的重建血管手術。沒有患者者進行重大的截肢術。在4名患者中發生了血管造影術結束後血栓形成的早期復發。除了5名需要輸血的患者之外(數據未顯示)，沒有出血併發症，或者僅限於血管造影穿刺部位的輕度到中度血腫形成。未觀察到顱內或內臟出血。循環纖維蛋白原、纖溶酶原和α2-抗纖溶酶水平在SakSTAR部分輸注期間基本保持不變(數據未顯示)，證實葡激酶在使用劑量時的絕對纖維蛋白特異性。纖維蛋白片段D-二聚體水平的升高證明發生了明顯的體內纖維蛋白消化。動脈內肝素治療使aPPT水平延伸到可變範圍(數據未顯示)。4．抗體誘導抗體相關的SakSTAR、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)中和活性和抗SakSTAR、抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgG在基線時和在輸注後第一周內較低(圖2)。從第二周開始，中和活性水平升高，在3-4周時達到中值，在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療的患者中分別為每mL血漿中和20μg SakSTAR(K74A)和2．4μg SakSTAR(K74A，E75A，R77A)，這顯著低於用SakSTAR治療的患者中每mL中和93μg野生型SakSTAR的中值(根據Kruskal-Wallis分析，三組之間的差異為p=0．024，根據Mann-Whitney秩和檢驗，變體與野生型的差異分別為p=0．01和p=0．036)。抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgG的水平在3-4周時升高到中值，在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療的患者中分別為270和82μg／mL血漿，這顯著低於用SakSTAR治療的患者中每mL血漿1800μg抗SakSTAR的中值(根據Kruskal-Wallis分析，三組之間的差異為p=0．024，根據Mann-Whitney秩和檢驗，變體與野生型的差異分別為p=0．07和p=0．05)。
抗SakSTAR(K74A)和抗SakSTAR(K74A，E75A，R77A)IgM的效價在用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療的患者中分別從1／460和1／410的中值基線值升高到1周時1／510和1／450的中值，這顯著不同於用SakSTAR治療的患者中基線時1／320的中值和1周時1／640的中值。在施用SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)的患者中，2周時的相應值為1／590和1／550，與使用SakSTAR的1／930沒有顯著性差異(數據未顯示)。用SakSTAR治療誘導的抗體被SakSTAR完全吸附，但被SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)不完全吸附，這證實了K74、E75、R77表位的免疫原性和K74在抗該表位抗體結合中的顯性作用。用SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77A)治療誘導的抗體被SakSTAR、SakSTAR(K74A)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)完全吸附，表明免疫不是由於Lys74置換為Ala產生的新表位，而是由於不同於K74、E75、R77表位的表位。
因此，本實施例說明，能產生具有降低的抗體誘導但有完整溶栓能力的葡激酶變體。用SakSTAR(n=9)、SakSTAR(K74A)(n=11)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(n=6)治療的26名患者的經驗，加上以前用SakSTAR(n=7)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)(n=7)(31)治療的14名患者的經驗，和用SakSTAR治療的24名患者的經驗(32)，以及隨後在用SakSTAR(n=30)、SakSTAR(K74A)(n=12)和SakSTAR(K74A，E75A，R77A)(n=7)治療的患者中的非隨機化經驗(數據未顯示)，使得能最初估計用SakSTAR或具有改變的K74、E75、R77表位的變體[SakSTAR(K74A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)和SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)]動脈內治療引起的免疫普遍性。在由動脈內施用SakSTAR的70名外周動脈阻塞患者獲得的2-4周後的中和活性數據顯示，56名患者(80％)具有中和＞5μg化合物／mL血漿的水平。在施用SakSTAR(K74A)、SakSTAR(K74A，E75A，R77A)或SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)的患者中，43名中的27名(63％)具有＞5μg化合物每mL血漿的中和活性水平。此差異在統計學上是顯著的(根據Fisher精確檢驗，p=0．05)，表明K74、E75、R77表位是抗體誘導的主要決定簇。實施例4葡激酶的丙氨酸置換突變體的構建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和用免疫患者合併血漿的吸附1．引言定點誘變適用於除「帶電胺基酸」之外的殘基，用來鑑定ⅰ)用一系列鼠Mab鑑定的屬於表位Ⅰ和Ⅲ的其它殘基，ⅱ)決定免疫患者抗血清吸附的胺基酸。由於功能表位通常包含多於一個的抗體結合所必需的胺基酸，所以這些表位中其它殘基的鑑定能導致顯示較低抗原性而保持野生型葡激酶的比活和溫度穩定性的新組合衍生物的構建，在本實施例中，描述了一個或至多兩個胺基酸(相鄰或緊接)被替換為丙氨酸的SakSTAR變體的構建和表徵。表3中列出了本實施例中描述的突變體。這些變體在大腸桿菌中表達、純化並對比活、與一系列鼠單克隆抗體的反應性和野生型SakSTAR治療的患者血漿中抗體的吸附等方面進行表徵。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報導(22)，或在以下詳述。誘變模板載體pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修飾酶購自New England Biolabs(Leusden，荷蘭)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反應按照供應商建議進行。誘變寡核苷酸和引物從Eurogentec(Seraing，比利時)獲得。質粒DNA如建議用Qiagen的純化試劑盒(Hilden，德國)或BIO 101 RPM試劑盒(Vista，CA)分離。轉化感受態大腸桿菌細胞用眾所周知的磷酸鈣法製備。核苷酸序列測定用T7測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以雙脫氧鏈終止法對雙鏈質粒DNA進行。聚合酶鏈反應用Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的Taq聚合酶或Vent聚合酶(New England Biolabs，Leusden，荷蘭)進行。構建本實施例所述變體所需的重組DNA方法已經很好地建立(22，27)。3．表達質粒的構建用pMEX．SakSTAR載體作為模板，按照廠商說明書，用Stratagene(La Jolla．美國)的Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒，構建變體SakSTAR(Y17A，F18A)、SakSTAR(F104A)、SakSTAR(F111A)、SakSTAR(Y9A)、SakSTAR(Y91A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(I87A)、SakSTAR(I106A)和SakSTAR(I120A)。誘變寡核苷酸(未顯示)與選擇引物LY34 5』CAAAACAGCCGAGCTTCATTCATTCAGC一起使用，後者破壞位於pMEX．SakSTAR中葡激酶編碼基因3』的唯一HindⅢ位點，並使得能通過HindⅢ消化反選擇未突變的子代。HindⅢ位點的缺失在大多數情況中與存在用誘變寡核苷酸引入的希望突變有關。變體SakSTAR(I133A)的構建方法是用位於sakSTAR基因5』端的引物818A(5』CAGGAAACAGAATTCAGGAG)和誘變引物LY58(5』TTCAGCATGCTGCAGTTATTTCTTTTCTGCAACAACCTTGG)對pMEX．SakSTAR質粒進行聚合酶鏈反應。純化擴增產物(30循環94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒)，用EcoRI和PstI消化，並連接於pMEXSakSTAR的相應位點。變體SakSTAR(I128A)、SakSTAR(L127A)和SakSTAR(N126V)的構建方法是用位於sakSTAR基因5』端的引物818A和誘變引物(未顯示)進行聚合酶鏈反應。純化擴增產物(30循環94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)，用EcoRI和StyI消化，並連接於pMEXSakSTAR的相應位點。
