枇杷葉總三萜酸組分及其在製備抗炎、止咳藥物中的應用的製作方法

2023-05-26 04:06:31 1

專利名稱：枇杷葉總三萜酸組分及其在製備抗炎、止咳藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從中藥枇杷葉中提取分離的一種總三萜酸組分及其在製備藥物方面的應用，特別是在製備抗炎、止咳藥物方面的應用。
充分發掘我國豐富的中藥資源，利用現代科學技術手段，研製臨床有效的治療藥物是很有必要的。然而，從中藥枇杷葉中提取分離一種總三萜酸組分用於製備藥物特別是製備抗炎、止咳藥物方面，目前尚未見有報導。
本發明的目的之一是，提供一種總三萜酸組分，其化學成分主要包括烏蘇酸、2α-羥基烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸，另外還含有齊墩果酸、坡模酸和薔薇酸等成分。該總三萜酸組分，其含量達50％以上，其中烏蘇酸、2α-羥基烏蘇酸和2α-羥基齊墩果酸所佔比例分別為30-60％，5-20％和5-20％。
本發明的目的之二是，提供一種總三萜酸組分在製備藥物方面的應用，特別是在製備抗炎、止咳藥物方面的應用。
為了探討其藥效作用的物質基礎，尋找與該中藥功能主治相吻合的有效成分，本實驗室對其進行了化學成分和抗炎、鎮咳藥理活性研究。初步藥理篩選實驗表明，枇杷葉乙醇提取物對二甲苯引起的小鼠耳腫脹有明顯抑制作用，對檸檬酸噴霧引起的豚鼠咳嗽有明顯的止咳作用。繼而對其乙醇提取物進行分離精製，經過大孔樹脂除雜，氧化鋁脫色，甲醇或丙酮結晶，得到總三萜酸組分；對其進行分離得到6個三萜酸類化合物，分別鑑定為烏蘇酸(ursolic acid，I)，2α-羥基烏蘇酸(2α-hydroxyursolic acid，II)，2α-羥基齊墩果酸(maslinic acid，III)，齊墩果酸(oleanolic acid，IV)，坡模酸(pomolic acid，V)和薔薇酸(euscaphic acid，VI)；其中，坡模酸系首次從該植物中分離得到。本發明用分離得到的6種成分作為標準品，對總三萜酸進行了HPLC分析，結果表明總三萜酸中含化合物I-VI的總量達86.8％；各成分烏蘇酸、齊墩果酸、2α-羥基烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸、坡模酸和薔薇酸比例依次為47.9％，1.5％，10.0％，11.1％，3.6％和12.7％。
深入的藥效學實驗研究表明總三萜酸組分，烏蘇酸和2α-羥基齊墩果酸對二甲苯引起的小鼠耳腫脹顯示很強的抗炎活性；前二者對檸檬酸噴霧引起的豚鼠咳嗽顯示了止咳作用。
本發明的技術方案依此包含如下步驟一、總三萜酸的製備以枇杷葉[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lind1.]為原料，用95％乙醇回流提取2次，每次兩小時，合併提取液，回收溶劑，得浸膏。將浸膏用適量水溶解，用D101大孔吸附樹脂進行處理，先用水洗脫，再用95％EtOH洗脫，後者洗脫部分回收溶劑得棕色洗脫物，用乙醇溶解，三倍量中性氧化鋁拌樣，揮幹溶劑後用一倍量中性氧化鋁柱層析，甲醇洗脫，回收溶劑得無定型粉末，經甲醇或丙酮處理，即得總三萜酸。二、藥效學試驗1、實驗材料小鼠，昆明種，雌雄各半，體重25～30g，二級動物(合格證號SCXK1100-0006)；豚鼠，普通級；均購自中國醫學科學院實驗動物中心。
2、實驗方法與結果1)、口服枇杷葉乙醇提取物的萃取部位對二甲苯引起小鼠耳腫脹的影響取小鼠，體重25～30g，隨機分為4組，每組14隻，雌雄各半，第1組給生理鹽水，第2～4組，分別灌服枇杷葉各萃取部位浸膏的懸浮狀水溶液，各組每日灌胃給藥1次，連續3次，於末次給藥45分鐘後，分別以二甲苯棉球接觸小鼠右耳5秒鐘，15分鐘後拉頸椎處死小鼠。以直徑8mm打孔器將小鼠雙耳同部位切下，測定左右耳重量差，統計處理各組數據並計算抑腫率。結果表明EJ-02和EJ-03部分對二甲苯引起的小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，顯示抗炎活性(表1)。表1 口服枇杷葉乙醇提取物的萃取部位對二甲苯引起小鼠耳腫脹的影響(X±SD，n＝14)組別 劑量(mg/kg)兩耳片重量差(mg)抑腫率生理鹽水組20ml 21.29±3.45EJ-02組 0.435 15.29±5.98*28.2％EJ-03組 1.515 15.21±4.76*28.6％EJ-04組 0.107 17.57±6.95注與生理鹽水組比較*P＜0.05
