內源性小分子物質在快速檢測腎毒性方面的應用的製作方法
2023-05-26 04:13:21 1
內源性小分子物質在快速檢測腎毒性方面的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了基於代謝組學的內源性小分子物質在快速檢測腎毒性方面的應用。其中內源性小分子物質指7個腎毒性生物標記物肌酸酐、花生四烯酸以及溶血磷脂醯膽鹼類[溶血磷脂醯膽鹼(16:1)、溶血磷脂醯膽鹼(20:5)、溶血磷脂醯膽鹼(20:3)、溶血磷脂醯膽鹼(20:2)、溶血磷脂醯膽鹼(22:5)]；同時也指3個腎毒性專屬生物標記物溶血磷脂醯膽鹼(20:3)、溶血磷脂醯膽鹼(20:2)和溶血磷脂醯膽鹼(22:5)。本發明篩選得到的腎毒性生物標記物能夠比生化指標更加快速、靈敏地判斷腎臟是否受到損傷，有效地彌補臨床腎功能生化評價指標缺乏靈敏性的不足，使腎毒性以及腎臟疾病的診斷更加靈敏、可靠。
【專利說明】內源性小分子物質在快速檢測腎毒性方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及到使用代謝組學技術尋找腎毒性生物標記物，然後對其進行專屬性考 察，接著使用支持向量機（SVM)對它們進行驗證與優化。更具體地說是內源性小分子物質 在快速檢測腎毒性以及腎臟疾病方面的應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，藥物安全性問題受到人們極大的關注。由於腎臟是機體主要的排洩器官， 因此它特別容易受到藥物的影響，從而導致藥物腎毒性在臨床中較為常見。血清肌酐（Scr) 和尿素氮（BUN)是臨床常用的腎功能評價指標，然而其在臨床檢測中缺乏靈敏性，不利於腎 毒性的檢測和診斷。因此，我們亟需尋找靈敏、專屬、高效的藥物腎毒性評價指標。隨著研 究的不斷深入，代謝組學技術被廣泛應用於藥物毒性評價。它是系統生物學的重要組成部 分，運用現代檢測技術考察生物體系受外界刺激所引起的內源性小分子物質變化狀況及其 變化規律。目前，核磁共振（i-NMR)，氣相色譜-質譜儀（GC-MS)和液相色譜-質譜（LC-MS) 是代謝組學常用的分析技術，其中LC-MS由於高靈敏度、寬的動態範圍、良好的分離能力， 被越來越廣泛的應用於代謝組學研究。隨著技術的不斷進步，超高效液相色譜串聯四極杆 飛行時間質譜（UPLC/Q-T0F-MS)分析技術為無靶向代謝組學在繁雜的內源性物質中篩選標 記物並且鑑定其結構提供了可靠的技術平臺，因此它彰顯出越來越大的優勢。為了更好的 發掘數據中包含的潛在信息，SVM已經逐漸發揮出其獨特的優勢。目前，SVM在人臉識別、 圖像處理、疾病診斷等領域中佔據越來越重要的地位。SVM作為一種智能模式識別技術，它 以VC維理論為基礎，根據樣本信息找到能夠區分兩類別的最優線性分界面，可以有效地解 決二分類問題。因此，可以通過SVM特徵選擇和分類預測的特性，為代謝組學中相關生物標 記物的研究提供可靠的數據分析技術，進一步為代謝組學的應用提供更加廣闊的空間。
【發明內容】
[0003] 本發明通過代謝組學技術與SVM相結合發現腎毒性生物標記物，排除了非專屬物 質的幹擾來達到靈敏、準確的要求，可以有效地彌補臨床腎功能生化評價指標缺乏靈敏性 的不足，使腎毒性以及腎臟疾病的診斷更加靈敏、可靠。
[0004] 為實現上述目的，本發明公開了如下的技術方案： 內源性小分子物質在快速檢測腎毒性方面的應用，特別是在快速判斷腎臟是否 受到損傷方面的應用。其中所述的內源性小分子物質指腎毒性生物標記物，它們是基 於代謝組學技術篩選出來的，包括肌酸酐、花生四烯酸以及溶血磷脂醯膽鹼類[溶血 磷脂醯膽鹼（16:1) [LPC(16:1)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:5) [LPC(20:5)]、溶血磷脂醯膽 鹼（20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂醯膽鹼（22:5) [LPC(22:5)]]，它們能夠快速檢測腎毒性。在腎毒性生物標記物的基礎上經過SVM驗 證與優化的內源性小分子物質指腎毒性專屬生物標記物，包括溶血磷脂醯膽鹼（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:2) [LPC (20:2)]、溶血磷脂醯膽鹼（22:5) [LPC (22:5)]， 它們能夠快速判斷腎臟是否受到損傷。