通過進行兩個連續PCR反應(30循環94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 30秒)構建變體SakSTAR(F125A)。在第一個反應中，用引物818A和誘變引物擴增pMEX．SakSTAR的片段。然後在第二個PCR反應中用該擴增片段作為模板，用一種誘變引物進一步延伸sakSTAR基因中存在的StyI位點下遊的片段(對應於SakSTAR的胺基酸130-131)。用EcoRI和StyI消化得到的產物，並將其連接於pMEX．SakSTAR的相應位點。
編碼表3列出的其它所有變體的質粒是用pMEX．SakSTAR或可獲得的編碼SakSTAR變體的質粒作為模板，通過直接PCR或剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(SOE-PCR)(22)構建的。PCR擴增兩個片段(30循環94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)，第一個從葡激酶基因的5』端開始(引物818A)到待誘變區(正向引物)，第二個用引物818D(5』CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)從該相同區(反向引物)到基因的3』端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區(引物未顯示)。然後用外部引物818A和818D在第二個PCR反應中將兩個純化片段裝配在一起(30循環94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。從該終反應物中純化擴增產物，用EcoRI和HindⅢ消化，連接於pMEX．SakSTAR的相應位點。對於每一構建，通過對完整SakSTAR編碼區測序證實變體的序列。4．SakSTAR變體的表達和純化如下所述，從在優質肉湯(TB)培養基(28)中生長的轉化大腸桿菌中表達並純化SakSTAR變體。用2-4mL等份LB培養基的過夜飽和培養物接種1-2L補加有100μg／mL氨苄青黴素的優質肉湯培養物。在30℃劇烈通氣下溫育該培養物。溫育大約16小時後，向培養物中加入IPTG(200μmol／L)誘導從tac啟動子開始的表達。誘導3小時後，以4000轉每分離心20分鐘沉澱細胞，重懸浮於1／10體積的0．01mol／L pH6-6．5磷酸緩衝液中，並通過在0℃超聲處理破碎。將懸液以20000轉每分離心20分鐘，上清液貯存於4℃或-20℃直到純化。基本如上所述(實施例2)純化該物質含有SakSTAR變體的澄清細胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上進行層析，隨後在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上層析。合併經SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用於進一步分析。5．物理化學和生物化學分析根據Bradford(29)測定蛋白質濃度。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進行SDS-PAGE，用在微量滴定板中進行的顯色底物試驗測定SakSTAR溶液的比活(如實施例2所述)。不同SakSTAR變體的比活總結於表3中。6．SakSTAR變體與一系列鼠單克隆抗體的反應性用來測定SakSTAR變體與一系列鼠單克隆抗體的反應性的方法已在上文實施例1中描述。結果總結於表3中(該表的格式對應於如實施例1所述的表1的格式)。比野生型葡激酶至少低10倍的表觀締合常數被認為是顯著的，並在表中以黑體標出。
為了獲得SakSTAR分子Ala置換變體性質的全面情況，構建、表達並純化了67個編碼一個或兩個相鄰胺基酸被Ala替換的變體的質粒。與以前描述(22和實施例2)的35個帶電殘基-Ala置換變體一起，該分析覆蓋了SakSTAR中除Gly、Ala和Pro之外的所有殘基，如圖3所示。8種變體不能以純化形式獲得，主要是由於表達水平低，11種變體是無活性的，56種比活降低，27種具有保持的或升高的比活(≥100 KHU／mg)。從表達質粒的培養中產生純化物質的產量為16mg／L(中值，10-90百分範圍為4-41mg／L)。SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳一致顯示一條Mr≈16000的主帶，通常代表總蛋白質的95％(未顯示)。
K35、N95、S103或K135替換為Ala產生比活≥200 kU／mg的變體。W66、Y73或E75替換為Ala降低了變體與表位簇I的≥3種抗體的反應性，H43或V45替換為Ala降低了變體與表位簇II的3種抗體的反應性，V32、K35、D82和K130替換為Ala降低了變體與表位簇III的≥3種抗體的反應性。7．SakSTAR治療在患者中產生的抗體的吸附對於本實施例，使用如實施例2所述的三種血漿庫。用來評估野生型葡激酶和SakSTAR變體吸附SakSTAR治療患者中產生的抗體的方法在實施例2詳細描述。結果總結於表3中。野生型SakSTAR和本實施例中分析的大多數變體吸附10名患者合併血漿中超過95％的結合抗體，用SakSTAR(Y73A)和SakSTAR(K74A)觀察到不完全吸附(＜60％)，前文已經證明了Lys74對於抗體識別的重要作用(見實施例2)。該結果表明，Tyr73參與與Lys74相同的主要表位，或者另外，Tyr73的置換可間接誘導「K74表位」的結構修飾。對於大多數待測變體，用3名患者的合併血漿-其中用SakSTAR(K35A，E38A，K74A，E75A，R77A)吸附＞95％的抗體(亞庫C，見實施例2)一的吸附幾乎是完全的。實施例5具有S34、G36和／或H43置換的葡激酶變體的構建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合併血漿的吸附天然變體Sak42D在三個胺基酸處不同於SakSTAR，相當於SakSTAR(S34G，G36R，H43R)。Sak42D的特徵在於與表位簇Ⅱ和Ⅲ的某些鼠抗體的反應性降低，SakSTAR治療患者血漿中抗體的吸附略微降低(表4)。SakSTAR中這些殘基的誘變表明，與表位簇Ⅲ和免疫患者血漿的降低的反應性可能是由於G36R置換、H43R置換介導與表位簇Ⅱ的降低的反應性，但對與免疫患者血漿的反應性無影響，而S34A置換沒有影響。G36R置換能與K74R結合，但不能與K74A置換結合，而不明顯降低比活(表4)。實施例6具有K35、E65、Y73、K74、E80+D82、N95、K130、V132和／或K135置換的葡激酶變體的構建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合併血漿的吸附根據實施例4中丙氨酸置換分析的結果，選擇K35、N95和K135進行進一步的分析，因為SakSTAR(K35A)、SakSTAR(N95A)和SakSTAR(K135A)具有增高兩倍的比活，選擇Y73和K74，因為SakSTAR(Y73A)和SakSTAR(K74A)與表位簇I抗體的反應性明顯降低，並且降低了通過SakSTAR治療而免疫的患者血漿抗體的吸附，選擇K35、E80+D82、K130和V132，因為SakSTAR(K35A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTkR(K130A)和SakSTAR(V132A)與表位簇Ⅲ抗體的反應性降低。
在使活性／抗原性比成為最大的嘗試中，將這些胺基酸替換為Ala之外的胺基酸。如表5所總結的，K35置換為A、E或Q表明，SakSTAR(K35A)具有最值得關注的特性，Y73被F、H、L、S或W的置換不能挽回比活的明顯降低，K74證實了它在免疫患者血漿抗體結合中的重要作用，用SakSTAR(K74Q)和SakSTAR(K74R)獲得最佳比活／抗原性比。SakSTAR(E80A，D82A)優於單殘基變體SakSTAR(E80A)或SakSTAR(D82A)，因為它與免疫患者血漿的反應性略有降低。用E、G、K或R替換N95不能進一步改進SakSTAR(N95A)，它不能將升高的比活賦予含有K74A或K135R的變體。最後，SakSTAR(K130T)在比活方面優於SakSTAR(K130A)，SakSTAR(V132R)優於SakSTAR(V132A)。實施例7SakSTAR(K130T，K135R)和SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)與K35A、G36R、E65X、K74X和所選其它胺基酸的組合變體的構建、用鼠單克隆抗體的表位作圖和免疫患者合併血漿的吸附在本實施例和下列實施例中，從SakSTAR治療幾周後的40名患者中製備另一種血漿庫(庫40)。來源於10名患者的原始庫進一步被確定為庫10。如上及另文(22)所述定量葡激酶特異抗體的吸附。
SakSTAR(K130T，K135R)變體作為添加誘變的模板，因為它具有高比活，與表位簇Ⅲ抗體的結合和免疫患者血漿抗體的吸附適度降低(表6)。向模板中添加G36R、K74R或K74Q或兩者，不能明顯降低比活，降低與表位簇Ⅲ的單克隆抗體的反應性(G36R置換)，降低免疫患者血漿抗體的吸附(K74R或K74Q置換)。SakSTAR(K130T，K135R)模板中E65A或E65Q與K74Q的組合使庫10和庫40抗體的吸附分別降低為50-60％左右，而不明顯降低比活。在SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)模板中選擇的胺基酸的添加置換不能再進一步降低庫10和庫40的抗體吸附。令人驚訝地，用顯色底物試驗測定，K136被置換為A和在位點137中加入K導致比活明顯增高。
