軸突素,一種神經基因(neurogene)的製作方法

2023-05-26 03:21:41

專利名稱：軸突素,一種神經基因(neurogene)的製作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及編碼名為軸突素(Neuritin)的多肽的新DNA序列，該多肽主要在某些腦組織中在對某些刺激應答時表達。
相關技術一些神經障礙和疾病至少部分由特定類別的神經元的退化或死亡引起。例如，帕金森病的特徵為隨意肌運動減慢、肌肉僵硬和震顫。這種症狀至少部分歸因於位於稱為黑質的大腦特定區域的產多巴胺神經元的進行性退化。這些神經元(「多巴胺能神經元」)的退化導致在稱為紋狀體的大腦鄰近區域內多巴胺水平降低。紋狀體具有表達多巴胺受體的神經元；這些神經元參與控制運動原活性。未知多巴胺能神經元退化的原因，但已歸因於自由基、鐵含量過量、環境毒素、興奮性胺基酸神經毒性和可能缺乏某些神經營養因子(Jenner,Neurology，增刊3:S6-S12；Adams和Victor編輯，Principles of Neurology，第42章神經系統的退化性疾病，McGraw Hill,NY)。
諸如肌萎縮性側索硬化(ALS)、進行性肌萎縮和遺傳性運動和感覺神經病(Charcot-Marie-Tooth病)全部至少部分是由於位於脊索腹側角中的運動神經元衰退。
海馬這一屬於大腦皮質一部分的已準確定義的結構在形成長期記憶中很重要。海馬的破壞(例如由局部缺血造成)可以導致不能形成新的記憶。位於海馬CA1區的錐形CA1神經元的退化是早老性痴呆的特徵之一。這些神經元選擇性地易受在諸如中風和頭部創傷的情況下發生的局部缺血和缺氧損傷的傷害。另外，CA1錐形海馬神經元以及位於海馬CA3區的錐形神經元在癲癇中被選擇性地損傷。
紋狀體是黑質具有多巴胺能的神經元的神經末梢的神經分布區。紋狀體神經元的大多數利用GABA(4-氨基丁酸)做為它們的神經遞質。紋狀體是亨廷頓舞蹈病中發生的進行性退化的主靶，其中主要的神經元損失即是紋狀體的利用GABA的神經元的損失。
含有5-羥色胺的神經元位於成簇圍繞後腦中線的群中。這些神經元參與控制體溫、情緒和睡眠。含有5-羥色胺的神經元系統的疾病包括例如壓抑、其它情緒障礙和睡眠紊亂。
感光細胞是視網膜神經元的特化亞群，負責視覺。感光細胞的損傷和/或死亡可以導致失明。諸如由色素性視網膜炎、年齡相關性黃斑變性和固定夜盲引起的視網膜退化的特徵均為感光細胞外節進行性萎縮和喪失功能，所述外節是含有將光刺激轉化成為電活性的視色素的特化結構。
雖然有一些可用的治療法治療這種疾病的症狀和減輕其嚴重性(例如，治療帕金森病的L-多巴)，但目前沒有有效的治療以防止或減輕大多數上述類別的受影響神經元的退化或促進它們的修復。
近來，基於對各種神經元的營養活性，已鑑別了幾種自然產生的蛋白質分子。這些分子被命名為「神經營養因子」。神經營養因子是可以調節神經元生存、生長和/或形態可塑性的內源可溶性蛋白質(參見Fallon和Laughlin,Neurotrophic Factors,Academic Press,San Diego,CA)。
基於胺基酸序列同源性和/或三維結構，已知的神經營養因子屬於多肽生長因子的幾種不同的蛋白超家族(MacDonald和Hendrikson,Cell,73:421-424)。神經營養因子的一個家族是神經營養蛋白家族。目前這個家族包括NGF(神經生長因子)、BDNF(腦源神經營養因子)、NT-3(神經營養蛋白-3)、NT-4(神經營養蛋白-4)和NT-6(神經營養蛋白-6)。
CNIF(睫狀神經營養因子)和LIF(白血病抑制因子)是具有神經營養活性的細胞因子多肽。鑑於其結構特徵和受體成分，這些多肽與造血細胞因子家族有關，該家族包括IL-6(白細胞介素-6)、IL-11(白細胞介素-11)、G-CSF(粒細胞集落刺激因子)和制癌蛋白-M。
GDNF(神經膠質源神經營養因子)是屬於TGF-β(轉化生長因子β)超家族的神經營養因子。GDNF對多巴胺能神經元和運動神經元顯示出有效力的促進生存和分化的作用(Lin等，Science,260:1130-1132；Yan等，Nature,373:341-344)。
雖然已知這些神經營養因子增強神經元的生長和/或生存，但對與這些因子聯合作用的分子所知較少。可以鑑別其它神經營養蛋白和相關分子的一種方式，是給予一種動物一種或多種已知對神經系統有影響的化合物，然後分析組織中參與對該化合物神經應答的基因的誘導。例如，可以篩選在諸如大腦海馬區的神經系統的某些組織中被誘導的基因。Nedivi等(Nature,363:718-722；Nedivi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:2048-2053)使用了這種技術，鑑別對給予稱為紅藻氨酸的穀氨酸神經遞質類似物應答時在海馬齒狀回部分誘導的新基因。
諸如NGF、BDNF、NT3、GDNF、bFGF、IGF-1和TGF-β的許多神經營養因子的表達由傳入神經元活性和/或由神經元損傷調節。可以在對穀氨酸類似物紅藻氨酸應答時，在海馬齒狀回觀察到一些這種基因的強誘導(Isaokson,Current Opinions in Neurobiology 5:50-357)。看來紅藻氨酸處理增加了從警覺大鼠海馬釋放新化合物，這種活性看來與已知神經營養因子的作用不同(Humpel，等，Science,269:552-554)。
從許多神經系統障礙和疾病沒有已知治癒方法的事實來看，在本領域內需要鑑別新化合物治療神經病症和疾病，例如帕金森病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、早老性痴呆、中風和各種影響視力的退化性疾病。
因此，本發明的一個目的是提供可以用於促進神經元再生和恢復神經功能的新化合物。
本發明的再一目的是提供治療某些神經疾病的方法。
根據本發明書，本發明的這些和其它目的對本領域一般技術人員是顯而易見的。
發明概述在一個實施方案中，本發明提供選自以下的編碼多肽的核酸分子(a)SEQ ID NO:1的核酸分子；(b)SEQ ID NO:2的核酸分子；(c)編碼SEQ ID NO:3的多肽的核酸分子；(d)編碼SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子；(e)編碼與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽至少70％相同的多肽的核酸分子；(f)是上述(a)-(e)的任何一個的互補物的核酸分子。
在一個實施方案中，本發明提供包括上述陳述的核酸分子的載體。
在再一實施方案中，本發明提供包含這些載體的宿主細胞。
在又一實施方案中，本發明提供產生軸突素多肽的方法，包括步驟(a)在適當宿主中表達由權利要求1的核酸編碼的多肽；和(b)分離該多肽。可選地，該軸突素多肽是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
在再一實施方案中，本發明提供選自以下的軸突素多肽(a)SEQ ID NO:3的多肽；(b)SEQ ID NO:4的多肽；和(c)與(a)或(b)的多肽至少70％同源的多肽。可選地，該軸突素多肽可以是軸突素的生物活性片段，諸如胺基酸25-115、25-143、胺基酸1-115等等。
附圖簡述

圖1描繪大鼠軸突素cDNA序列(SEQ ID NO:1)。
圖2描繪人軸突素cDNA序列(SEQ ID NO:2)。
圖3描繪大鼠軸突素全長翻譯的胺基酸序列(SEQ ID NO:3)。
圖4描繪人軸突素全長翻譯的胺基酸序列(SEQ ID NO:4)。
圖5描繪二個RNA印跡。圖5A是用軸突素探針探測的各種大鼠組織的RNA印跡。縮寫是h(心臟)；br(大腦)；sp(脾臟)；lu(肺)；li(肝臟)；m(肌肉)；k(腎臟)；t(睪丸)。圖5B是或者對照(-)大鼠或者紅藻氨酸處理(+)大鼠的大腦各種區域的RNA印跡。縮寫是Cereb(小腦)；Hipp(海馬)；DG(齒狀回)。用軸突素探測該印跡。
圖6描繪各種RNA印跡。圖6A顯示用BDNF、NT-3、FGF、AMPA、NMDA或KCl處理的大鼠海馬神經元和皮質神經元的RNA印跡。對照「0」未接受處理。圖6B顯示從用鹽水(「S」)或BDNF(「B」)注射的大鼠得到的海馬RNA和皮質RNA的RNA印跡。「0」表明沒有處理。
圖7是對用或者BDNF或者KCl的處理應答時大鼠E-18海馬神經元中軸突素mRNA水平的誘導時間進程圖。
圖8描繪用抗軸突素抗體探測的二個蛋白質印跡。圖8A描繪用或者對照質粒(「親代」)或者具有編碼全長人軸突素的基因的質粒轉染的CHO細胞(細胞系名稱「CHO15.4」)的蛋白質印跡。「PI-PLC」指磷脂醯肌醇-磷脂酶C,「+」和「-」指存在或不存在PI-PLC。圖8B描繪大鼠各種組織的蛋白質印跡。用軸突素抗體探測該印跡。在此印跡中評價的組織的縮寫見於本文中。
圖9描繪在存在(+)或缺乏(-)軸突素時培養的海馬(「Hipp」)和皮質(「Cort」)大鼠胚胎神經元培養物。「DiI」指用親脂性螢光染料DiI處理。
發明詳述本文使用的術語「軸突素」當用於描述核酸分子時，指核酸分子或其片段，它(a)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中陳述的核苷酸序列；(b)具有編碼下述多肽的核苷酸序列，所述多肽與由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的任何一個編碼的多肽至少70％相同，但可以至少80％或90％相同；(c)是(a)或(b)的自然產生的等位基因變異體；(d)按照本文提供所產生的(a)-(c)的核酸變異體；和/或(e)與(a)-(d)互補。
可以通過通常用於比較二條多肽胺基酸位置的相似性的標準方法確定序列相同性百分比。使用諸如BLAST或FASTA的電腦程式，將二條多肽對齊以使其相應的胺基酸最佳匹配(或者沿著一個或二個序列的全長度，或者沿著一個或二個序列的預定部分)。所述程序提供了一個「默認」openig補償值(opening penalty)和一個「默認」空隙補償值，可以將諸如PAM 250(標準計分矩陣；參見Dayhoff等，載於Atlas of Protein Sequence and Structure,第5卷，增刊3)的計分基質與該電腦程式聯合使用。然後可以如下計算相同性百分比
至少70％相同的多肽一般具有一個或多個胺基酸替代、缺失和/或插入。通常替代是保守性的，使對該蛋白的總靜電荷、極性或疏水性具有幾乎沒有或沒有影響，但可選地可以增強軸突素的活性。在以下表Ⅰ中陳述了保守性替代。