2)、口服枇杷葉乙醇提取物的萃取部位對豚鼠的止咳作用採用檸檬酸噴霧引咳法，取豚鼠，體重190～220g，隨機分為5組，每組8隻，雌雄各半。第1組口服生理鹽水，第2～4組，分別口服枇杷葉各萃取部位浸膏的懸浮狀水溶液，第5組口服可待因水溶液，灌胃給藥1小時後，將豚鼠放入實驗裝置內，用超聲波醫用霧化器，噴入17.5％檸檬酸溶液的霧化氣體，噴霧40秒鐘，記錄5分鐘內每隻豚鼠的咳嗽潛伏期及咳嗽次數。結果表明，EJ-02和EJ-03部分對豚鼠均有明顯的止咳作用(表2)。表2. 口服枇杷葉乙醇提取物的萃取部位對豚鼠的止咳作用(X±SD，n＝8)組別 劑量(mg/kg) 咳嗽潛伏期(s) 咳嗽次數/5min生理鹽水組5ml 43.50±16.4524.13±5.36EJ-02組 435 75.13±41.86*15.88±6.27*EJ-03組 1515 82.25±28.15*13.63±5.22*EJ-04組 107 48.75±11.7021.75±7.31可待因組 30120.38±16.09***7.38±1.70***注與生理鹽水對照組比較*P＜0.05，***P＜0.001.
3)、口服烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸和總三萜酸對二甲苯引起小鼠耳腫脹的影響昆明種小鼠，體重28～30g，隨機分為9組，每組14隻，雌雄各半。第1組口服生理鹽水，第2組口服阿司匹林水溶液，第3～5組，分別口服烏蘇酸高、中、低三個劑量組的水溶液，第6組口服2α-羥基齊墩果酸水溶液，第7～9組，分別口服總三萜酸高、中、低三個劑量組的水溶液，其它方法同4.1所述。結果表明烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸和總三萜酸均對二甲苯引起的小鼠耳腫脹有明顯抑制作用(表3)。表3 口服烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸和總三萜酸對二甲苯引起小鼠耳腫脹的影響(X±SD)組別劑量(mg/kg) 兩耳片重量差(mg) 抑腫率生理鹽水組 20ml 22.29±7.18阿司匹林組 150 12.24±6.01***44.7％烏蘇酸組240 10.35±3.56***53.3％烏蘇酸組120 9.78±5.82***55.8％烏蘇酸組60 12.98±8.14**41.4％2α-羥基齊墩果酸90 13.16±7.29**40.6％總三萜酸組 400 12.99±7.38**41.3％總三萜酸組 200 14.05±6.15*36.6％總三萜酸組 100 17.17±6.5922.5％注與生理鹽水對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
4)枇杷葉中烏蘇酸、總三萜酸對豚鼠的止咳作用取豚鼠，體重200～230g，隨機分為9組，每組8隻，雌雄各半。第1組口服生理鹽水，第2組口服可待因水溶液，第3組口服磷酸苯丙哌林水溶液，第4～6組，分別口服烏蘇酸高、中、低三個劑量組的水溶液，第7～9組分別口服總三萜酸高、中、低三個劑量組的水溶液，其它方法同上。結果，枇杷葉中烏蘇酸、總三萜酸對豚鼠顯示了止咳作用(表4)。