SakSTAR(E80A，D82A)和SakSTAR(K130T，K135R)模板的組合不影響比活，與表位簇III抗體的反應性降低(表7)。因此，選擇SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)模板進一步誘變。K74R以至K74Q的添加大大降低了與免疫患者血漿的反應性。最後，向SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)模板中添加E65D或K35A或E65S產生具有完全比活的變體，它們只結合免疫患者合併血漿中≤45％的抗體，和超過50％與K74、E75、R77表位反應的亞庫不到15％。實施例8選擇的葡激酶變體的表徵，其具有完整的比活和用野生型SakSTAR治療在患者中產生的SakSTAR特異性合併人抗體的低於50％的吸附1．引言在上述實施例中構建並表徵的23種變體具有以下兩種特性≥100kHU／mg的殘餘比活，和從野生型SakSTAR治療的10名患者中獲得的抗血清庫的≤50％的吸附。結果總結於表8中。包括用亞庫B和亞庫C和用野生型SakSTAR治療的40名患者的庫獲得的結果。選擇SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，_137K)進一步表徵。2．SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解性質如前所述測定SakSTAR變體的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解性質。使用選擇的變體獲得浸於人血漿中的125I-纖維蛋白標記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解(表9)。實驗期間自發的凝塊溶解≤5％(未顯示)。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(2小時後使50％凝塊溶解；C50)為0．11+0．01至0．24+0．04g／mL，此時殘餘纖維蛋白原水平為基線的92±30％和97+30％(表9)。由劑量反應曲線(未顯示)圖表確定無纖維蛋白時在2小時後使人血漿中50％纖維蛋白原降解的化合物濃度。這些值(3個獨立實驗的平均值±SD)為14+3．2-29+3．1μg／mL(表9)。令人驚訝地，SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，_137K)在顯色測定中的極高比活與血漿環境中增強的溶栓能力無關。3．選擇的SakSTAR變體的溫度穩定性圖4顯示了在不同溫度下，在0．15mol／L NaCl、0．01mol／L磷酸鹽緩衝液，pH7．5中溶解為1．0mg／mL濃度的SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)製劑的溫度穩定性。在高達37℃的溫度下，所有化合物都可保留完全活性至少三天。然而在56℃和70℃下，三種變體比野生型SakSTAR更不穩定。4．在倉鼠中大劑量注射後SakSTAR變體的藥物動力學特性靜脈內大劑量注射100μg／kg SakSTAR變體後，在4隻一組的倉鼠中評估血液處理SakSTAR變體的藥物動力學參數。用另文描述的ELISA測定SakSTAR相關抗原。對欲定量的每一種SakSTAR變體校準該ELISA。藥物動力學參數包括初始半衰期(分鐘)，t1／2α=In2／α；終止半衰期(分鐘)，t1／2β=In2／β；中央(血漿)室體積(mL)，Vc=劑量／(A+B)；曲線下面積(μg·分鐘·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血漿清除率(mL·分鐘-1)，Clp=劑量／AUC(33)。
在每組4隻倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體後，血液對葡激酶相關抗原的處置率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數項充分描述(結果未顯示)，由此得出表10中所總結的藥物動力學參數。突變體的藥物動力學參數與野生型SakSTAR沒有顯著性差異。初始半衰期(t1／2(α))為2．0-3．2分鐘，血漿清除率(Clp)為1．6-4．1mL／分鐘。實施例9SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)與SakSTAR在外周動脈阻塞患者中溶栓能力和免疫原性比較1．為了體內應用的純化變體SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)的18升培養物(2L每批)在補加有100μg／mL氨苄青黴素的優質肉湯培養基(28)中培養20小時，在最後3小時中用IPTG誘導。沉澱細胞，重懸浮於1／10體積的0．01mol／L磷酸鹽緩衝液，pH6．0中，超聲處理破碎，離心使其澄清。通過在10×7cm的SP-Sepharose柱上層析純化化合物，該柱用0．01mol／L磷酸鹽緩衝液，pH6．0平衡，用1mol／L NaCl梯度(3倍柱體積)洗脫。合併含有SakSTAR變體的級分，加入固體NaCl至2．5mol／L的濃度，在10×20cm的苯基-Sepharose柱上層析該物質，隨後用0．01mol／L磷酸鹽緩衝液，pH6．0分步洗脫。該物質在10×45cm的Sephadex G25柱上脫鹽，加到5×10cm的SP-Sepharose柱上並用1．0mol／L NaCl分步洗脫濃縮，最後在0．15M NaCl、0．01mol／L磷酸鹽緩衝液，pH7．5平衡的6×60cmSuperdex 75柱上凝膠過濾，進一步降低內毒素含量。合併含有SakSTAR變體的級分，將蛋白質濃度調節為1mg／mL，並將該物質通過0．22μmMillipore濾器過濾除菌。用來測定比活、內毒素汙染、細菌無菌和在小鼠中毒性的方法在上文或另文(22)中有描述。通過在加樣40g化合物的10％凝膠上進行SDS凝膠電泳來估計製品的純度。
從18升培養體積的SakSTAR變體中，純化出840mg比活為140kHU／mg的SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和800mg比活為150kHU／mg的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。內毒素含量為＜0．1IU／mg和0．26IU／mg。HPLC凝膠過濾顯示，在柱層析範圍中有一個主要的對稱峰，代表＞98％的洗脫物質(曲線下的總面積)(未顯示)。40g樣品的SDS凝膠電泳顯示一種主要成分(未顯示)。在如另文(22)所述的3天檢驗中，證明過濾除菌的製品是無菌的。與施用等量鹽水的小鼠(未顯示)相比，在每組5隻小鼠中靜脈內大劑量注射SakSTAR變體(3mg／kg體重)不能引起任何急性反應，也不能在8天內降低體重增加。2．溶栓能力在閉塞性血栓近端處或之中以2mg大劑量動脈內施用野生型SakSTAR或變體SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，隨後分別對15、6、6名一組的血管造影證實為外周動脈阻塞或少於120天持續時間的旁路移植患者以1mg／小時輸注(在某些患者中過夜降至0．5mg／小時)。給予書面承諾後研究患者，方案由Leuven大學的人類研究委員會批准。包含和排除標準、聯合抗血栓治療(包括連續靜脈內肝素)和研究方案基本如前所述(22)。
表11顯示了個體患者的有關基線特徵和治療結果和後果。劑量3．5-27mg、持續時間2-44小時的動脈內輸注在22名患者中誘導完全的再通，在5名患者中誘導部分再通。在13名患者中進行補充的血管內方法(主要是PTA)，在5名患者中在血栓溶解後進行補充的重建血管手術。一名患者者進行重大的截肢術。通常沒有出血併發症，或者僅限於血管造影穿刺部位的輕度到中度的血腫形成(數據未顯示)。施用野生型SakSTAR的一名患者有非致死性顱內出血，一名(BUE)有腹膜後血腫，兩名(MAN和STRO)有胃腸道出血。
循環纖維蛋白原、纖溶酶原和α2-抗纖溶酶水平在SakSTAR部分輸注期間保持不變(數據未顯示)，反映這此藥劑在使用劑量時的絕對纖維蛋白特異性(數據未顯示)。纖維蛋白片段D-二聚體水平的升高證明發生了明顯的體內纖維蛋白消化。動脈內肝素治療使aPPT水平延伸到可變範圍(數據未顯示)。4．抗體誘導基本如上文和另文(22)所述定量血漿的葡激酶中和活性和抗原特異性IgG抗體。抗體相關的SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)中和活性和抗SakSTAR、抗SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和抗SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)IgG在基線時和在輸注後第一周內較低(圖5)。從第二周開始，中和活性水平升高，在3-4周時達到中值，在用相應部分治療的患者中分別為每mL血漿中和9μg SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和0．5μg SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)，與之相比，用SakSTAR治療的15名患者中中值為每mL中和24μg野生型SakSTAR。抗SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和抗SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)IgG的水平在3-4周時升高到中值，在用相應部分治療的患者中分別為420和30μg／mL血漿，與之相比，用SakSTAR治療的患者中中值為每mL血漿590μg抗SakSTAR(圖5)。以2-4周後血漿中和活性超過5g／ml定義的免疫普遍性為，與用SakSTAR的70名患者中的56名(80％)相比，用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)的6名患者中有3名(50％)，用SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)的6名患者中有1名(17％)。此差異在統計學上是非常顯著的(根據2×3卡方分析，p=0．01)。