表Ⅰ保守性胺基酸替代鹼性 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性 穀氨酸天冬氨酸極性 穀氨醯胺天冬醯胺疏水性 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳族 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸術語「嚴格條件」指在僅允許諸如寡聚核苷酸或cDNA分子探針的核酸分子與高度同源序列結合的條件下雜交和清洗。一種嚴格清洗溶液是在55℃-65℃的溫度下使用的0.015M NaCl、0.005M檸檬酸鈉和0.1％SDS。另一種嚴格清洗條件是在50℃-65℃之間的溫度下使用的0.2XSSC和0.1％SDS。當使用寡聚核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫時，可以使用以下嚴格清洗條件。一種方案使用35℃-62℃下的含有0.05％焦磷酸鈉的6XSSC，溫度取決於寡聚核苷酸探針的長度。例如，14個鹼基對的探針在35℃-40℃清洗，17個鹼基對的探針在45-50℃清洗，20個鹼基對的探針在52-57℃清洗，而23個鹼基對的探針在57-63℃清洗。當本底非特異性結合高時，可以將溫度增加2-3℃。第二種方案使用氯化四甲銨(TMAC)清洗寡聚核苷酸探針。一種嚴格清洗溶液是3M TMAC、50mM Tris-HCl、pH8.0和0.2％SDS。使用該溶液的清洗溫度是探針長度的函數。例如，在約45-50℃清洗17個鹼基對的探針。
本文使用的術語「軸突素蛋白」或「軸突素多肽」指任何具有本文描述的軸突素性質的蛋白或多肽。軸突素多肽根據其製備方式可以具有或不具有氨基末端甲硫氨酸。作為說明，軸突素蛋白或軸突素多肽指(1)由上述(a)-(e)的任何一項陳述的核酸分子編碼的胺基酸序列及由其衍生的肽或多肽片段，(2)SEQ ID NO:3或4中陳述的胺基酸序列，和/或(3)本文提供的化學修飾衍生物以及核酸序列和/或胺基酸序列的變異體。
本文使用的術語「軸突素片段」指小於自然產生軸突素蛋白全長胺基酸序列、但具有與上述軸突素多肽或軸突素蛋白基本上相同的生物學活性的肽或多肽。這種片段可以在氨基末端、羧基末端(例如大約是軸突素多肽的最後27個胺基酸的GPI錨定域)和/或內部截短，並可以是化學修飾的。優選地，該軸突素片段為保留至少6個半胱氨酸殘基的軸突素片段。可以製備具有或不具有氨基末端甲硫氨酸的這種軸突素片段。
本文使用的術語「軸突素衍生物」或「軸突素變異體」指這樣的軸突素多肽或軸突素蛋白，它1)已例如通過添加聚乙二醇或其它化合物進行化學修飾，和/或2)與圖3或4中陳述的軸突素相比，具有一個或多個核酸或胺基酸序列替代、缺失、和/或插入。
本文使用的術語「生物學活性多肽」和「生物學活性片段」指具有軸突素活性(即促進海馬或皮質神經元培養物中軸突發生(neuritogenesis))的肽或多肽。
本文使用的術語「有效量」和「治療有效量」指支持上述軸突素的一種或多種生物學活性必需的軸突素的量。
可以用於實踐本發明的軸突素多肽可以是自然產生的全長多肽、截短多肽或肽(即「片段」)。所述多肽或片段可以如下述化學修飾即糖基化、磷酸化和/或連接至聚合物，根據其製備方法，它們可以具有氨基末端甲硫氨酸。另外，所述多肽或片段可以是自然產生的軸突素多肽的變異體(即，與自然產生軸突素相比，可以具有一個或多個胺基酸缺失、插入和/或替代)。
可以使用熟知的重組DNA技術方法，例如在Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)和/或Ausubel等編輯(分子生物學現行方法，Green Publishers Inc.和Wiley and Sons,NY)中描述的那些方法，製備全長軸突素多肽或其片段。可以通過例如篩選基因組或cDNA文庫或者通過PCR擴增，得到編碼軸突素蛋白或其片段的基因或cDNA。或者，可以使用本領域技術人員熟知的諸如由Engels等(Angew.Chem.Intl.Ed.,28:716-734)描述的那些方法，通過化學合成製備編碼軸突素多肽或片段的基因。這些方法包括特別是用於核酸合成的磷酸三酯、亞磷醯胺和H-磷酸酯方法。這種化學合成的優選方法是使用標準亞磷醯胺化學的聚合物支持合成。一般地，編碼軸突素多肽的DNA長度為幾百個核苷酸。使用這些方法，可以分幾個片段合成大於約100個核苷酸的核酸。然後可以將所述片段連接起來形成全長軸突素多肽。通常，編碼該多肽氨基末端的DNA片段具有一個ATG，其編碼甲硫氨酸殘基。在軸突素多肽的成熟形式上可以存在或不存在該甲硫氨酸，取決於在宿主細胞中產生的所述多肽是否從該細胞分泌。
在一些情況下，可能希望製備自然產生的軸突素的核酸和/或胺基酸變異體。可以使用定點誘變或PCR擴增產生核酸變異體(其中設計一個或多個核苷酸與野生型或自然產生的軸突素不同)，使用PCR時的引物具有所需點突變(有關誘變技術的描述，參見Sambrook等，見上述，和Ausubel等，見上述)。亦可以使用由Engels等(見上述)描述的方法，使用化學合成製備這種變異體。也可以使用本領域技術人員已知的其它技術。優選的核酸變異體是那些考慮到用於產生軸突素的宿主細胞中的密碼予選擇而具有的核苷酸替代的變異體。其它優選的變異體是那些與野生型相比編碼如上述的保守性胺基酸改變(例如，其中通過用不同的胺基酸替代，基本上不改變自然產生的胺基酸側鏈的電荷或極性)的變異體，和/或那些設計用於在軸突素上或者產生新糖基化位點和/或磷酸化位點的變異體，或那些設計用於在軸突素上缺失現存糖基化位點和/或磷酸化位點的變異體。
可以將軸突素基因或cDNA插入用於在宿主細胞中表達的適當載體。選擇在使用的特定宿主細胞中有功能的載體(即，該載體與宿主細胞機制相容，使得軸突素基因的擴增和/或該基因的表達可以發生)。可以在原核生物、酵母、昆蟲(杆狀病毒系統)和/或真核生物細胞中擴增/表達軸突素多肽或其片段。宿主細胞的選擇至少部分取決於該軸突素多肽或其片段是否要糖基化。如果要糖基化，最好使用酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞；酵母細胞將糖基化該多肽，昆蟲和哺乳動物細胞可以如在軸突素多肽上自然發生的那樣糖基化和/或磷酸化該多肽(即「自然」糖基化和/或磷酸化)。
一般地，用於任何宿主細胞的載體都具有5』側翼序列(亦稱為『啟動子』)和其它調節元件，諸如增強子、複製起點元件、轉錄終止元件、具有供體和受體剪接位點的完整內含子序列、信號肽序列、核糖體結合位點元件、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼欲表達的多肽的核酸的多接頭區和選擇標記元件。在以下討論每種這些元件。可選地，該載體可以有一個「標記」序列，即位於軸突素編碼序列5』或3』末端、編碼多聚組氨酸(諸如六聚組氨酸)或另一小免疫原性序列的寡聚核苷酸序列。該標記可以與所述蛋白一起表達，並可以用作從宿主細胞純化軸突素多肽的親和標記。可選地，以後可以通過各種方法，諸如使用例如選擇的肽酶，從純化的軸突素多肽除去該標記。
5』側翼序列可以是同源的(即，源自宿主細胞的同一物種和/或菌株)、異源的(即，源自與宿主細胞的物種或菌株不同的物種)、雜種(即，多種來源5』側翼序列的組合)、合成的，或它可以是天然軸突素5』側翼序列。如此，該5』側翼序列的來源可以是任何單細胞原核生物或真核生物、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體、或任何植物，只要該5』側翼序列在宿主細胞機制中具有功能和可以被宿主細胞機制激活。
可以通過本領域已知的幾種方法的任何一種，得到可用於本發明載體的5』側翼序列。一般地，可以通過作圖和/或限制性內切酶消化，預先鑑別不同於軸突素5』例翼序列的可用於本文的5』側翼序列，並由此可以使用適當的限制性內切酶從適當的源組織將其分離。在某些情況下，該5』側翼序列的全長核苷酸序列可能是已知的。在此，可以採用上述關於核酸合成或克隆的方法合成該5』側翼序列。
當已知該5』側翼序列的全部或部分時，可以使用PCR和/或通過用適當的寡聚核苷酸和/或同一物種或另一物種的5』側翼序列片段篩選基因組文庫將其得到。
當未知該5』側翼序列時，可以從可能含有例如編碼序列或甚至另外一種或多種基因的大片段DNA分離含有5』側翼序列的DNA。使用一種或多種仔細挑選的用於分離正確DNA片段的酶，通過限制性內切酶消化完成所述分離。消化後，可以通過瓊脂糖凝膠純化、Qiagen柱或本領域技術人員已知的其它方法分離所需片段。完成這一目的的適當酶的選擇，對本領域一般技術人員是顯而易見的。
複製起點元件一般是市售購得的原核表達載體的一部分，可以幫助所述載體在細胞中擴增。將該載體擴增至某一拷貝數，可能在某些情況下對軸突素多肽的最佳表達很重要。如果選擇的載體沒有複製起點位點，可以根據已知序列化學合成一個起點位點，並將其連接至所述載體。
轉錄終止位點一般位於軸突素多肽編碼序列的3』末端，起終止軸突素多肽轉錄的作用。通常，原核細胞中的轉錄終止元件是後接多聚T序列的富含G-C片段。雖然可以容易地從文庫克隆該元件或可以做為載體的一部分市售購得，但亦可以容易地使用諸如上述核酸合成的方法合成該元件。
可選擇標記基因元件編碼在選擇性培養基中生長的宿主細胞的生存和生長所必需的蛋白。典型的選擇標記基因編碼這種蛋白質，該蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如，對於原核宿主細胞的氨苄青黴素、四環素或卡那黴素的抗性，(b)彌補細胞的營養缺陷；或(c)提供複合培養基沒有的關鍵營養。優選的可選擇標記是卡那黴素抗性基因、氨苄青黴素抗性基因和四環素抗性基因。
通常稱為SD序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)的核糖體結合元件對mRNA翻譯起始是必需的。該元件一般位於啟動子的3』和欲合成的軸突素多肽編碼序列的5』。SD序列有變化，但一般是多嘌呤(即，具有高A-G含量)。已鑑別了許多SD序列，每一個SD序列都可以使用上述方法容易地合成並用於原核載體。
在希望軸突素從宿主細胞分泌的那些情況下，可以使用信號序列將軸突素多肽導出合成它的宿主細胞，並且可以將該蛋白的羧基末端部分缺失以防止膜錨定。一般地，將信號序列置於軸突素核酸序列的編碼區，或直接置於軸突素編碼區的5』末端。已鑑別了許多信號序列，任何在選擇的宿主細胞中有功能的信號序列都可以與軸突素基因聯用。因此，信號序列可以與軸突素多肽同源或異源，並且可以與軸突素多肽同源或異源。另外，可以使用上述方法化學合成信號序列。在大多數情況下，藉助信號肽的存在從宿主細胞分泌多肽，將導致除去多肽的氨基末端甲硫氨酸。為便於分泌，可以除去軸突素多肽的C末端區。該C末端區長度為約27個胺基酸，而且許多胺基酸是疏水性的；再則，在該區域有一個在許多糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定蛋白中發現的共有酶切信號序列。
在許多情況下，載體上存在一個或多個內含子增加軸突素多肽的轉錄；這對真核宿主細胞特別是哺乳動物宿主細胞尤其如此。所述內含子可以是該軸突素核酸序列內自然存在的，特別是當使用的軸突素序列是全長基因組序列或其片段時。如果所述內含子不是自然存在於軸突素DNA序列之內(絕大多數cDNA即是如此)，則可以從其它來源得到內含子。內含子相對於5』側翼序列和軸突素編碼序列的位置很重要，因為必須將內含子轉錄為有效的。如此，當軸突素核酸序列是cDNA序列時，內含子的優選位置是轉錄起始位點的3』和多聚A轉錄終止序列的5』。對於軸突素cDNA，最好內含子位於軸突素編碼序列的一邊或另一邊(即，5』或3』)，使得它不幹擾該編碼序列。任何來源的、包括任何病毒、原核生物和真核生物(植物或動物)的任何內含子都可以用於實踐本發明，只要它與其插入的宿主細胞相容。本文亦包括合成內含子。可選地，在載體中可以使用一個以上的內含子。