表4 服枇杷葉中烏蘇酸、總三萜酸對豚鼠的止咳作用(X±SD，n＝8)組別 劑量(mg/kg) 咳嗽潛伏期(s) 咳嗽次數/5min生理鹽水組5ml 42.75±19.1526.00±5.87可待因組 30 107.75±21.89***12.50±6.61**磷酸苯丙哌林組20 95.50±47.95*13.25±7.04**烏蘇酸組 240 79.75±25.45*13.75±5.44**烏蘇酸組 120 46.00±22.3617.50±5.41*烏蘇酸組 60 42.25±20.19 23.50±10.89總三萜酸組400 73.00±30.68*14.25±6.75**總三萜酸組200 70.00±31.32*17.75±6.77*總三萜酸組100 64.25±35.01 21.75±10.16注與生理鹽水對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.三、總三萜酸的組成成分分析以上藥效學實驗結果表明，烏蘇酸具有很強的抗炎作用，其活性強於阿司匹林對照組，2α-羥基齊墩果酸和總三萜酸也顯示較強的抗炎作用；烏蘇酸和總三萜酸還顯示相應的止咳作用。本發明的研究表明，枇杷葉在不同產地、同一產地的不同採集期，或從藥店採購的商品(蜜炙)中測定烏蘇酸含量在0.59-0.76％範圍。
1、儀器與材料本發明採用了美國Waters 600型高效液相色譜儀，二極體陣列檢測器，2010數據處理軟體；TCQ-250超聲波清洗器(北京醫療設備二廠)；甲醇為色譜純，水為重蒸蒸餾水；磷酸為分析純。
2、色譜條件色譜柱Nova-pakC18(3.9mm×150mm，4μm)；流動相CH3OH-H2O-H3PO4(80∶20∶0.075)；流速1ml/min；柱溫25℃；檢測波長205nm。
3、三萜酸樣品及化合物1-6標準品溶液的製備取總三萜酸或化合物1-6標準品0.70mg，精密稱定至0.01mg，置1ml量瓶加甲醇溶液並稀釋至刻度，搖勻即得。
4、枇杷葉樣品液的製備取樣品枇杷葉(過3號篩)約0.8g，精密稱定至0.0001g，置於25ml容量瓶中，加入氯仿20ml，稱量，封口膜封口。浸泡30min，超聲提取20min，間歇10min後，繼續超聲提取20min，稱重，補重，使前後重量一樣。過濾，取續濾液5ml揮幹，甲醇溶解，少量多次轉移至5ml容量瓶中，甲醇定容。
5、總三萜酸的組成成分分析取化合物1-6標準品溶液分別進樣20μl，按上述色譜條件測定各自的保留時間；總三萜酸樣品液同法進樣，其色譜圖和化合物1-6的峰位如(

圖1)所示。用歸一化法測定峰面積積分值，總三萜酸中含化合物1-6的總量達86.8％；各成分烏蘇酸、齊墩果酸、2α-羥基烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸、坡模酸和薔薇酸比例依次為47.9％，1.5％，10.0％，11.1％，3.6％和12.7％。發明優點本發明的優點在於，與現有技術相比，克服了傳統中藥多為複方或以簡單提取粗提物製成口服顆粒或稠膏導致缺乏可靠質量控制以及服用、攜帶和運輸不便等缺陷，採用現代科學技術可以製備更加安全、有效、穩定、可控和服用方便的藥物製劑。
權利要求
1.一種從枇杷葉中得到的總三萜酸組分，主要包含烏蘇酸、2α-羥基烏蘇酸、2α-羥基齊墩果酸、齊墩果酸、坡模酸和薔薇酸，其化學結構通式為 式(1)式中R1、R3、R4為H或OH；R2為α-OH或β-OH。
2.如權利要求1所述的總三萜酸組分，其含量達50％以上，其中烏蘇酸、2α-羥基烏蘇酸和2α-羥基齊墩果酸所佔比例分別為30-60％，5-20％和5-20％。
3.如權利要求1或2所述的總三萜酸組分，該總三萜酸組分是從中藥枇杷葉中分離純化得到的。
4.一種總三萜酸組分在製備治療藥物中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其中的藥物為抗炎、鎮咳臨床治療藥物。
全文摘要
本發明涉及從中藥枇杷葉中提取分離的一種總三萜酸組分，其化學成分包括烏蘇酸、齊墩果酸、2α－羥基烏蘇酸、2α－羥基齊墩果酸、坡模酸和薔薇酸等；它具有式(1)化學結構通式和抗炎、鎮咳活性，本發明還涉及該總三萜酸組分在製備藥物方面的用途，特別是在製備抗炎、止咳等藥物方面的用途。
文檔編號A61P11/00GK1439648SQ0312117
公開日2003年9月3日 申請日期2003年3月28日 優先權日2003年3月28日
發明者楊峻山, 鞠建華, 王立為, 肖培根 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所