用SakSTAR治療誘導的抗體被SakSTAR完全吸附，但被SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)不完全吸附(表12)。用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)治療誘導的抗體，在6名患者中的4名中可檢測到，被SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)完全吸附(≥90％)，表明免疫不是由於野生型胺基酸置換產生的新表位。用SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)治療誘導的抗體，在一名患者(URB)中可檢測到，可用SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)完全吸附，但用野生型SakSTAR不完全吸附(85％)，提示誘導抗體的小部分可能針對輸注用變體中的新表位。實施例10SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)與所選其它胺基酸的組合變體的構建、用免疫患者合併血漿的吸附1．引言在添加置換誘變的最後一輪，將SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)變體作為模板，因為它顯示高比活，合併的免疫患者血漿(庫40)抗體的吸附明顯降低(為65％)。與最終選擇的變體組合物有關的中間變體總結於表13中。K35、D82和S84A的添加，T90A、E99D和T101S的添加，E108A和K109A的添加，使抗體吸附降低為50％左右，而D82A、S84A和E108A、K109A的組合添加使之降低為41％。K136A的置換與COOH端Lys的添加(-137K)結合，在純化系統中，而不是在血漿環境或倉鼠肺栓塞模型(未顯示)中提高了比活，並且進一步使患者合併血漿抗體的吸附降低為30％。最後，向該模板中添加K35A和T90A、E99D、T101S置換產生了一種具有完全溶栓能力的突變體，它只能結合免疫患者合併血漿中24％的抗體。
根據該分析，選擇SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)進一步表徵。另外，構建並評價在位點74含Lys的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)。2．在倉鼠中大劑量注射後SakSTAR變體的藥物動力學特性在每組4隻倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體後，血液對葡激酶相關抗原的處置率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數項充分描述(結果未顯示)。從這些血漿消失曲線中得出突變體的藥物動力學參數，與野生型SakSTAR沒有明顯差異(結果極其類似於表10，數據未顯示)。實施例11由SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)產生的選擇變體的表徵1．選擇的SakSTAR變體對人血漿的體外纖維蛋白溶解特性使用選擇的三種變體獲得浸於人血漿中的125I-纖維蛋白標記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解(表14)。實驗期間的自發凝塊溶解≤5％(未顯示)。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(在2小時後使50％凝塊溶解；C50)為0．15±0．2至0．19±0．01μg／mL，此時不發生明顯的纖維蛋白原降解。由劑量反應曲線(未顯示)圖表確定無纖維蛋白時在2小時後使人血漿中50％纖維蛋白原降解的化合物濃度。這些值(3個獨立實驗的平均值±SD)為7．0±0．6至24±3．6μg／mL(表14)。2．選擇的SakSTAR變體的溫度穩定性在不同溫度下，在0．15M NaCl、0．01M磷酸鹽緩衝液，pH7．5中溶解為1．0mg／ml濃度的SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)製劑的溫度穩定性。在高達37℃的溫度下，所有化合物都可保留完全活性至少三天。在56℃和70℃下，變體一般比野生型SakSTAR更不穩定(結果極其類似於圖4，數據未顯示)。實施例12SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，V_137K)(SY141)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)在外周動脈阻塞患者中的溶栓能力和免疫原性比較1．體內應用的SakSTAR變體的大規模純化和條件從18升培養體積中，將物質純化為均勻的。內毒素含量低於2IU／mg。HPLC凝膠過濾顯示，在柱層析範圍中有一個主要的對稱峰，代表＞98％的洗脫物質(曲線下的總面積)(未顯示)。30μg樣品的SDS凝膠電泳顯示一種主要成分。在3天檢驗中證明過濾除菌的製品是無菌的。與施用等量鹽水的小鼠(未顯示)相比，在每組5隻小鼠中靜脈內大劑量注射SakSTAR變體(3mg／kg體重)不能引起任何急性反應，8天內也不能降低體重增加。
研究了血管造影術證明為外周動脈阻塞(PAO)的每組6名患者。個體患者的有關基線特徵顯示於表15中。表16總結了各治療和結果。劑量6-24mg、持續時間4-29小時的動脈內輸注在大多數患者中誘導完全的再通。循環纖維蛋白原、纖溶酶原和α2-抗纖溶酶水平在SakSTAR變體輸注期間基本保持不變(數據未顯示)，反映了這些藥劑在使用劑量時的絕對纖維蛋白特異性。抗體相關的SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E650，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)中和活性在基線時和在輸注後第一周內較低(圖17)。從第二周開始，中和活性水平升高，在3-4周時達到中值，在用各自化合物治療的患者中為每mL血漿中和19μg SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)、0．7μg SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)和4．3μg SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)，對於SY141和SY145而不是SY118，低於用野生型SakSTAR治療的69名患者中每mL中和12μg野生型SakSTAR的中值。
在用SakSTAR治療的70名患者中的56名中，在接觸SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY118)的6名患者中的5名中，只在施用SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)的6名患者中的2名中，在施用SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY145)的3名患者中的1名中，觀察到明顯的免疫(3-4周時中和活性為每ml血漿5g化合物)。
有關研究的主要變體在患者中的免疫原性的結果總結於表18中。顯然，與野生型蛋白質相比，變體SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)具有明顯降低的免疫原性。實施例13葡激酶的半胱氨酸置換突變體的構建、純化和表徵1．引言進行定點誘變，用單半胱氨酸殘基替代暴露的胺基酸，以構建ⅰ)在分子間二硫鍵形成之後，葡激酶的同型二聚體形式，和ⅱ)聚乙二醇偶聯的分子(PEG-衍生物)。本實施例的目的在於兩點第一，增加注射分子的大小(通過二聚化或與大分子如PEG的偶聯)能降低清除率，第二，PEG-衍生物也顯示在動物模型中誘導降低的免疫反應性(綜述見參考文獻34)。在這兩種情況中，延長的體內半衰期有助於降低患者中葡激酶的藥理學劑量。這種降低可能伴隨有對溶栓劑的降低的免疫原性反應，從而增強其作為一種溶栓劑的藥理活性。