在上述的一個或多個元件在欲使用的載體中不存在的情況下，可以分別得到它們並連接入所述載體。用於得到每一種所述元件的方法對本領域技術人員是眾所周知的，可以與上述方法(即，合成DNA、文庫篩選等等)相類似。
一般從諸如市售得到的載體的起始載體，構建用於實踐本發明的最終載體。這種載體可以具有或不具有準備包含於完成的載體中的一些元件。如果在起始載體中沒有任何所需元件，通過用適當限制性內切酶切割所述載體，使得欲連接入的元件末端和載體的末端適於連接，單獨地將每個元件連接入所述載體。在一些情況下，可能需要使欲連接的末端「形成平端」，以得到滿意的連接。使用Klenow DNA聚合酶或T4DNA聚合酶，在存在所有四種核苷酸時首先填滿「粘性末端」，完成平端形成。該程序是本領域眾所周知的，例如在Sambrook等，見上述中做了描述。
或者，可以首先將欲插入所述載體的二個或多個元件連接在一起(如果要將它們鄰接配置)，然後再連接入載體。
構建載體的另一方法是在一個反應混合物中同時進行各種元件的所有連接。這樣由於元件的錯誤連接或插入，會產生許多無用或非功能性載體，但是可以通過限制性內切酶消化，鑑別和選擇功能載體。
用於實踐本發明的優選載體是那些與細菌、昆蟲和哺乳動物宿主細胞相容的載體。這種載體包括特別是pCRⅡ(InvitrogenCompany,San Diego,CA)、pBSⅡ(Stratagene Company,LaJolla,CA)和pETL(BlueBacⅡ；Invitrogen)。
已構建載體並已將軸突素核酸插入載體的正確位點之後，可以將完成的載體插入適當的宿主細胞，以擴增和/或表達軸突素多肽。
宿主細胞可以是原核宿主細胞(諸如大腸桿菌)或真核宿主細胞(諸如酵母細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞)。該宿主細胞在適當條件下培養時，可以合成軸突素蛋白，接著可以從該培養基收集該蛋白(如果宿主細胞將其分泌入培養基)，或直接從產生它的宿主細胞收集該蛋白(如果不分泌)。收集後，使用諸如分子篩層析、親和層析等等方法可以純化軸突素蛋白。
宿主細胞的選擇部分取決於該軸突素蛋白是否要糖基化或磷酸化(此時優選使用真核宿主細胞)、以及宿主細胞能夠將該蛋白「摺疊」成為其天然三級結構(即二硫橋的正確定向)使得由該細胞產生生物學活性蛋白的方式。然而，在宿主細胞不合成生物學活性軸突素的情況下，可以使用下述適當化學條件在合成後「摺疊」軸突素。
適當的細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或3T3細胞。適當哺乳動物宿主細胞的選擇以及轉化、培養、擴增、篩選和產物的產生和純化方法是本領域已知的。其它適當的哺乳動物細胞系是猴COS-1和COS-7細胞系和CV-1細胞系。其它典型的哺乳動物宿主細胞包括靈長類細胞系和嚙齒類動物細胞系，包括轉化細胞系。源自初生組織體外培養的正常二倍體細胞、細胞株以及初生外植塊亦是合適的。候選的細胞可以是選擇基因的基因型缺陷，或可以含有一個顯性作用選擇基因。其它合適的哺乳動物細胞系包括但不限於HeLa、小鼠L-929細胞、源自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK倉鼠細胞系。
類似的可以做為適用於本發明的宿主細胞使用的是細菌細胞。例如，大腸桿菌的各種菌株(例如，HBl01、DH5α、DH10和MC1061)是生物技術領域眾所周知的宿主細胞。枯草桿菌(B.subtilis)、假單孢菌屬未定名種(Pseudomonas spp.)、其它芽胞桿菌屬未定名種(Bacillius spp.)、鏈黴菌屬未定名種(Streptomyces spp.)等等的各種菌株亦可以用於該方法中。
本領域技術人員已知的酵母細胞的許多菌株亦可以做為表達本發明多肽的宿主細胞。另外，如果需要，可以使用昆蟲細胞做為本發明的宿主細胞(Miller等，Genetic Engineering 8:277-298)。
使用諸如氯化鈣、電穿孔、微注射、脂轉染或DEAE-葡聚糖方法的方法，可以完成將載體插入(亦稱為「轉化」或「轉染」)選擇的宿主細胞。選擇的方法在某種程度上隨使用的宿主細胞類型而變。這些方法和其它合適的方法對本領域技術人員是眾所周知的，在例如Sambrook等，見上述中有描述。
使用本領域技術人員眾所周知的標準培養基，可以培養含有所述載體的(即，轉化或轉染的)宿主細胞。所述培養基通常具有對於細胞生長和生存所必需的所有營養。培養大腸桿菌細胞的合適培養基是例如Luria Broth(LB)和/或Terrific Broth(TB)。培養真核細胞的合適培養基是RPMI1640、MEM、DMEM，它們均可以根據培養的特定細胞系的需要補充血清和/或生長因子。昆蟲培養的合適培養基是根據需要補充了yeastolate、水解乳清蛋白和/或胎牛血清的Grace培養基。
一般地，將可用於僅選擇性生長轉化細胞的抗生素或其它化合物做為補充物添加至所述培養基。由轉化宿主細胞的質粒上的可選擇標記元件確定擬使用的化合物。例如，在可選擇標記元件是卡那黴素抗性的情況下，則添加至培養基中的化合物是卡那黴素。
使用本領域已知的方法，可以評價宿主細胞中產生的軸突素多肽的量。這種方法包括但不限於蛋白質印跡分析、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、非變性凝膠電泳、HPLC分離、免疫沉澱和/或諸如DNA結合凝膠變動測定(DNA binding gel shift assay)的活性分析。
如果已設計軸突素多肽使其從宿主細胞分泌，則可能在細胞培養基中發現大多數的多肽。以此方法製備的多肽一般不具有氨基末端甲硫氨酸，因為在從細胞分泌時將其除去。然而，如果軸突素多肽未從宿主細胞分泌，則其將存在於細胞質(真核細胞、革蘭氏陽性細菌和昆蟲宿主細胞)或周質(革蘭氏陰性細菌宿主細胞)中，並具有氨基末端甲硫氨酸。
對於胞內軸突素蛋白，一般首先以機械或滲透壓方式破碎宿主細胞，將細胞質內含物釋放入緩衝溶液。然後可以從該溶液分離軸突素多肽。
使用各種技術可以完成從溶液純化軸突素多肽。如果所述多肽已被合成，使得其具有諸如六聚組氨酸的標記(軸突素/六聚組氨酸)或者其羧基或者氨基末端具有其它小肽，則通過將溶液通過親和柱一個步驟就可以基本將其純化，其中該親和柱基質對該標記或直接對該多肽具有高親和性(即，特異性識別軸突素的單克隆抗體)。例如，多聚組氨酸以極高的親和性和特異性與鎳結合，因此可以使用鎳親和柱(例如Qiagen鎳柱)純化軸突素/多聚組氨酸。(參見例如，Ausubel等編輯，分子生物學現行方法，10.11.8節，John Wiley Sons,NewYork)。
當所述軸突素多肽沒有標記並且沒有可用的抗體的情況下，可以使用其它眾所周知的純化程序。這種程序包括但不限於離子交換層析、分子篩層析、HPLC、非變性凝膠電泳與凝膠洗脫聯合、製備性等電聚焦(「Isoprime」儀器/技術，Hoefer Scientific)。在某些情況下，可以聯合二種或多種這種技術以提高純度。優選的純化方法包括多聚組氨酸標記和離子交換層析與製備性等電聚焦聯合。
如果預期主要在細菌的周質空間或真核細胞的細胞質中發現軸突素多肽，則使用任何本領域技術人員已知的標準方法，可以從宿主細胞提取周質或細胞質的內含物，包括包含體(例如，革蘭氏陰性細菌)，如果被加工的多肽已形成這種複合物。例如，通過弗氏壓碎器、勻漿和/或超聲處理可以裂解宿主細胞，釋放周質的內容物。然後可以將勻漿液離心。
如果軸突素多肽在周質中形成了包含體，包含體經常與內和/或外細胞膜結合，因此主要存在於離心後的沉澱物中。然後可以用諸如胍或尿素的離液劑處理沉澱材料，以釋放、打碎和溶解包含體。然後使用凝膠電泳、免疫沉澱等等可以分析溶解形式的軸突素多肽。如果需要分離軸突素多肽，使用諸如以下描述的和Marston等(Meth.Enz.,182:264-275)中描述的方法可以完成分離。
如果軸突素多肽包含體未在宿主細胞的周質中形成至顯著程度，則軸突素多肽主要存在於細胞勻漿液離心後的上清液中，使用諸如以下描述的方法可以從上清液分離軸突素多肽。
在那些最好部分或完全分離軸突素多肽的情況下，使用本領域技術人員眾所周知的方法可以完成純化。這種方法包括但不限於，通過電泳分離並接著進行電洗脫、各種類型的層析(免疫親和、分子篩和/或離子交換)、和/或高壓液相層析。在一些情況下，可能最好使用超過一種的這種方法以進行完全純化。
除使用重組DNA技術製備和純化軸突素多肽之外，可以使用本領域已知的方法，通過化學合成方法(諸如固相肽合成)製備軸突素多肽及其片段和/或衍生物，所述方法例如由Merrifield等，(J.Am.Chem.Soc.,85:2149)、Houghten等(Proc.Natl.AcadSci.USA,82:5132)和Stewart和Young(固相肽合成，Pierce Chem Co,Rockford,IL)描述的方法。可以合成在氨基末端具有或不具有甲硫氨酸的這種多肽。使用這些參考文獻中描述的方法可以氧化化學合成的軸突素多肽或片段以形成二硫橋。所述軸突素多肽或片段在治療和免疫過程中可以做為天然的、純化軸突素多肽的生物學活性或免疫學替代物。
其中軸突素多肽連接至聚合物(「軸突素-聚合物」)的化學修飾軸突素組合物(即，「衍生物)屬於本發明的範圍。選擇的聚合物一般是水溶性的，使得連接它的蛋白質在諸如生理環境的水性環境中不會沉澱。一般修飾選擇的聚合物，使其具有單個反應基團，例如用於醯化作用的活性酯或用於烷基化的醛，使得可以按照本發明的方法控制聚合度。優選的反應性醛是聚乙二醇丙醛，它為水溶性，或其單C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(參見美國專利5,252,714)。該聚合物可以分枝或不分枝。包含於軸突素-聚合物範圍內的是聚合物的混合物。優選的，對於最終產物製劑的治療用途，所述聚合物是藥學可接受的。水溶性聚合物或其混合物可以選自例如聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纖維素、或其它基於碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇。對於醯化反應，選擇的聚合物應具有單個反應性酯基。對於還原性烷基化，選擇的聚合物應具有單個反應性醛基。聚合物可以是任何分子量，可以分枝或不分枝。
通過本領域已知的任何聚乙二醇化反應進行軸突素的聚乙二醇化，所述反應例如在以下文獻中描述Focus on Growth Factors 3:4-10(1992)；EP0154316；和EP0401384。優選的，如下述通過醯化反應或者烷基化反應，使用反應性聚乙二醇分子(或類似的反應性水溶性聚合物)進行聚乙二醇化。
通過醯化作用的聚乙二醇化一般涉及將聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物與軸突素蛋白反應。可以使用任何已知的或後來發現的反應性PEG分子進行軸突素的聚乙二醇化。優選的活化PEG酯是酯化為N-羥基琥珀醯亞胺(「NHS」)的PEG。本文使用的「醯化作用」設想包括但不限於以下類型的軸突素與諸如PEG的水溶性聚合物之間的連接醯胺、氨基甲酸酯、尿烷等等，如Bioconjugate Chem.5:133-140(1994)中所述。可以從聚乙二醇化領域已知的那些或後續發展的那些條件選擇反應條件，只要避免使欲修飾的軸突素種類失活的諸如溫度、溶劑和pH的條件。
通過醯化作用的聚乙二醇化通常導致多聚乙二醇化的軸突素產物，其中賴氨酸的ε-氨基通過醯基連接基團聚乙二醇化。優選的，連接鍵為醯胺。此外，產生的產物最好至少約95％單、雙或三聚乙二醇化。但是，根據使用的特定反應條件，通常將形成更高程度聚乙二醇化的某些種類(多至軸突素的最大數量的賴氨酸ε-氨基加上軸突素氨基末端的一個α-氨基)。如果需要，通過標準純化技術，可以從所述混合物特別是未反應種類中分離更加純化的聚乙二醇化的種類，所述技術其中包括透析、鹽析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析和電泳。
通過烷基化的聚乙二醇化通常涉及在存在還原劑時，將PEG的末端醛衍生物與諸如軸突素的蛋白質反應。不管聚乙二醇化的程度如何，PEG基團最好通過CH2-NH-基團連接至所述蛋白。具體關於-CH2-基團，這種類型的鍵本文稱為「烷基」鍵。
通過還原性烷基化衍生產生單聚乙二醇化產物，利用了軸突素中可用於衍生的不同類型伯氨基(賴氨酸對N-末端)的差異反應性。一般的，在使得可以利用所述蛋白的賴氨酸殘基的ε-氨基與N末端殘基的α-氨基之間的pKa差異的pH下進行反應。通過這種選擇性衍生，控制具有諸如醛的反應性基團的水溶性聚合物連接至蛋白質與該聚合物的綴合主要發生在蛋白的N-末端，而不顯著地修飾諸如賴氨酸側鏈氨基的其它反應性基團。本發明提供基本上均質的軸突素-單聚合物蛋白綴合物分子製劑(意味著一個聚合物分子基本上僅(即，至少95％)在軸突素蛋白的單一位點連接至軸突素蛋白)。更具體地說，如果使用聚乙二醇，則本發明亦提供缺乏可能的抗原連接基團並具有直接偶聯至軸突素蛋白的聚乙二醇分子的聚乙二醇化軸突素蛋白。
特別優選用於本文的水溶性聚合物是聚乙二醇，縮寫為PEG。本文使用的聚乙二醇指包括已用於衍生其它蛋白的任何形式的PEG，諸如單-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
總之，可以在用於將生物學活性物質與活化聚合物分子反應的任何適當條件下進行化學衍生。製備聚乙二醇化軸突素的方法一般包括以下步驟(a)在軸突素變為連接至一個或多個PEG基團的條件下，將軸突素多肽與聚乙二醇(諸如PEG的反應性酯或醛衍生物)反應，和(b)得到反應產物。總之，醯化反應的最佳反應條件將基於已知參數和所需結果確定。例如，PEG∶蛋白的比例越大，多聚乙二醇化產物的百分比越高。
產生基本上均質的單-聚合物/軸突素蛋白綴合分子群的還原性烷基化一般包括以下步驟(a)將軸突素蛋白與反應性PEG分子在還原性烷基化條件下反應，反應pH適於允許選擇性修飾所述軸突素蛋白氨基末端的α-氨基；和(b)得到反應產物。
對於基本上均質的單-聚合物/軸突素蛋白綴合分子群，還原性烷基化反應條件是那些允許選擇性連接水溶性聚合物部分至軸突素N-末端的條件。這種反應條件通常提供了賴氨酸氨基和N末端的α-氨基的pKa差異(pKa是50％的氨基被質子化、50％的氨基未被質子化時的pH)。pH亦影響聚合物與欲使用的蛋白質的比值。一般而言，如果pH較低，則需要聚合物更大地超出蛋白質(即，N-末端α-氨基的反應性越低，需要越多的聚合物以達到最佳條件)。如果pH較高，則聚合物∶蛋白質的比值不需要這樣大(即，可利用的反應基團越多，需要的聚合物分子越少)。對於本發明的目的，pH的範圍一般為3-9，最好為3-6。
另一個重要的考慮是聚合物的分子量。一般地，聚合物的分子量越大，連接至蛋白的聚合物分子數量越少。類似地，當優化這些參數時，應考慮聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或者分枝越多)，聚合物∶蛋白的比值越高。一般地，對於本文考慮的聚乙二醇化反應，優選的平均分子量是約2kDa至約100kDa(術語「約」表明±1kDa)。優選的平均分子量是約5kDa至約50kDa，特別優選的是約12kDa至約25kDa。水溶性聚合物與軸突素蛋白的比例範圍一般為1∶1至100∶1，優選為(對於多聚乙二醇化)1∶1至20∶1和(對於單聚乙二醇化)1∶1至5∶1。
使用上述表明的條件，還原性烷基化將提供所述聚合物選擇性連接至在氨基末端具有α-氨基的任何軸突素蛋白，並提供單聚合物/軸突素蛋白綴合物的基本均質製劑。術語「單聚合物/軸突素蛋白綴合物」在本文用於指連接至軸突素蛋白分子的單個聚合物分子的組合物。所述單聚合物/軸突素蛋白綴合物最好在N-末端而不是在賴氨酸氨基側鏈基團上具有一個聚合物分子。所述製劑優選的是超過90％的單聚合物/軸突素蛋白綴合物，更優選的是超過95％的單聚合物軸突素蛋白綴合物，剩餘的可觀察到的分子都未反應(即，缺乏聚合物部分的蛋白)。以下的實施例提供了至少約90％單聚合物/蛋白綴合物和約10％未反應蛋白的製劑。所述單聚合物/蛋白綴合物具有生物學活性。
對於本發明的還原性烷基化，還原劑在水溶液中應穩定，且優選能夠僅還原在還原性烷基化的初始過程中形成的席夫鹼。優選的還原劑可以選自硼氫化鈉、氰基硼氫鈉、二甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷和吡咯甲硼烷。特別優選的還原劑是氰基硼氫鈉。
其它反應參數諸如溶劑、反應時間、溫度等和產物純化的手段，可以根據已發表的有關用水溶性聚合物衍生蛋白質的信息確定。
可以通過醯化和/或烷基化方法如上述製備聚合物-軸突素蛋白綴合物分子的混合物，可以選擇包括在所述混合物中的單聚合物/蛋白綴合物的比例。因此，如果需要，可以製備連接了各種數量的聚合物分子(即，雙、三、四等)的各種蛋白的混合物，並與使用本發明方法製備的單聚合物/軸突素蛋白綴合物材料混合。
一般地，通過給予本發明的聚合物/軸突素減輕或調節的疾病，包括那些本文一般對軸突素分子所描述的疾病。但是，與非衍生分子相比，本文公開的聚合物/軸突素分子可以具有額外的活性、增強或減弱的活性、或其它特徵。
自身不編碼在活性測定有活性的多肽的軸突素核酸分子、片段和/或衍生物，可以用做診斷測定中的雜交探針，以或者定性或者定量測試哺乳動物組織或體液樣本中軸突素DNA或RNA的存在。
自身在活性測定無活性的軸突素多肽片段和/或衍生物可以用做體外或體內軸突素受體的調節劑(例如，抑制劑或刺激劑)，或用於製備軸突素多肽的抗體。
軸突素多肽和其片段無論是否化學修飾，均可以單獨使用或與其它藥用組合物聯合使用，用於治療神經系統疾病，所述其它藥用組合物例如為神經營養因子、細胞因子、幹擾素、白介素、生長因子、抗生素、抗炎藥、神經遞質受體激動劑或拮抗劑和/或抗體。
可以使用軸突素多肽和/或其片段，製備通過標準方法產生的抗體。因此，與軸突素多肽反應的抗體以及這種抗體的反應性片段也屬於本發明的考慮範圍。所述抗體可以是多克隆、單克隆、重組的、嵌合的、單鏈的和/或雙特異性的。一般地，抗體或其片段將是「人源化」的，即製備使得在給予患者時防止或最大程度地降低對該抗體的免疫反應。所述抗體片段可以是與本發明的軸突素有反應性的任何片段，例如Fab、Fab』等。本發明亦提供雜交瘤，其製備方法是將軸突素或其片段做為抗原提呈給選擇的哺乳動物，接著通過已知技術將該動物的細胞(例如，脾細胞)與某種癌細胞融合產生無限增殖細胞系。本發明亦包含用於產生這種細胞系和針對本發明的人軸突素多肽的全部或部分的抗體的方法。
所述抗體可以用於治療，例如抑制軸突素與其受體結合。所述抗體還可以用於體內和體外診斷目的，諸如以標記形式檢測體液中軸突素的存在。治療組合物和給予治療各種神經系統疾病的治療組合物屬於本發明的範圍。這種組合物可以包含與藥學可接受的載體混合的治療有效量的軸突素多肽或其片段(它們都可以化學修飾)。所述載體物質可以是注射用水，優選補充了給予哺乳動物的溶液中常見的其它物質。一般地，軸突素治療化合物將以包含純化的蛋白(可以化學修飾)與一種或多種生理可接受載體、賦形劑或稀釋劑聯用的組合物形式給予。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是典型的適當載體。優選地，使用適當的賦形劑(例如，蔗糖)將該產物做為凍幹劑配製。根據需要，可以包括其它的標準載體、稀釋劑和賦形劑。其它典型的組合物包含約pH7.0-8.5的Tris緩衝液、或約pH4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液，它們可以再包括山梨醇或其適當的替代物。
所述軸突素組合物可以系統地腸胃外給予。或者所述組合物可以靜脈內或皮下給予。當系統給予時，用於本發明的治療組合物可以是無熱原、腸胃外可接受的水溶液的形式。與pH、等滲性、穩定性等等有關的這種藥學可接受蛋白溶液的製備屬於本領域技術範圍。
用於實踐本發明的軸突素組合物治療製劑可以製備成為凍幹餅或水溶液的形式以儲存，方法為將具有目標純度的選擇的組合物與可選的生理可接受載體、賦形劑或穩定劑(Remingtons’sPharmaceutical Sciences,第18版，A.R.Gennaro編輯，MackPublishing Company)混合。可接受的載體、賦形劑或穩定劑對接受者無毒性，並優選的在使用的劑量和濃度下為惰性，包括諸如磷酸、檸檬酸或其它有機酸的緩衝液；諸如抗壞血酸的抗氧化劑；低分子量多肽；諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白的蛋白質；諸如聚乙烯吡咯烷酮的親水性聚合物；諸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸或賴氨酸的胺基酸；包括葡萄糖、甘露糖或糊精的單糖、雙糖或其它碳水化合物；諸如EDTA的螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇的糖醇；諸如鈉的形成鹽的平衡離子；和/或諸如吐溫、Pluronics或聚乙二醇(PEG)的非離子表面活性劑。
用於體內給予的軸突素組合物必須是無菌的。這可以通過除菌過濾膜過濾容易地完成。如果軸突素組合物是凍幹的，使用這些方法的滅菌可以在凍幹和重建之前或之後進行。用於腸胃外給予的組合物一般將以凍幹形式或在溶液中儲存。
通常將治療組合物置於一個具有無菌入口的容器中，例如靜脈內溶液袋或具有皮下注射針頭可穿透的瓶塞的西林瓶。
給予所述組合物的途徑與已知方法一致，即口服、通過靜脈內、腹膜內、大腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內或病灶內途徑注射或輸注，或通過可以可選地涉及使用導管的緩釋系統或植入裝置給予。如果需要，所述組合物可以通過輸注、大劑量注射或通過植入裝置連續給予。二者擇一地或者另外地，軸突素可以通過將其上已吸附了軸突素多肽的海綿或其它適當材料植入受影響區域局部給予。
當使用植入裝置時，可以將該裝置植入任何合適的組織或器官，例如植入腦室或植入大腦實質，軸突素可以直接通過該裝置藉助大劑量給予或連續給予或通過導管使用連續輸注傳遞。