在本實施例中，描述了其中單胺基酸被替換為半胱氨酸的兩種SakSTAR變體的構建和表徵。本實施例描述的突變體列於表19中。這些變體在大腸桿菌中表達、純化，並對比活、在人血漿中的體外纖維蛋白溶解和在倉鼠中大劑量注射後的藥物動力學特性等方面進行表徵。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報導(22)，或在以下詳述。誘變模板載體pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修飾酶購自New England Biolabs(Leusden，荷蘭)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反應按照供應商建議進行。誘變寡核苷酸和引物從Eurogentec(Seraing，比利時)獲得。質粒DNA如建議用Qiagen的純化試劑盒(Hilden，德國)分離。轉化感受態大腸桿菌細胞用眾所周知的磷酸鈣法製備。核苷酸序列測定用T7測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以雙脫氧鏈終止法對雙鏈質粒DNA進行。聚合酶鏈反應(PCR)用Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的Taq聚合酶進行。構建本實施例所述變體所需的重組DNA方法已經很好地建立(22，27)。3．表達質粒的構建用編碼SakSTAR的pMEX．SakSTAR作為模板，通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(SOE-PCR)(24)構建變體SakSTAR(K102C)和SakSTAR(K109C)。PCR(30循環94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)擴增兩個片段，第一個從葡激酶基因的5』端(引物818A)開始到待誘變區(正向引物)，第二個用引物818D(5』CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)從該相同區(反向引物)到該基因的3』端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區(對於K102C的構建TAT GAT AAG AAT TGC AAA AAA GAA GAA(反向)和TTC TTC TTT TTT GCA ATT CTT ATC ATA(正向)，對於K109C的構建AAA AAG AAG AAA CGT GCT CTT TCC CTA(反向)和TAG GGA AAG AGC ACG TTT CTT CTT TTT(正向))。然後用外部引物818A和818D在第二個PCR反應中將兩個純化片段裝配在一起(30循環94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。從該終反應物中純化擴增產物，用EcoRI和HindⅢ消化，並連接於pMEX．SakSTAR的相應位點。對於每一構建，通過對完整編碼區測序證實變體的序列。4．SakSTAR變體的表達和純化如下所述，從在優質肉湯(TB)培養基(28)中生長的轉化大腸桿菌中表達並純化SakSTAR變體。用2-4mL等份LB培養基的過夜飽和培養物接種1-2L補加有100μg／mL氨苄青黴素的優質肉湯培養物。在30℃劇烈通氣下溫育該培養物。溫育大約16小時後，向培養物中加入IPTG(200μmol／L)誘導從tac啟動子開始的表達。誘導3小時後，以4000轉每分離心20分鐘沉澱細胞，重懸浮於1／10體積的0．01mol／L pH6-6．5磷酸緩衝液中，並通過在0℃超聲處理破碎。將懸液以20000轉每分離心20分鐘，上清液貯存於4℃或-20℃直到純化。基本如上所述(實施例2)純化該物質含有SakSTAR變體的澄清細胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上進行層析，隨後在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上層析。合併經SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用於進一步分析。5．生物化學分析根據Bradford(29)測定蛋白質濃度。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進行SDS-PAGE，用在微量滴定板中進行的顯色底物試驗測定SakSTAR溶液的比活(如實施例2所述)。不同SakSTAR變體的比活總結於表19中。
經SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色顯示，變體SakSTAR(K102C)基本上是單體的。其比活相當於野生型葡激酶。相反，SakSTAR(K109C)顯示形成二聚體的傾向(＞60％)。這導致在纖溶酶原偶聯的顯色底物試驗中比活明顯增高(見表19)。在用二硫蘇糖醇(DTT)還原(20倍摩爾過量，37℃，1．5小時)，並用碘乙醯胺烷化(100倍摩爾過量，37℃，1小時)後，K109C二聚體轉化為穩定的單體，其最終比活在野生型葡激酶的希望的範圍之內(表19)。該結果證實，同型二聚體的形成是比活大大增加的唯一決定因素。通過在Source S(Pharmacia)(5×50mm)上層析將二聚體SakSTAR(K109C)與單體SakSTAR(K109C)分開。加樣緩衝液為10mM磷酸鹽緩衝液，pH6．0，二聚體SakSTAR(K109C)用相同緩衝液中的鹽梯度(可達1M)洗脫。合併經SDS凝膠電泳定位、含有二聚體SakSTAR(K109C)的級分(純度＞95％)用於進一步分析。6．SakSTAR的半胱氨酸突變體與聚乙二醇的化學交聯半胱氨酸突變體SakSTAR(K102C)的硫醇基用於與活化的聚乙二醇OPSS-PEG(Shearwater Polymers Europe，Enschede，荷蘭)偶聯。OPSS-PEG是一種5kDa的PEG分子，在一端帶有一個活化的硫醇基，在弱鹼性pH時可與游離硫醇特異反應。SakSTAR(K102C)的修飾通過使該分子(100μM)與三倍過量的溶於5mM磷酸鹽，pH7．9溶液的SS-PEG在室溫下溫育而完成。通過測定412nm處2-巰基吡啶酮從OPSS-PEG的釋放監測反應的程度。反應後(約15分鐘)，如上所述(見實施例2)通過在1．6×5cm SP-Sephadex柱上純化衍生的SakSTAR(K102C-PEG)除去過量的OPSS-PEG。合併根據280nm的光密度定位、含有SakSTAR(K102C-PEG)的級分用於進一步分析。SDS-PAGE分析和考馬斯亮藍染色證實PEG在SakSTAR(K102C)上的交聯是定量的。如表19所示，與野生型葡激酶相比，PEG衍生物的比活只是略受影響。7．SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性如前所述測定SakSTAR變體的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解性質。使用下列四種分子獲得浸於人血漿中的125I-纖維蛋白標記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解作為二聚體和單體的SakSTAR(K109C)(還原並用碘乙醯胺烷化後)、單體SakSTAR(K102C)和PEG衍生的SakSTAR(K102C)。實驗期間的自發凝塊溶解≤5％(未顯示)。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(在2小時後使50％凝塊溶解；C50)，單體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C)與SakSTAR相當(表19)。然而，觀察到，二聚體SakSTAR(K109C)凝塊溶解的C50僅為0．12μg／mL，這比野生型葡激酶大約低三倍。相反，對於SakSTAR(K102C-PEG)測量到0．60μg／mL的C50，這只比野生型葡激酶高兩倍。因此，SakSTAR通過二硫鍵的二聚化或者通過PEG衍生提高分子大小不妨礙葡激酶的纖維蛋白溶解活性。儘管PEG-分子似乎降低擴散，並因此降低衍生葡激酶對纖維蛋白凝塊內的纖維蛋白溶解能力，但葡激酶的二聚化導致對人纖維蛋白凝塊的協同纖維蛋白溶解作用。8．在倉鼠中大劑量注射後二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的藥物動力學特性在靜脈內大劑量注射100μg／kg SakSTAR變體後，在4隻一組的倉鼠中評估血液處理二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的藥物動力學參數。用另文所述的ELISA測定SakSTAR相關抗原。對欲定量的每一種SakSTAR變體校準該ELISA。藥物動力學參數包括初始半衰期(分鐘)，t1／2α=In2／α；終止半衰期(分鐘)，t1／2β=In2／β；中央(血漿)室體積(mL)，Vc=劑量／(A+B)；曲線下面積(μg·分鐘·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血漿清除率(mL·分鐘-1)，Clp=劑量／AUC(32)。