軸突素多肽可以以緩釋製劑給予。緩釋製劑的適當的實例包括成型粒子形式的半透聚合物基質(例如薄膜)或微膠囊。緩釋基質包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(U.S.3,773,919,EP58,481)、L-穀氨酸和γ乙基-L-穀氨酸的共聚物(Sidman等，Biopolymers,22:547-556)、聚(異丁烯酸2-羥乙酯)(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277和Langer,Chem.Tech.,12:98-105)、乙烯乙酸乙酯(Langer等，見上述)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。緩釋組合物亦可以包括脂質體，它可以通過本領域已知的幾種方法製備(例如，DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949)。
在一些情況下，可能希望以活體外方式使用軸突素組合物，即，治療從患者取出的細胞或組織，然後將其植回患者。
在其它情況下，可以通過將某些已遺傳工程化(使用上述方法)以表達和分泌軸突素多肽的細胞植入患者而傳遞軸突素。這種細胞可以是人類細胞，可以源自患者自己的組織或源自患者人類或者非人類的另一來源。可選的，所述細胞可以永生化。所述細胞可以植入大腦、腎上腺或植入其它身體組織或器官。
在某些情況下，可能希望使用基因治療方法以將軸突素給予患有某些神經疾病的患者。在這些情況下，編碼軸突素或其片段或變異體的基因組DNA、cDNA和/或合成DNA可以可操作地與在將要注射所述組合物的組織中活躍的組成型或誘導型啟動子連接。此軸突素DNA構建物或者已插入載體或者沒有載體，都可以直接注射入大腦或其它或者神經元或者非神經元的組織。
或者，可以將軸突素DNA構建物直接注射入肌肉組織，在所述肌肉組織中該構建物被攝入細胞並在所述細胞中表達，只要所述軸突素DNA可操作地連接至在肌肉組織中活躍的啟動子，例如細胞肥大病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子或肌肉肌酸激酶啟動子。一般地，所述DNA構建物可以包括(除軸突素DNA和啟動子之外)從載體得到的載體序列，所述載體諸如腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體和/或皰疹病毒載體。所述載體/DNA構建物可以與藥學可接受載體混合用於注射。
治療所使用的軸突素組合物的有效量取決於例如治療目標，例如使用軸突素針對的適應症、給藥途徑和病人的病症。因此，治療者有必要根據需要調整劑量和給藥途徑，以得到最佳治療效果。典型的日劑量範圍為約0.1μg/kg至100mg/kg或更多，取決於上述因素。一般地，臨床醫師將給予軸突素組合物直至達到取得目標效果的劑量。所述軸突素組合物可以以單劑量給予，或在一段時間內以二個或多個劑量(其可以含有或不含有等量的軸突素)給予，或做為通過植入裝置或導管的連續輸注。
隨著進一步的研究，有關在各種患者的各種疾病治療的適當劑量水平的信息會出現，本領域一般技術人員在考慮治療史、治療的疾病類型、接受治療者的年齡和總體健康情況的情況下，可以確定正確的劑量。一般地，劑量為0.01μg/kg體重(僅計算該蛋白質的質量，不考慮化學修飾)和300μg/kg(計算根據同前)之間。
可以利用軸突素蛋白、其片段和/或衍生物，治療伴隨有軸突素表達型式改變的、或可以得益於暴露給軸突素或抗軸突素抗體的中樞神經或外周神經系統疾病或障礙。
可以使用軸突素蛋白和/或其片段或衍生物治療病人，所述病人的中樞神經系統、自主神經系統或外周神經系統的各種細胞已經退化和/或已被疾病損傷，所述疾病為先天性疾病、創傷、機械損傷、手術、中風、局部缺血、感染、代謝病、營養缺陷、惡性腫瘤和/或毒性藥劑。更具體地說，可以對這種適應症調節(上調或下調)軸突素蛋白水平，所述適應症是早老性痴呆、帕金森病、肌萎縮性側索硬化、Charcot-Marie-Tooth綜合症、亨廷頓舞蹈病、由糖尿病或其它代謝紊亂誘導的外周神經病和/或視網膜神經營養不良或退化，諸如色素性視網膜炎、藥物誘導的視網膜病、固定形式的夜盲、固定形式的夜盲、進行性錐體杆狀退化等等。
在本發明的其它實施方案中，軸突素蛋白或肽或其片段或衍生物可以與組織的外科植入聯用，用於需要組織植入的疾病治療。DNA保藏具有已插入編碼全長人軸突素(胺基酸1-142)的cDNA的質粒pCRScript SK+的大腸桿菌細胞，已於1996年8月9日保藏於ATCC(美國典型培養物保藏中心，12301Parklawn Drive,Rockville,MD,USA)，保藏號是98134。
以下實施例僅用於說明本發明，在任何情況下都不限制本發明的範圍。
實施例實施例Ⅰ軸突素cDNA的克隆用約8mg/kg體重的紅藻氨酸鹽(在磷酸鹽水緩衝液[PBS]中製備5mg/ml紅藻氨酸鹽儲存溶液)腹膜內注射約8-10周齡的雄性大鼠(Wistar)(體重為約230-300克)。約6小時後，殺死動物，取出大腦齒狀回(DG)區並儲存於液氮中。合併約100隻動物的DG組織，通過硫氰酸鈲法(「GTC」；Chomczynski等，Anal.Biochem.,162:156)的修改方法製備該組織的RNA。在GTC中裂解該組織後，接著進行2次酚抽提和一次氯仿抽提，沉澱RNA並在水中再懸浮。使用寡聚-(dT)-纖維素柱(Clontech,Palo Alto,CA)選擇多聚(A)+RNA。本文將該RNA(和對應的cDNA)稱為「激活DG」RNA或cDNA。
為進行減法分析、文庫構建和cDNA探針檢測(均在以下描述)，用DNA酶(無RNA酶；Promega,Madison,WI)處理所述RNA以消除任何汙染性的基因組DNA。
使用與上述相同的方法，從同樣周齡的未用紅藻氨酸鹽處理的雄性大鼠的正常齒狀回組織和全腦組織製備多聚(A)+RNA。
在二個50μl反應中使用上述製備的激活-DG多聚(A)+RNA合成第一鏈cDNA。每個反應含有在約30μl逆轉錄酶緩衝液(Gubler等，(Gene,25:263-269)中的約5μg RNA、約1μl RNA酶(4u/ul；Promega,Madison,WI)、約1ug寡聚-(dT)-XbaⅠ引物連接物(Promega,Madison,WI)、約30 uCi32P dCTP(約3,000Ci/mmol,Amersham,Arlington Heights,IL)和約400u MLV克隆逆轉錄酶(BRL；GrandIsland,NY)。在約37℃約60分鐘後，通過加入約10ul NaOH(1N)、約2ul EDTA(0.5M)和水至約100ul，將所述RNA在約68℃水解約20分鐘。然後將所述RNA置於冰上，用約10ul 1M HCL中和。加入約5ug轉移RNA，將此化合物通過Sephadex G-50旋轉層析柱離心。通過比較柱洗脫液中的放射性與原先上柱的樣品中的放射性可以確定cDNA的回收率。合併這二個cDNA樣品，與乙酸銨進行乙醇沉澱，在水中再懸浮至約10ng/ul。
將該cDNA與預先使用二次光生物素化(Clontech,Palo Alto,CA；參見Sive等，Nucleic Acids Res.,16:10937)而與生物素偶聯的等體積大鼠全腦多聚(A)+RNA(1ug/ul)混合，然後與乙酸銨進行乙醇沉澱。在甲醯胺緩衝液(40％甲醯胺，50mM Hepes pH7.6,0.5M NaCl,2mM EDTA)中再懸浮至約100ng/ul cDNA和約10ug/ul RNA後，將所述溶液置於玻璃毛細管中(每個25μl)，將此管密封。將毛細管在68℃溫育約3分鐘，然後於52℃溫育2天。打開毛細管，將其內容物加入約180μl緩衝液(Hepes pH7.6 50mM,NaCl0.5M,EDTA 2mM)中。每μl生物素化RNA加入約1μg鏈黴抗生物素(Vector Labs,Burlingame,CA)，將該化合物於室溫溫育約10分鐘。溫育後，進行二次酚/氯仿抽提(1體積1體積)和一次氯仿抽提。回收的水相一般含有10-20％的用於減法克隆(substraction cloning)的總cDNA。將此單鏈cDNA乙醇沉澱，並再懸浮於約16μl水中。
將約1ul dATP(10mM)和約4μl 5 X TdT緩衝液(BoehringerManheim)加入該cDNA。在100℃約3分鐘和在冰上冷卻後，加入末端脫氧核苷酸轉移酶(17μl,Boehringer,Manheim，德國)，將該混合物於約37℃溫育約2小時。加入2微克的寡聚-(dT)-XbaⅠ(Promega,Madison WI)引物連接物，將該混合物於60℃溫育約5分鐘。在含有90mM Hepes緩衝液pH6.6、MgCl 10mM、每種濃度約為0.5mM的所有4種脫氧核苷三磷酸、約10mM DTT和10U Klenow(BoehringerManheim測序級)的約50ul總體積內進行第二鏈合成。於室溫約6小時後，加入另一等分酶，將此混合物再溫育3小時。用酚和氯仿抽提終止反應，然後加入5ug轉移RNA，此cDNA與乙酸銨一起乙醇沉澱。將雙鏈cDNA再懸浮於約9.6μl水中，用10U限制性酶XbaⅠ(Boehringer)於37℃消化5小時，然後將它上樣至薄1％瓊脂糖凝膠並進行電泳。切出含有大於約550鹼基對(「bp」)的cDNA分子的膠條，用QIAEX(QiagenCorp.,Chatsworth,CA)提取cDNA，通過放射性計數確定回收率(約10％的總扣除cDNA)。將該cDNA連接入λ-ZAP(Stratagene,La Jolla,CA)載體臂，該載體臂預先用XbaⅠ消化，並用牛小腸磷酸酶(Boehringer Manheim)處理。使用約1ul噬菌體臂和各種濃度的cDNA(3-20ng)進行連接。包裝連接物(Gigapack,Stratagene,LaJolla,CA)，測定噬菌體滴度。將文庫以低密度鋪平板，單獨挑選單個噬菌斑，按照製造商程序從噬菌體切出載體pBluescript中的質粒(參見Short等，Nucleic Acids Res.16:7583-7600)。使用標準小量製備程序，從用pBluescript質粒預先轉化的大腸桿菌細胞製備質粒DNA(參見Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY)。將從小量製備得到的約2-4微克質粒DNA用XbaⅠ消化，使用標準程序將其DNA印跡至Hybond N+濾膜(Amersham,Arlington Heights,IL)。
為製備篩選含有所述cDNA的濾膜的探針，將每種約100ng的單鏈cDNA(對照和DG激活)放射標記，方法是將其加入含有約12ul隨機引物(Boehringer；約90A260U/ml)、約2MCi32P-dCTP(3,000Ci/mmol；Amersham,Arlington Heights,IL)、各約0.6mM的dATP、dTTP和dGTP和在800ul用於第二鏈cDNA合成的緩衝液(見上述)的40ul Klenow(Boehringer；約2U/ul)的混合物中進行標記。於室溫以2400μl等分過夜進行溫育。該反應產生約1.2×109cpm的探針。