在每組4隻倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體後，血液對葡激酶相關抗原的處理率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數項充分描述(結果未顯示)，由此得出表19中總結的藥物動力學參數t1／2α和Clp。二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)的藥物動力學參數與野生型SakSTAR明顯不同。對於二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)，初始血漿半衰期(t1／2(α))分別為3．6和3．0分鐘，血漿清除率(Clp)分別為0．52和0．32mL／分鐘。這些結果可能是由於二聚化或與PEG交聯引起的SakSTAR斯託克斯(Stokes)半徑的增加。根據通過HPLC在Superdex50上的大小排阻層析，二聚體SakSTAR(K109C)和SakSTAR(K102C-PEG)分別具有33kDa和40kDa的表觀分子量。實施例14免疫原性降低的葡激酶變體半胱氨酸置換突變體的構建、純化和表徵1．引言根據實施例13的結果，構建、純化並表徵SakSTAR變體的其它聚乙二醇衍生物。免疫原性最低的變體SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19)和SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141)用作模板，條件是後者的COOH端回復為野生型序列，S84A替換為E80，K74Q替換為K74R，產生SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY161)。引入的半胱氨酸，作為聚乙二醇分子的受體，位於氨基端區(優選地，但不是排他地，成熟葡激酶變體的位置號3處的Ser)，以在葡激酶激活後釋放(10個NH2端胺基酸的釋放)；最後使用不同分子量的聚乙二醇分子(Mr=5000-20000)，用OPSS或馬來醯亞胺置換。
本實施例描述的突變體列於表20中。這些變體在大腸桿菌中表達、純化，並對比活、在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性、在倉鼠中大劑量注射後的藥物動力學特性、在倉鼠肺栓塞模型中大劑量注射後的溶栓特性、免疫患者合併血漿(庫40)抗體的吸附等方面進行表徵。2．試劑與方法本研究中使用的所有試劑的來源以前已報導(22)，或在以下詳述。誘變的模板載體pMEX602sakB(即pMEX．SakSTAR)在另文中有描述(23)。限制酶和修飾酶購自New England Biolabs(Leusden，荷蘭)、Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)或Pharmacia(Uppsala，瑞典)。酶促反應按照供應商建議進行。誘變寡核苷酸和引物從Eurogentec(Seraing，比利時)獲得。質粒DNA如建議用Qiagen的純化試劑盒(Hilden，德國)分離。轉化感受態大腸桿菌細胞用眾所周知的磷酸鈣法製備。核苷酸序列測定用T7測序試劑盒(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以雙脫氧鏈終止法對雙鏈質粒DNA進行。聚合酶鏈反應(PCR)用Boehringer Mannheim(Mannheim，德國)的Taq聚合酶進行。構建本實施例所述變體所需的重組DNA方法已經很好地建立(22，27)。3．表達質粒的構建用編碼SakSTAR的pMEX．SakSTAR作為模板，通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應(SOE-PCR)(24)構建變體SakSTAR(S3C，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(S3C))、SakSTAR(S2C，S3C，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(2SC，3SC))、SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141(S3C))、SakSTAR(S2C，S3C，K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)(SY141(S2C，S3C))、SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74Q，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY160(S3C))和SakSTAR(S3C，K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)(SY161(S3C))，PCR(30循環94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)擴增兩個片段，第一個從葡激酶基因的5』端(引物818A)開始到待誘變區(正向引物)，第二個用引物818D(5』CAAACAGCCAAGCTTCATTCATTCAGC)從該相同區(反向引物)到該基因的3』端。正向及反向引物共有24bp左右的重疊區。然後用外部引物818A和818D在第二個PCR反應中將兩個純化片段裝配在一起(30循環94℃ 1秒，50℃ 1秒，72℃ 10秒)。從該終反應物中純化擴增產物，用EcoRI和HindⅢ消化，並連接於pMEX．SakSTAR的相應位點。對於每一構建，通過對完整編碼區測序證實變體的序列。4．SakSTAR變體的表達和純化如下所述，從在優質肉湯(TB)培養基(28)中生長的轉化大腸桿菌中表達並純化SakSTAR變體。用2-4mL等份LB培養基的過夜飽和培養物接種1-2L補加有100μg／mL氨苄青黴素的優質肉湯培養物。在30℃劇烈通氣下溫育該培養物。溫育大約16小時後，向培養物中加入IPTG(200μmol／L)誘導從tac啟動子開始的表達。誘導3小時後，以4000轉每分離心20分鐘沉澱細胞，重懸浮於1／10體積的0．01mol／L pH6-6．5磷酸緩衝液中，並通過在0℃超聲處理破碎。將懸液以20000轉每分離心20分鐘，上清液貯存於4℃或-20℃直到純化。基本如上所述(實施例2)純化該物質含有SakSTAR變體的澄清細胞裂解液在1．6×5cm SP-Sephadex柱上進行層析，隨後在1．6×8cm苯基-Sepharose柱上層析。合併經SDS凝膠電泳定位、含有SakSTAR的級分用於進一步分析。5．生物化學分析根據Bradford(29)測定蛋白質濃度。使用10-15％梯度凝膠和考馬斯亮藍染色，用Phast SystemTM(Pharmacia，Uppsala，瑞典)進行SDS-PAGE，用在微量滴定板中進行的顯色底物試驗測定SakSTAR溶液的比活(如實施例2所述)。6．SakSTAR的半胱氨酸突變體與聚乙二醇的化學交聯半胱氨酸突變體的硫醇基用於與活化的聚乙二醇OPSS-PEG或MAL-PEG(Shearwater Polymers Europe，Enschede，荷蘭)偶聯。OPSS-PEG是一種5kDa的PEG分子，在一端帶有一個活化的硫醇基，在弱鹼性pH時可與游離硫醇特異反應。MAL-PEG是一種5kDa、10kDa或20kDa的分子，帶有一個馬來醯亞胺基，在其它官能團的存在下在溫和條件下可與硫醇基特異反應。變體的修飾通過使該分子(100μM)與三倍過量的溶於5mM磷酸鹽，pH7．9溶液的OPSS-PEG或MAL-PEG在室溫下溫育而完成。反應後(約15分鐘)，如上所述(見實施例2)在1．6×5cmSP-Sephadex柱上純化衍生的SakSTAR變體除去過量的OPSS-PEG或MAL-PEG。合併根據280nm的光密度定位、含有「PEG化」的SakSTAR變體的級分用於進一步分析。SDS-PAGE分析和考馬斯亮藍染色證實PEG交聯是定量的。如表20所示，與野生型葡激酶相比，PEG衍生物的比活只是略受影響。7．SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性如前所述測定SakSTAR變體的纖維蛋白溶解和纖維蛋白原溶解特性。使用所有待測分子獲得浸於人血漿中的125I-纖維蛋白標記的人血漿凝塊的劑量依賴與時間依賴溶解。從2小時凝塊溶解對纖溶酶原激活劑濃度的曲線圖(未顯示)圖表確定，試驗化合物的等效濃度(在2小時後使50％凝塊溶解；C50)，相當於或者只是略微低於SakSTAR(表20)。P20(Mr為20kDa的PEG)衍生變體的凝塊溶解的C50大約兩倍於未衍生的變體。因此，通過PEG衍生提高分子大小不能顯著影響葡激酶的纖維蛋白溶解活性。PEG-分子似乎降低擴散並因此降低衍生葡激酶對纖維蛋白凝塊的纖維蛋白溶解能力，但在NH2端區域-它在葡激酶加工過程中釋放-置換的變體似乎比在分子核心置換的變體更不明顯(參見表19、20)。8．在倉鼠中大劑量注射後聚乙二醇化學修飾的SakSTAR變體的藥物動力學特性在靜脈內大劑量注射100μg／kg SakSTAR變體後，在4隻一組的倉鼠中評估血液處理PEG化變體的藥物動力學參數。用另文描述的ELISA測定SakSTAR相關抗原。對欲定量的每一種SakSTAR變體校準該ELISA。藥物動力學參數包括初始半衰期(分鐘)，t1／2α=In2／α；終止半衰期(分鐘)，t1／2β=In2／β；中央(血漿)室體積(mL)，Vc劑量／(A+B)；曲線下面積(μg·分鐘·mL-1)，AUC=A／α+B／β；血漿清除率(mL·分鐘=-1)，Clp=劑量／AUC(32)。
在每組4隻倉鼠中大劑量注射100μg／kg選擇的SakSTAR變體後，血液對葡激酶相關抗原的處理率，可通過圖形曲線剝脫法由總共兩個指數項充分描述(結果未顯示)，由此得出表20中總結的血漿清除率Clp。PEG化變體的清除率明顯不同於野生型SakSTAR，並且與PEG分子的分子量成反比，PEG 5kDa平均降低5倍，PEG 10kDa平均降低10倍，PEG 20kDa平均降低30倍。這些結果可能是由於與PEG交聯引起的SakSTAR斯託克斯半徑的增加。實施例15SakSTAR(S3C-P20，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)(SY19(S3C-P20))在兩名急性心肌梗塞患者中的溶栓能力和清除率比較體內應用的SakSTAR變體的大規模純化和條件從18升培養體積中，將物質純化為均勻的。內毒素含量低於1IU／mg。HPLC凝膠過濾顯示，在柱層析範圍中有一個主要的對稱峰，代表＞98％的洗脫物質(曲線下的總面積)(未顯示)。30μg樣品的SDS凝膠電泳顯示一種主要成分。在方法中所述的3天檢驗中證明過濾除菌的製品是無菌的。與施用等量鹽水的小鼠(未顯示)相比，在5隻小鼠中靜脈內大劑量注射SakSTAR變體(3mg／kg體重)不能引起任何急性反應，8天內也不能降低體重增加。