在雜交緩衝液(見下述)中於約42℃預雜交至少6小時後，將所述cDNA印跡與探針雜交。一個印跡與激活DG探針雜交，一個複製印跡與對照(正常DG cDNA)探針雜交。在溶液中進行雜交，該溶液含有50％甲醯胺、5X SSCPE(Sambrook等，1989)、10X Denhardt’s、0.5％SDS、0.5mg/ml鯡魚精載體DNA和濃度為約1×108cpm/ml的所述cDNA探針。將所述印跡在振蕩的42℃水浴中溫育約48小時。溫育後，將印跡用0.1X SSC、0.2％SDS於68℃每次1小時清洗3次。對膠片曝光後，選擇那些與激活DG探針雜交強於與對照探針雜交的cDNA克隆，用如上述製備的第二套激活DG和對照探針再篩選。將在這二次獨立的篩選中與激活DG探針雜交強於與對照探針雜交的那些克隆，使用標準測序方法從兩端測序(從每端約200-300bp)，通過FASTA分析(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2444-2448)，在GenBank和其它公共DNA資料庫中檢索這些序列。根據序列比較，幾個克隆看來是新的。將與本發明有關的克隆命名為#784,#1441,#2090；#2268；#2282；#7547；#8032；#6734；和#7761。
為得到全長cDNA克隆，使用與上述類似的方法從激活DG RNA構建第二個cDNA文庫。使用激活的DG多聚A RNA和寡聚-(dT)-XbaⅠ引物(Promega)如上述製備文庫，但是只選擇大於1.5kb的cDNA做為插入物。將該文庫以高密度鋪平板並轉移至尼龍濾膜(SS,Keene,NH)。使用Qiagen純化藥盒(Qiagen,Chatsworth,CA)、按照製造商建議，從克隆#1441的約0.5kbp XbaⅠ入物通過分離該XbaⅠ限制片段產生探針。然後使用標準方法用α-32P-dCTP(RediVue,Amersham,Arlington Heights,IL)放射標記該片段。使用上述條件將所述濾膜雜交。從此次篩選鑑別了幾個陽性克隆。選擇了二個陽性克隆144-10和1441-13，因為它們具有最長的插入物(分別為約1.6kbp和1.4kbp)。使用雙脫氧鏈終止法，用螢光雙脫氧核苷酸(AppliedBiosystems Inc.,Foster City,CA)對這二個克隆在二條鏈上都進行測序。使用Genetics Computer Group軟體(威斯康星大學，生物技術中心，Madison,WI)分析核苷酸序列。
發現克隆#1441-10具有約1604bp的插入物，具有編碼142個胺基酸的蛋白的長可讀框(ORF)。在圖1(SEQ ID NO:1)中陳述了從大鼠組織得到的該克隆的全長cDNA，命名為軸突素。在圖3(SEQ ID NO:3)中陳述了大鼠軸突素的胺基酸序列。
使用聚合酶鏈式反應(Pwo DNA聚合酶和緩衝液；BoehringerManheim)，在如下條件下複製人軸突素cDNA於94℃變性5分鐘，接著進行30個循環於94℃30秒，於56℃30秒和於72℃30秒，使用以下寡聚核苷酸CTAGTCTAGAACCATGGGACTTAAG(SEQ ID NO:5)GGTATAGTCGACCCGTGCTCAGAA(SEQ ID NO:6)用於該PCR反應的模板是使用Marathon cDNA擴增藥盒(Clontech,Palo Alto,CA)按照製造商建議、從約2ug人皮質mRNA(Clontech,Palo Alto,CA)產生的雙鏈cDNA。將預期大小(約435bp)的擴增產物亞克隆入pCR-Scirpt Amp SK(+)克隆載體(Stratagen,La Jolla,CA)，使用標準測序方法對二條鏈都測序。人軸突素cDNA序列示於圖2(SEQ ID NO:2)。基於所述cDNA序列翻譯的人軸突素推測胺基酸序列陳述於圖4(SEQ ID NO:4)。
大鼠和人軸突素蛋白的分析揭示了約24個胺基酸的氨基末端疏水性推定信號肽。C-末端的27個胺基酸尾富含疏水性殘基，並具有一個一般在GPI(糖基磷脂醯肌醇)膜錨定蛋白發現的共有酶切信號。成熟的膜結合蛋白有91個胺基酸(約12千道爾頓)和6個半胱氨酸殘基。但是，通過在公共DNA和蛋白資料庫(SWISS-PROT、PROSITE、GENBANK和PIR)中序列檢索評價，該胺基酸序列不具有與任何已知蛋白的一般序列或甚至基序同源性，提示它代表新的分子類別或家族。實施例Ⅱ軸突素蛋白和抗體的製備將編碼軸突素胺基酸30-113的大鼠軸突素cDNA(「軸突素30-113」)亞克隆入熱誘導細菌表達載體pCFM1656(ATCC保藏號為69576)，以擴增和表達軸突素30-113。通過在每克細菌3ml溶菌緩衝液(50mM Tris,pH8.0、1mM EDTA和100mM NaCl，含有10mg溶菌酶和10mg脫氧膽酸鈉)中裂解，分離含有軸突素30-113的包含體。用400μg DNA酶Ⅰ處理溶菌的細菌30分鐘至1小時，然後於約4℃於約12000xg離心15分鐘。然後在含有0.5％NP-40的9倍體積裂解緩衝液中清洗沉澱的包含體2-4次。通過SDS-PAGE評價包含體中軸突素30-113的純度。將純化的包含體於室溫溶解(1∶20)於8M尿素、50mMTris pH8.0、50mM NaCl和5mM二硫蘇糖醇(DTT)中1-2小時。於室溫於約14kg離心10分鐘除去不溶物質。使用以下時間過程和尿素濃度將尿素對1升上述緩衝液緩慢透析(所有的透析均在4℃進行)8M至6M尿素，1小時；6M至4M，過夜；4M至2M,1小時；2M至1M,1小時；1M至0.5M，1小時；0.5M至0.25M,1小時，0.25M至0M,1小時。在非還原性SDS-PAGE凝膠上分析重摺疊的軸突素30-113。
為製備軸突素抗體，通過標準方法合成包含成熟軸突素蛋白內部區的軸突素片段DCQEGAKDMWDKLRK SEQ ID NO:7)並用於免疫兔子(由Berkeley Antibody Company,Berkeley,CA準備)，導致產生多克隆抗血清，命名為AS419。亦製備抗細菌表達的如上述從溶解的包含體純化的軸突素30-113片段的第二個多克隆兔抗血清(命名為AMG20)(Cocalico Biologicals Inc.,Reamstown,PA)。對在CHO細胞中製備的重組軸突素蛋白質印跡分析中特異性反應的抗血清進行親和純化，即使用含有適當固定化軸突素肽的瓊脂糖珠(Pierce Chemicals,Rockford,IL)，接著通過A/G蛋白柱(PierceChemicals)濃縮抗體製劑。
通過用含有或者大鼠或者人軸突素cDNA的質粒pGREG轉染中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞；ATCC保藏號為CRL-9096)，在該細胞中表達跨越胺基酸1-115的大鼠和人重組軸突素。從哺乳動物表達載體pDSRa2(描述於PCT專利申請號WO90/14363，公布於1990年11月29日)製備pGREG。
pGREG從5』至3』含有編碼XhoⅠ限制性酶位點、凝血酶酶切位點(參見SEQ ID NO:8)、由Novagen(Madison,WI)單克隆抗體識別的單純皰疹病毒表位(參見SEQ ID NO:9)、用於金屬螯合層析的六聚組氨酸表位、終止密碼予和SalⅠ限制性酶位點的序列。
LVPRGS(SEQ ID NO:8)QPELAPEDPEDVE(SEQ ID NO:9)
通過使用四個在軸突素3』末端重疊的寡聚核苷酸和上述5』寡聚核苷酸(SEQ ID NO:5)的交錯PCR，將該HSV/組氨酸標記加入pDSRα2。做為PCR的模板，使用p1441-10。對大鼠軸突素編碼區3』端特異性的起始寡聚核苷酸加入了所述XhoⅠ凝血酶酶切位點。三次連續的PCR反應逐漸地將該標記序列加入大鼠軸突素的C末端。將產生的產物亞克隆入pDSRα2的XbaⅠ和SalⅠ位點。使用含有XbaⅠ和XhoⅠ限制性位點的PCR產物產生另外的標記構建物。
使用編碼胺基酸1-115(並缺失羧基末端GPI信號肽)的人cDNA表達具有凝血酶酶切位點、單純皰疹病毒(HSV)和位於其C末端的六聚組氨酸(HIS)表位的分泌的人軸突素。通過使用標準條件和以下寡聚核苷酸的PCR產生缺失GPI信號肽的人軸突素cDNA(即，編碼胺基酸1-115):
CTAGTCTAGAACCATGGGACTTAAG(SEQ ID NO:10)GGTATACTCGAGCCCGTTGCCGCT(SEQ ID NO:11)將得到的373bp產物亞克隆入pGREG的XbaⅠ和XhoⅠ位點。將產生的載體命名為pDSRαhv15Tag.1。六聚組氨酸標記使得可以容易地在含有鎳(Ni2+)的樹脂(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)上純化軸突素。
如下述準備CHO/軸突素條件培養液。在無血清Dulbecco極限必需培養基(DMEM)中，培養含有穩定表達人標記類型的軸突素1-115(命名為hu15t36)的CHO細胞的滾瓶至約80％匯合(約48小時)。通過於約2500g離心沉澱細胞碎片，收穫所述條件培養液；將上清液儲存於-20℃。通過溫育1ml PBS平衡的Ni2+/NTA樹脂/100ml條件培養液(Ni2+/NTA樹脂供應商Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)，分批純化軸突素。通過用含有遞增量的咪唑(20、40、80和100mM)的清洗緩衝液(20mM磷酸鈉，pH6.0，和500mM NaCl)清洗樹脂，除去非特異性蛋白。用500mM咪唑洗脫特異性結合HSV-組氨酸標記的軸突素。將純化的蛋白(通過銀染SDS-PAGE[BioRad Labortatories,Hercules,CA]測定純度超過95％)濃縮約10倍並滲濾(Millipore Corp.,[Ultrafree15,5K截留分子量]Bedford,MA)到1X PBS中。使用Bio-Rad/Lowry蛋白測定，用牛血清白蛋白做為標準，估計蛋白最終濃度為30-50ng/ml。實施例Ⅲ軸突素的組織表達A．RNA印跡分析為評價軸突素的表達型式，從Clonetch(Palo Alto,CA)購買含有各種大鼠組織包括心臟、大腦、脾臟、肺臟、肝臟、肌肉、腎臟和睪丸的RNA的RNA印跡，用32P標記的cRNA探針探測。如下述從亞克隆入pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)的大鼠軸突素cDNA製備cRNA探針。通過用PvuⅡ和SmaⅠ消化軸突素克隆1441-10，得到軸突素克隆1441-10的約430bp片段。將該片段亞克隆入質粒pBluescriptSK+(Stratagene,La Jolla,CA)，然後將其命名為cpg15subclone#2。為製備反義RNA探針，將所述質粒用BamHⅠ線性化，之後使用T7聚合酶(Promega,Madisom,WI)和32P-UTP進行體外轉錄，使用約1ml異硫氰酸鈲溶菌緩衝液基本如上述分離。
通過監測溴化乙錠染色的大小分離的RNA，評價每個印跡上RNA的量，通過用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的隨機引物標記的cDNA片段與印跡雜交確認。
示於圖5A中的RNA印跡分析鑑別了在大鼠大腦中表達的約1.6千鹼基的單個mRNA條帶；在肺臟組織中觀察到強度較低的一個條帶，其它組織的mRNA幾乎沒有或沒有雜交。
為評價大腦各種區域中軸突素的表達，用PBS中的10mg/ml紅藻氨酸鹽儲存溶液約8mg/kg腹膜內注射成年大鼠。約6小時後，殺死大鼠，解剖出腦組織。每100mg粉碎的組織使用約1ml異硫氰酸鈲裂解緩衝液(Chomczynski等，Anal.Biochem.,162:156)，從大腦的各種區域分離RNA。裂解後，將所述溶液通過矽膠膜柱(RNeasy旋轉柱，Qiagen,Chatsworth,CA)。通過在0.8-1％甲醛瓊脂糖凝膠上分離將RNA進行大小分級分離，並毛細吸印至尼龍膜(Hybond-N,Amersham,Arlington Heights,IL)。用上述32P標記的cRNA探針檢測該RNA印跡。如圖5中可見，大腦齒狀回區的軸突素表達水平最高。B．原位雜交還免疫組織化學在如下述用多聚甲醛固定並用石蠟包埋的大鼠胚胎組織和成年大鼠大腦組織切片上進行原位雜交和免疫組織化學。分離妊娠大鼠的胚胎，於脫水和石蠟包埋之前，在PBS中的新鮮4％多聚甲醛(4％PFA/PBS)於4℃固定過夜。通過用PBS中的4％多聚甲醛穿心灌注麻醉動物準備成年大鼠的大腦。將解剖出的大腦於4℃在PBS中的4％多聚甲醛中固定過夜，脫水並包埋於石蠟中。按照已建立的方法(Simonet,等，J.Biol.Chem.,11:8221-8229)，使用如上述為RNA印跡製備的大鼠軸突素cRNA探針(除了用35S-UTP替換32P-UTP)在這些組織切片上進行原位雜交。將雜交的載玻片對柯達照相乳膠曝光，3-6周後顯影，然後將所述切片用蘇木精復染，使用暗視場光鏡使銀粒顯現。
使用對在哺乳動物細胞中製備的人重組軸突素特異性的各種稀釋度的親和純化的抗血清(AS419或AMG20，如上述)，在脫石蠟PFA固定的組織切片上進行軸突素的免疫組織化學定位。使用VectastainElite ABC染色藥盒(Vector Labs,Burlingame,CA)、按照製造商說明書，用生物素化山羊抗-兔免疫球蛋白和辣根過氧化物酶標記的抗生物素蛋白檢測，結合的軸突素抗體。
原位雜交分析顯示，軸突素mRNA存在於早至胚胎第14天(E14)的發育中的大鼠大腦的神經上皮和分化區域之間的交界處。所述信息亦定位於包括脊神經節和三叉神經節的外周的發育中的神經元結構中。看來表達在發育期間增加，看起來隨著CNS中的各個結構越明確，它就越集中於分化區內。
在成年大腦的大多數結構中都檢測到軸突素mRNA。在皮質的Ⅱ-Ⅳ層、海馬結構、丘腦、松果體韁和腦幹中發現了最豐富的信號。在海馬中，表達集中於錐體和顆粒細胞層的神經元，在齒狀的下託和門區神經元中發現了豐富的水平。在小腦中，低水平的軸突素信使定位於顆粒細胞層，浦肯野細胞有分散點狀標記。
上述使用軸突素抗體AS419或AMG20的大腦組織免疫組織化學染色顯示軸突素集中於神經元細胞體，並且不均勻地沿著大腦無髓區的軸突凸出物分布。不均勻染色導致免疫反應區的顆粒狀外觀，沿著海馬的下腳(subicular)複合體中的神經元凸起特別明顯。軸突素沿著軸突的集中在陽性浦肯野細胞樹的染色中亦有文獻記錄。DG的門區具有分散的強免疫反應性細胞，與軸突素mRNA原位雜交所觀察到的型式一致。浦肯野神經元的不規則染色亦與點狀信息定位一致。實施例Ⅳ軸突素生物化學和表達調節軸突素羧基末端胺基酸序列提示軸突素是膜錨定的可能性。為評價這種可能性，用或者空白質粒(稱為「親代」，不含有軸突素基因)或者用含有編碼人軸突素的基因的質粒轉染約1×106CHO細胞，將該細胞按照已發表的方法(Kodukula等，J.Cell Biol.120:657)，或者用在0.5ml釋放緩衝液(25 mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA,10mM葡萄糖，250mM蔗糖)中製備的約0.4U/ml PI-PLC(磷脂醯肌醇-磷脂酶C；Calbiochem,La Jolla,CA)處理，或者僅用釋放緩衝液(無PI-PLC)處理。溫育後，將細胞離心以沉澱細胞碎片。通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析上清液。電泳後，將凝膠轉印至硝酸纖維素紙上，用軸突素特異性親和純化的抗血清探測。結果示於圖8A。可以看到，發現所有可檢測的軸突素都存在於已用PI-PLC處理的表達軸突素的CHO細胞的上清液中，提示軸突素確實是GPI錨定的。
按照Borchelt等描述的方法(Glycobiol.3:319)，用去汙劑Triton X-114(Calbiochem,San Diego,CA)提取組織以得到天然軸突素，進行內源GPI-錨定軸突素的分析。將約100mg粉碎的組織懸浮於含有蛋白酶抑制劑(0.5mM苯甲醯胺，1mM PMSF和各為1μg/ml的胃酶抑制劑、亮抑蛋白酶肽、抑酶肽)的0.5ml 1X TNE緩衝液(50mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,5mM EDTA)，並於4℃與約0.25倍體積的用1X TNE預先平衡的Triton X-114混合。通過將該混合物於30℃溫育約15分鐘，接著於室溫以約3000g離心5分鐘沉澱大的含有親脂蛋白的去汙劑微團，從溶液提取Triton X-114可溶性蛋白。重複該提取，合併含有去汙劑的可溶性部分。為通過蛋白質印跡分析提取的蛋白，通過將每等分與10倍體積甲醇溫育(於4℃ 10分鐘，接著於14,000g於4℃離心15分鐘)，沉澱20-40μl的去汙劑等分。將沉澱再懸浮於約40ul的SDS-PAGE樣品緩衝液(含有β-巰基乙醇)，在16％SDS-PAGE凝膠(Novex,San Diego,CA)上按大小分級分離。電泳後，使用標準蛋白質印跡程序，將蛋白轉移至硝酸纖維素紙上。使用軸突素特異性親和純化的抗血清(AS419或AMG20，如上述)做為第一抗體、辣根過氧化物酶綴合山羊-抗-兔抗血清做為第二抗體(稀釋約1∶104，得自Southern Biotechnology Associates,Inc.,Birmingham,Alabama)，檢測軸突素。使用過氧化物酶敏感增強化學發光(「ECL」,Amersham,Arlington Heights,IL)，檢測抗體。結果示於圖8B。明顯的是，大腦皮質區和海馬區表達最高水平的軸突素。將如上述用PI-PLC製備的重組CHO細胞的軸突素示於泳道1做為對比。蛋白質印跡的泳道中軸突素遷移的差異，推測是因為連接了一些脂質的軸突素遷移率改變。
為研究軸突素mRNA表達的調節，將重組人BDNF、NT-3、NGF或FGF(約10ng/ml)、KCl(約50mM)或鈣通道阻斷物AMPA或NMDA(約10μM)加入如下述實施例V中製備的7DIV E18大鼠海馬或皮質培養物中。溫育約6小時後，通過RNeasy方法(Qiagen,Chatsworth,CA)從每個培養物分離RNA。將約5μg的該RNA上樣至凝膠，通過電泳分離，然後進行RNA印跡。用跨越編碼區的大鼠軸突素cRNA探針(如上述)檢測該印跡。結果示於圖6A。可以看到，NMDA和AMPA處理導致軸突素mRNA水平增加約5倍，使用去極化濃度的KCl時觀察到類似程度的誘導。
為評價BDNF對體內軸突素表達水平的影響，將BDNF(10mg/ml,1-2μl)或鹽水(對照)心室內注射入出生後4天的大鼠幼仔。給予BDNF或鹽水約6小時後，殺死幼仔，從皮質或海馬大腦組織分離總RNA。如在圖6B中看到的，BDNF主要在海馬中體內誘導軸突素信息，在皮質中程度小。實施例Ⅴ軸突素生物活性檢測通過從胚胎第18天的大鼠胚胎解離解剖的大腦區，製備初生海馬和皮質胚胎大鼠神經元培養物。使用基於木瓜蛋白酶的組織解離藥盒(Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)，進行胚胎神經元的解離和純化。將10-30個胚胎的解剖組織再懸浮於2.5mlEarles平衡鹽溶液(EBSS)中，該溶液含有50單位木瓜蛋白酶、1mML-半胱氨酸、0.5mM EDTA和500單位DNA酶Ⅰ。溫和振蕩，將組織解離10-15分鐘。將解離的細胞於300g離心5分鐘沉澱，再懸浮於2.7mlEBSS、0.3ml卵類粘蛋白抑制劑溶液(10mg/ml卵類粘蛋白蛋白酶抑制劑和10mg/ml牛血清白蛋白)和250單位DNA酶Ⅰ。將該懸浮液加至5ml卵類粘蛋白抑制劑溶液上面，於70g離心6分鐘沉澱。將沉澱的細胞再懸浮於10ml含有神經基礎培養基(Neurobasal medium)(Gibco/BRL,Grand Island,NY)的B27中，並通過一個40μm尼龍網細胞滲濾器(Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)。為進行RNA分析，將解離的神經元鋪平板於用多聚L-鳥氨酸(得自Sigma,St.Louis,MO，使用濃度為150mM硼酸鈉中約0.1mg/ml,pH8.4)和層粘連蛋白(得自Gibco/BRL,Grand Island,NY，使用濃度為PBS中約1μg/ml)預先包被的6孔Falcon組織培養板(Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)中。神經元鋪平板密度為海馬神經元約2×105/cm2、皮質神經元約3×105/cm2。將細胞在補加了1X B-27補充物(Gibco/BRL,GrandIsland,NY)和50mg/ml硫酸慶大黴素(Gibco/BRL,Grand Island,NY)的神經基礎培養基(Gibco/BRL,Grand Island,NY)中生長。培養7天後，每個培養物的神經膠質細胞含量小於5％，神經膠質細胞含量的評價是通過計數由使用對該神經膠質細胞特異性標記特異性的抗體的間接免疫螢光染色鑑別的膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)陽性細胞進行。培養7-8天後如所述處理細胞。
使用如上述製備的海馬和皮質神經元進行軸突突起檢測。將細胞鋪平板於多聚賴氨酸(PBS中20μg/ml)包被的35mm平板，密度為約5×103細胞/cm2，存在或不存在Ni2+純化的軸突素(如上述製備)。培養4天後，在分析之前，通過用非特異性親脂性染料DiI(10uM，用565nm濾光片顯現)於37℃染色約30分鐘對活培養物染色、接著在補加神經基礎培養基的B-27(見上述)中清洗3次，評價軸突突起。
為檢驗軸突素的生物學功能，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生缺失羧基末端27個胺基酸的組氨酸標記類型的軸突素，通過Ni2+親和層析從無血清條件培養基純化至同質性超過90％，同質性通過銀染SDS-聚丙烯醯胺凝膠(見上述)測定。在存在約150ng/ml該重組軸突素的情況下，將E18大鼠胚胎海馬和皮質神經元鋪平板於多聚賴氨酸包被培養皿中。將同樣的體積加入對照中，該對照使用相當的源自用空白表達載體轉染的CHO細胞的條件培養基的Ni2+親和部分。培養4天後，在存在軸突素時鋪平板的神經元顯示比對照培養物更廣泛的軸突發生，如圖9中所示。與對照細胞相比，軸突素處理的細胞具有較長、更加分枝的軸突樹，並且從胞體延伸的軸突數量增加。用親脂性螢光染料DiI非特異性染色的細胞，在胞體和軸突板狀偽足的組織上顯示顯著的區別(圖9)。未處理的對照細胞具有扁平的細胞胞體和寬闊的明顯不集中的、沿著許多軸突的長度或朝著其末端的板狀偽足，而軸突素處理的細胞具有良好分化的細胞胞體和纖細的明確的突起。使用純化的細菌軸突素觀察到類似的生軸突活性。軸突素cDNA保藏編碼全長人軸突素的cDNA已於1996年8月9日保藏於ATCC(美國典型培養物保藏中心，12301Parklawn Drive,Rockville,MD,USA)，保藏號是98134。
序列表(1)一般資料(ⅰ)受讓人Amgen Inc.