對兩名急性心肌梗塞患者大劑量注射5mg SY19(S3C-P20)。根據冠狀血管造影術確定，在大劑量注射90分鐘後，這些患者的閉塞的梗塞相關動脈完全再通。物質以3-4小時的初始半衰期從血漿中清除，與之相比，野生型SakSTAR為4-6分鐘。這些數據證實，SakSTAR的PEG化變體可通過以降低劑量單次大劑量注射用於溶栓治療。結論總之，本發明表明，能產生抗體誘導明顯降低但有完全溶栓能力的葡激酶變體。這一結果構成了第一種情況，其中利用蛋白質工程技術，使異源蛋白質在人中的免疫原性明顯降低，而不降低其生物活性。另外，本發明表明，用不同分子量的聚乙二醇對葡激酶或其變體的選擇的化學修飾是可行的，導致與分子量成比例的血漿清除率的降低。在優選實施方案中，葡激酶NH2端區域-通過加工去除的部分-中的胺基酸被替換為Cys，並用OPSS或MAL-PEG化學修飾引入的硫醇基。這產生均一的產物，它在實驗動物和患者中單次靜脈內大劑量注射後，明顯降低的劑量即具有保持的溶栓能力。表1SakSTAR「帶電簇-丙氨酸」突變體的「丙氨酸-野生型」回復變體與固定鼠單克隆抗體(Mab)結合的締合常數(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表觀締合常數比野生型SakSTAR低≥10倍以黑體表示；比活≥100000HU／mg以黑體表示；≤60％吸附以黑體表示。表2用SakSTAR、SakSTAR(K74A)或SakSTAR(K74A，E75A，R77)治療的外周動脈阻塞患者的基線特徵和治療結果化合物 性別 年齡 臨床缺血 阻塞部位 阻塞時間 阻塞長度 血栓溶解引 溶栓劑總劑 輸注總持續 其它治療患者身份 (歲) (天)(cm) 起的再通 量(mg) 時間(小時)SakSTARMEE F67靜止痛 左SFA 308 完全 7.0 5.0 PTAFOR M68 跛足左IA(支架) 14 18 完全 6.5 4.5PTA+支架DAN M73 跛足 右SFA 306 完全 7.5 5.5 PTABER F63靜止痛 左FT移植物 18 55 完全 18 28 PTADAM F43 急性 左臂和橈動脈 27 完全 19 17PTA+支架TOR M68 跛足 右SFA(膕動脈瘤)50 12 完全 6.0 4.0 PTA+腿膕旁路移植CLA M74 急性 左PA 1.5 20 完全 9.0 7.0-MAN M65 急性左EIA(支架) 4 20 完全 6.5 4.5 (左趾V截肢術)MAT M64亞急性 右FP移植物3 45 完全 8.0 6.0 (-)平均值±SEM 65±3.017±5.6 21±5.8 9.7±1.79.1±2.7SakSTAR(K74A)LIE M70亞急性 右FF移植物 10 48 完全 11 9.0 PTAENG M50 跛足 右SFA 28 10 完全 12 10 PTACOX F48 跛足右PA移植物 257 部分 15 15 PTAMAN F68 跛足 右SFA≥120 9 完全 9.0 7.0 PTAVHE M47 急性右IF移植物 10 54 完全 18 16 手術移植矯正MUL F51 急性 右IF和FP移植物 1 63 完全 16 20 PTABUR F67靜止痛 右TF幹9.0 38 部分 18 21-NIJ F60靜止痛 左AF移植物 23 78 完全 15 21-POE*M49亞急性 右TF幹 230 部分 6.0 4.0rt-PA,手術移植延長VBE M39亞急性右BA(栓塞) 20 28 完全 18 23 右SC動脈支架,第一肋切除SME F50亞急性 TF幹 18 32 完全 21 19無WOL M67亞急性 右PA 4 25 完全 16 22-平均值±SEM 56±3.0 23±9.2 35±6.4 15±1.2 16±1.9SakSTAR(K74A,E75A,R77A)JAC F65 急性 右BA和UA 0.3 5 完全 14 12-MAE M74靜止痛 左SFA10 50 完全 9.0 7.0 PTACRA F52 跛足右IA和FA動脈 14 28 完全 25 23 PTA+支架VDB M68 跛足左SFA90 12 完全 9.07.0 PTADUN M71亞急性 左SFA14 6 完全 9.07.0 PTADEL M59 急性 右FT移植物 3 42 完全 9.07.0 PTA平均值±SEM 65±3.3 22±14 24±7.813±2.611±2.6AF股主動脈；BA肱動脈；CIA髂總動脈；FF股腓；FP股膕；FT股脛；IA髂動脈；IF髂股；PA膕動脈；PTA經皮腔內血管成形術；SFA淺股動脈；TF脛腓；UA尺動脈。*1994年用SakSTAR治療。表3SakSTA的丙氨酸置換變體與固定鼠單克隆抗體(Mab)結合的締合常數(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表3(續)
表3(續)
表3(續)
表4S34、G36和H43的誘變與固定鼠單克隆抗體(Mab)結合的締合常數(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表5K35、Y73、K74、E80／D82、N95、K130、V132和K135的誘變與固定鼠單克隆抗體(Mab)結合的締合常數(KA×107mol／L-1)，和免疫患者血漿抗體的吸附(％)
表5(續)
表6SakSTAR(K130T，K135R)與K35A、G36R、E65X、K74X和所選其它胺基酸的組合突變體
表6(續)
表6(續)
締合常數低≥10倍及抗體吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑體表示；≥100000HU／mg以黑體表示。NT未檢測。表7SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)與K35A、G36R、E65X、K74X和所選其它胺基酸的組合突變體
表7(續)
締合常數低≥10倍及抗體吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑體表示；≥100000HU／mg以黑體表示。NT未檢測。表8具有完全比活(≥100kHU／mg)和≤50％的野生型SakSTAR治療引起的人抗體的吸附的SakSTAR變體
抗體吸附≤野生型SakSTAR的60％以黑體表示≥100000HU／mg以黑體表示。表9選擇的SakSTAR變體在人血漿中的體外纖維蛋白溶解特性
表11用SakSTAR、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)或SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)治療的外周動脈阻塞患者的基線特徵和治療結果
表12SakSTAR變體對外周動脈阻塞患者中SakSTAR變體引起的抗體的吸附
表13
表15用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)治療的外周動脈阻塞患者的特徵
表16用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)治療的外周動脈阻塞患者的治療和結果
PTA經皮腔內血管成形術；IF髂股；FT股脛；FP股膕。表17對外周動脈阻塞患者施用SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)、SakSTAR(K35A，E65Q，K74Q，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)或SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，D82A，S84A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R，K136A，_137K)之前和之後的中和抗體活性
表18SakSTAR變體存外周動脈阻塞患者中的免疫原性
數據表示中值和15-85百分範圍。表19SakSTAR的半胱氨酸置換變體
表20用馬來醯亞胺-聚乙二醇置換、免疫原性降低的SakSTAR的半胱氨酸置換變體
*SP5OPSS-PEG 5kDa；MP5MAL-PEG 5kDa；P10MAL-PEG 10kDa；P20MAL-PEG 20kDa。
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權利要求
1．與野生型葡激酶相比在向動脈血栓形成患者施用後顯示降低的免疫原性的葡激酶衍生物。
2．權利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如圖1所示的胺基酸序列，其中一個或多個胺基酸被替換為另一種胺基酸，從而降低了與一系列鼠單克隆抗體的反應性。
3．權利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如圖1所示的胺基酸序列，其中一個或多個胺基酸被替換為另一種胺基酸，從而降低了用葡激酶治療的患者血漿中SakSTAR特異性抗體吸附。
4．權利要求1的葡激酶衍生物，其具有基本如圖1所示的胺基酸序列，其中一個或多個胺基酸被替換為其它胺基酸，而不使比活降低超過50％。