(ⅱ)發明名稱新神經基因(ⅲ)序列數11(ⅳ)通信地址(A)收信人AMGEN INC.
(B)街道1840 DEHAVILLAND DRIVE(C)城市THOUSAND OAKS(D)州CA(E)國家美國(F)郵政編碼91320-1789(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，版本1.30(ⅵ)當前申請數據(A)申請號08/694.579(B)提交日期1996年8月9日(C)分類(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名OLESKI,NANCY A.
(B)註冊號34,688(C)參考/檔案號A-413(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度1604個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1:ACTCTCTCGC TCTCTTTCTG TCTCTTCCTC GCTCCCTCTC TTTCTCTCCT CCCTCTGCCT 60TCCCAGTGCA TAAAGTCTCT GTCGCTCCCG GAACTTGTTG GCAATGCCTA TTTTTCAGCT 120TTCCCCCGCG TTCTCTAAAC TAACTATTTA AAGGTCTGCG GTCGCAAATG GTTTGACTAA 180ACGTAGGATG GGACTTAAGT TGAACGGCAG ATATATTTCA CTGATCCTCG CGGTGCAAAT 240AGCTTACCTG GTGCAGGCCG TGAGAGCAGC AGGCAAGTGC GATGCAGTCT TTAAGGGCTT 300TTCAGACTGT TTGCTCAAGC TGGGTGACAG CATGGCCAAC TACCCGCAGG GCCTGGACGA 360CAAGACGAAC ATCAAGACCG TGTGCACATA CTGGGAGGAT TTCCACAGCT GCACGGTCAC 420AGCTCTTACG GATTGCCAGG AAGGGGCGAA AGATATGTGG GATAAACTGA GAAAAGAATC 480GAAAAACCTC AATATCCAAG GCAGCTTATT CGAACTCTGC GGCAGCGGCA ACGGGGCGGC 540GGGGTCCCTG CTCCCGGCGC TTTCCGTGCT CCTGGTGTCT CTCTCGGCAG CTTTAGCGAC 600CTGGCTTTCC TTCTGACTTC TGAGCACGGG GCCGGGTCCC CCCTCCGCTC ACCCACCCAC 660ACTCACTCCA TGCTCCCGGA AATCGAGAGG AAGAGCCATT CGTTCTCTAA GGACGTTGTG 720ATTCTCTGTG ATATTGAAAA CACTCATATG GGATTGTGGG AAATCCTGTT TCTCTCTTTT 780TTTTTTTTTA ATTTTTTTTT ATTTTGGTTG AGTCCTTGTG TTTTAGTTGC CAAATGTTAC 840CGATCAGTGA GCAAAGCAAG CACAGCCAAA ATCGGACCTC ACCTTAAGTC CGTCTTCACA 900CAAAAATAAG AAAACGGCAA ACTCACCCCC ATTTTTAATT TTGTTTTTAA TTTTACTTAC 960TTATTTATTT ATTTATTTTT TGGCAAAAGA ATCTCAGGAA TGGCCCTGGG CCACCTACTA 1020TATTAATCAT GTTGATAACA TGAAAAATGA TGGGCTCCTC CTAATGAGAA AGCGAGGAGA 1080GGAGAAGGCC AGGGGAATGA GCTCAAGAGT GATGCCCACG TGGGAATAAT CGCTCACGTC 1140TTTCTTCCAC AGTACCTTGT TTTGATCATT TCCACAGCAC ATTTCTCCTC CAGAAACGCG 1200AAAAACACAA GCGTGTGGGT TCTGCATTTT TAAGGATAAG AGAGAGAAAG AGGTTGGGTA 1260TAGTAGGACA GGTTGTCAGA AGAGATGCTG CTATGGTCAC GAGGGGCCGG TTTCACCTGC 1320TATTGTCGTC GCCTCCTTCA GTTCCACTGC CTTTATGTCC CCTCCTCTCT CTTGTTTTAG 1380CTGTTACACA TACAGTAATA CCTGAATATC CAACGGTATA GTTCACAAGG GGGTAATCAA 1440TGTTAAATCT AAAATAGAAT TTAAAAAAAA AAGATTTTGA CATAAAAGAG CCTTGATTTT 1500AAAAAAAAAG AGAGAGATGT AATTTAAAAA GTTTATTATA AATTAAATTC AGCAAAAATT 1560TGCTACAAAG TATAGAGAAG TATAAAATAA AAGTTATTGT TTGA 1604(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度435個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2:ATGGGACTTA AGTTGAACGG CAGATATATT TCACTGATCC TCGCGGTGCA AATAGCGTAT 60CTGGTGCAGG CCGTGAGAGC AGCGGGCAAG TGCGATGCGG TCTTCAAGGG CTTTTCGGAC 120TGTTTGCTCA AGCTGGGCGA CAGCATGGCC AACTACCCGC AGGGCCTGGA CGACAAGACG 180AACATCAAGA CCGTGTGCAC ATACTGGGAG GATTTCCACA GCTGCACGGT CACAGCCCTT 240ACGGATTGCC AGGAAGGGGC GAAAGATATG TGGGATAAAC TGAGAAAAGA ATCCAAAAAC 300CTCAACATCC AAGGCAGCTT ATTCGAACTC TGCGGCAGCG GCAACGGGGC GGCGGGGTCC 360CTGCTCCCGG CGTTCCCGGT GCTCCTGGTG TCTCTCTCGG CAGCTTTAGC GACCTGGCTT 420TCCTTCTGAG CACGG 435(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度142個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:3:Met Gly Leu Lys Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Ser Leu Ile Leu Ala Val1 5 10 15Gln Ile Ala Tyr Leu Val Gln Ala Val Arg Ala AIa Gly Lys Cys Asp20 25 30Ala Val Phe Lys Gly Phe Ser Asp Cys Leu Leu Lys Leu Gly Asp Ser35 40 45Met Ala Asn Tyr Pro Gln Gly Leu Asp Asp Lys Thr Asn Ile Lys Thr50 55 60Val Cys Thr Tyr Trp Glu Asp Phe His Ser Cys Thr Val Thr Ala Leu65 70 75 80Thr Asp Cys Gln Glu Gly Ala Lys Asp Met Trp Asp Lys Leu Arg Lys85 90 95Glu Ser Lys Asn Leu Asn Ile Gln Gly Ser Leu Phe Glu Leu Cys Gly100 105 110Ser Gly Asn Gly Ala Ala Gly Ser Leu Leu Pro Ala Leu Ser Val Leu115 120 125Leu Val Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Trp Leu Ser Phe130 135 140(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度142個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:4:Met Gly Leu Lys Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Ser Leu Ile Leu Ala Val1 5 10 15Gln Ile Ala Tyr Leu Val Gln Ala Val Arg Ala Ala Gly Lys Cys Asp20 25 30Ala Val Phe Lys Gly Phe Ser Asp Cys Leu Leu Lys Leu Gly Asp Ser35 40 45Met Ala Asn Tyr Pro Gln Gly Leu Asp Asp Lys Thr Asn Ile Lys Thr50 55 60Val Cys Thr Tyr Trp Glu Asp Phe His Ser Cys Thr Val Thr Ala Leu65 70 75 80Thr Asp Cys Gln Glu Gly Ala Lys Asp Met Trp Asp Lys Leu Arg Lys85 90 95Glu Ser Lys Asn Leu Asn Ile Gln Gly Ser Leu Phe Glu Leu Cys Gly100 105 110Ser Gly Asn Gly Ala Ala Gly Ser Leu Leu Pro Ala Phe Pro Val Leu115 120 125Leu Val Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Trp Leu Ser Phe130 135 140(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「合成DNA」(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:5:CTAGTCTAGA ACCATGGGAC TTAAG 25(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「合成DNA」(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:6:GGTATAGTCG ACCCGTGCTC AGAA 24(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:7:
Asp Cys Gln Glu Gly Ala Lys Asp Met Trp Asp Lys Leu Arg Lys1 510 15(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:8:
Leu Val Pro Arg Gly Serl 5(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度13個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:9:
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu1 5 10(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「合成DNA」(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:10:CTAGTCTAGA ACCATGGGAC TTAAG 25(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)順序特徵(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「合成DNA」(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:11:GGTATACTCG AGCCCGTTGC CGCT2權利要求
1．編碼多肽、選自以下的核酸分子(a)SEQ ID NO:1的核酸分子；(b)SEQ ID NO:2的核酸分子；(c)編碼SEQ ID NO:3的多肽的核酸分子；(d)編碼SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子；(e)編碼與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽至少70％相同的多肽的核酸分子；和(f)是上述(a)-(e)的任何一個的互補物的核酸分子。
2．是SEQ ID NO:1的核酸分子。
3．是SEQ ID NO:2的核酸分子。
4．編碼SEQ ID NO:3的多肽的核酸分子。
5．編碼SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子。
6．包含權利要求1的核酸分子的載體。
7．包含權利要求2的核酸分子的載體。
8．包含權利要求3的核酸分子的載體。
9．包含權利要求4的核酸分子的載體。
10．包含權利要求5的核酸分子的載體。
11．包含權利要求6的載體的宿主細胞。
12．包含權利要求7的載體的宿主細胞。
13．包含權利要求8的載體的宿主細胞。
14．包含權利要求9的載體的宿主細胞。
15．包含權利要求10的載體的宿主細胞。
16．產生軸突素多肽的方法，包括以下步驟(a)在合適宿主中表達由權利要求1的核酸編碼的多肽；和(b)分離該多肽。
17．權利要求16的方法，其中該多肽是SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4。
18．選自以下的軸突素多肽(a)SEQ ID NO:3的多肽；(b)SEQ ID NO:4的多肽；和(c)與(a)或(b)的多肽至少70％相同的多肽。
19．是SEQ ID NO:4的多肽或其生物學活性片段的軸突素多肽。
20．不具有氨基末端甲硫氨酸的權利要求19的軸突素多肽。
21．選自以下的權利要求20的軸突素多肽胺基酸25-115；胺基酸1-115；和胺基酸1-113。
22．特異性結合人軸突素的抗體或其片段。
23．權利要求22的抗體，它是單克隆抗體。
全文摘要
公開了名為軸突素的新多肽的DNA序列和胺基酸序列,軸突素主要在大腦的選定區中表達。
文檔編號C12N15/12GK1232500SQ97198478
公開日1999年10月20日 申請日期1997年8月7日 優先權日1996年8月9日
發明者L·泰爾, G·S·內維, Y·西特裡 申請人:安姆根有限公司, 耶達研究及發展有限公司