5．具有如圖1所示胺基酸序列的葡激酶衍生物SakSTAR(K35X，G36X，E65X，K74X，E80X，D82X，K102X，E108X，K109X，K121X，K130X，K135X，K136X，+137X)，其中位點35的Lys、位點36的Gly、位點65的Glu、位點74的Lys、位點80的Glu、位點82的Asp、位點102的Lys、位點108的Glu、位點109的Lys、位點121的Lys、位點130的Lys、位點135的Lys和／或位點136的Lys中的一個或多個胺基酸被替換為其它胺基酸，和／或其中在COOH端添加了一個胺基酸，從而改變了向患者施用後的免疫原性，而不明顯降低比活。
6．表1、3、4、5、6、7、8、13、19和20中所列的葡激酶衍生物，其具有如圖1所示的胺基酸序列，其中指定的胺基酸被替換為其它胺基酸，從而降低了用葡激酶治療的患者血漿中SakSTAR特異性抗體的吸附，而不降低比活。
7．權利要求1-6的葡激酶衍生物，其選自SakSTAR(K74A，E75A，R77A)、SakSTAR(K35A，E75A)、SakSTAR(E75A)、SakSTAR(E80A，D82A)、SakSTAR(E80A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(E75A，D82A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(K35A)、SakSTAR(D82A)、SakSTAR(D82A，S84A)、SakSTAR(T90A)、SakSTAR(Y92A)、SakSTAR(K130A)、SakSTAR(V132A)、SakSTAR(S34G，G36R，H43R)、SakSTAR(G36R)、SakSTAR(H43R)、SakSTAR(G36R，K74R)、SakSTAR(K35E)、SakSTAR(K74Q)、SakSTAR(K130T)、SakSTAR(V132L)、SakSTAR(V132T)、SakSTAR(V132N)、SakSTAR(V132R)、SakSTAR(K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(G36R，H43R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K86A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，T71S，K74Q，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K130A，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，K135R)、SakSTAR(K74Q，K130E，V132R，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，T90A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R)、SakSTAR(N95A，K130A，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K109A，K130，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E108A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，K121A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，N95A，E118A，K130A，K135R，K136A，+137K)、SakSTAR(E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65S，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(S34G，G36R，K74R，K130T，K135R)、SakSTAR(E65A，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65N，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K57A，E58A，E61A，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65Q，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K74R，E80A，D82A，S103A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K109A，K130T，K135R)、SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R，K136A)、SakSTAR(E65Q，K74Q，D82A，S84A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，K74Q，E80A，D82A，K130T，K135R)、SakSTAR(K35A，E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
8．編碼為SY19的SakSTAR(E65D，K74R，E80A，D82A，K130T，K135R)。
9．編碼為SY161的SakSTAR(K35A，E65Q，K74R，E80A，D82A，T90A，E99D，T101S，E108A，K109A，K130T，K135R)。
10．權利要求1-9的葡激酶衍生物，其含有一個替換為Cys的胺基酸，導致二聚化和／或增高的比活和／或降低的清除率和／或增強的溶栓能力。
11．具有聚乙二醇取代的權利要求1-10的葡激酶衍生物，其特徵在於保持的比活和明顯降低的血漿清除率。
12．權利要求10的葡激酶衍生物，其中Cys用分子量可達20kDa的聚乙二醇化學修飾。
13．權利要求12的葡激酶衍生物，其中NH2端區10個胺基酸中的所選胺基酸被替換為用分子量可達20kDa的聚乙二醇化學修飾的Cys，該衍生物的特徵在於在以降低劑量單次靜脈內大劑量施用後明顯降低的血漿清除率和保持的溶栓能力。
14．權利要求13的葡激酶衍生物，其中位點2或3的絲氨酸被替換為半胱氨酸，而該半胱氨酸用分子量5、10或20kDa的聚乙二醇化學修飾。
15．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY161(S3C-MP5)。
16．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY161(S3C-P10)。
17．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY161(S3C-P20)。
18．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-MP5)。
19．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-SP5)。
20．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S2C-SP5，S3C-SP5)。
21．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-P20)。
22．權利要求14的葡激酶衍生物，該衍生物是表20所示的SY19(S3C-P10)。
23．權利要求10的兩個葡激酶衍生物的二聚體。
24．生產權利要求1-10的葡激酶衍生物的方法，包括下列步驟a．製備至少包含提供生物活性的葡激酶編碼序列部分的DNA片段；b．對該DNA片段進行體外定點誘變，將野生型胺基酸的一個或多個密碼子替換為另一種胺基酸的密碼子；c．在適當的載體中克隆突變的DNA片段；d．用該載體轉化或轉染適當的宿主細胞；和e．在適於表達該DNA片段的條件下培養該宿主細胞。
25．權利要求24的方法，其中所述DNA片段是質粒pMEX602sakB的453bp EcoRI-HindⅢ片段，進行體外定點誘變，並在大腸桿菌中表達突變的DNA片段。
26．包含至少一種權利要求1-23的葡激酶衍生物與適當賦形劑的藥用組合物。
27．用於治療動脈血栓形成的權利要求26的藥用組合物。
全文摘要
鑑定、生產和應用葡激酶衍生物的方法,其特徵在於在對患者施用後免疫原性降低,並且能通過單次靜脈內大劑量注射施用。本發明的衍生物的獲得方法包括,製備至少包含提供生物活性的葡激酶編碼序列部分的DNA片段;對該DNA片段進行體外定點誘變,以將野生型胺基酸的一個或多個密碼子替換為另一種胺基酸的密碼子;在適當的載體中克隆突變的DNA片段;用該載體轉化或轉染適當的宿主細胞;在適於表達該DNA片段的條件下培養該宿主細胞。將表達的葡激酶衍生物純化為均一的,並用硫醇基定點的聚乙二醇化學修飾置換的Cys;該DNA片段優選地是質粒pMEX602sakB(pMEX.sakSTAR)的453bp EcoRI－HindIII片段,通過剪接重疊延伸聚合酶鏈反應進行體外定點誘變,並在大腸桿菌株TG1或WK6中表達突變的DNA片段。本發明也涉及包含至少一種根據本發明的葡激酶衍生物與適當賦形劑的藥用組合物,用於動脈血栓形成的治療。
文檔編號C12N9/12GK1293712SQ99804195
公開日2001年5月2日 申請日期1999年2月4日 優先權日1998年2月4日
發明者德西雷·何塞·科倫 申請人:思羅姆-X股份有限公司, 德西雷·何塞·科倫