[0005] 本發明進一步公開了基於代謝組學技術結合SVM的腎毒性生物標誌物的篩選方 法，包括樣品前處理、數據採集、數據處理(多元統計分析)、生物標記物的專屬性考察、專屬 生物標記物的驗證與優化等步驟。其特徵在於：在數據採集中使用梯度洗脫的條件：〇_〇. 5 min，A: 99%-99%;0. 5-2 min, A: 99%-50%;2-9 min, A: 50%-1%;9-10 min, A: 1%-1%; 10-10. 5 min，A: 1%-99% ;10· 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動相 A 指 0· 1% 甲酸的水，流 動相B指0. 1 %甲酸的乙腈；在專屬生物標記物的驗證與優化中使用MATLAB R2010a軟體 (USA)基於腎毒性生物標記物建立SVM預測模型，該過程如下：將生物標記物在生理鹽水 組和各個藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機選擇數據作為訓練集和測試集建立預測模 型，通過優化找到最優的懲罰參數（c)和核函數（g)，然後以逐一排除一個生物標誌物為基 礎，利用SVM進行分類預測，得到相應的模型預測準確度，分析準確度，對其是否與腎毒性 密切相關進行區分。
[0006] 我們經過代謝組學技術篩選出腎毒性生物標記物，具體是肌酸酐、花生四烯酸、 溶血磷脂醯膽鹼（16:1) [LPC (16:1)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:5) [LPC(20:5)]、溶血磷脂醯 膽鹼（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:2) [LPC(20:2)]、溶血磷脂醯膽鹼（22:5) [LPC(22:5)]。腎毒性生物標記物經過專屬性考察、驗證與和優化後得到腎毒性專屬生物標 記物，具體是溶血磷脂醯膽鹼（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:2) [LPC(20:2)]、 溶血磷脂醯膽鹼（22: 5) [LPC (22:5)]。
[0007] 本發明更加詳細的技術方案如下： 1、樣品前處理：樣品處理前將血漿在室溫下解凍。然後，將300 μ L乙腈加入到100 μ L 血漿中，並渦旋混合1分鐘。接著將混合物在冰水浴中超聲10分鐘，然後以13000轉在4°C 下離心15分鐘。收集上清液用於UPLC/Q-T0F-MS分析。
[0008] 2、數據採集：使用UPLC/Q-T0F-MS系統(美國Waters公司）對大鼠血漿樣品進行 信息採集。色譜柱用 ACQUITY UPLC HSS C18 (2.1X100 mm，L7ym，美國 Waters 公司）， 柱溫為40°C，流速為0. 3mL/min，進樣量為5 μ L。UPLC分離系統包括二元溶劑系統，用流 動相A (0.1%甲酸的水）和流動相Β (0.1%甲酸的乙腈)。採用梯度洗脫，具體洗脫條 件：0-0· 5 min，A: 99%-99% ;0· 5-2 min，A: 99%-50% ;2-9 min，A: 50%-1% ;9-10 min，A: 1%-1%;10-10.5 min，A: 1%-99%;10.5-12 min，A: 99%-99%。質譜採用電噴霧電離（ESI) 源，在正離子電離模式下進行質譜分析。MS參數如下：乾燥氣流速為10mL/min，乾燥氣體溫 度為325°C，霧化氣氣壓為350 psi，脫溶劑氣流量600L/h，毛細管電離電壓3. 5 kV，四極杆 掃描範圍m/z50-1000。蒸發氣體和輔助氣體是高純度氮。用（[M+H]+= 556. 2771，[Μ-ΗΓ =554. 26)作為參考離子來確保光譜採集過程中的精度。為了確保代謝組學數據採集的可 靠性，我們從每個樣品中吸取等量的血漿混合成為QC樣品，用它們對儀器的穩定性、方法 精密度進行監控，直到整個系統在一個良好穩定的狀態下才能開始樣品信息採集。同時在 24小時之內，QC樣品每4個小時檢測一次，用來監測整個採集過程中樣品與系統的穩定性。
[0009] 3、數據處理：數據分析過程如下：我們使用MarkerLynx V4. 1 (美國Waters公 司）將腎毒性三個藥物組的原始信息分別進行處理轉化為Excel格式。然後分別將其導入 SIMCA-P +11. 5軟體（Umetrics，瑞典）進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA)，選擇VIP>1的 物質作為候選代謝產物。接著分別用SPSS17. 0它們進行t檢驗，將p〈0. 05的物質作為候 選代謝物進行下一步的篩選與分析。我們將三個腎毒性藥物組各自的候選代謝物進行整合 化分析（http://bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html)，篩選出它們共同的 代謝物。然後，通過HMDB (http://www.hmdb. ca/)資料庫中檢索得到潛在生物標誌物。最 後，通過比較標準品和樣品之間的指紋圖譜來鑑定物質。如果沒有標準品，我們分析它們的 MS/MS信息來識別它們。我們鑑定得到的物質認為是腎毒性共同生物標記物。然後，我們用 它們的m/z值在非腎毒性藥物組中篩選代謝組數據。然後進行t檢驗和含量變化等分析， 初步確定腎毒性專屬生物標誌物。接下來，我們使用MATLAB R2010a軟體（USA)基於這些 初步的腎毒性專屬生物標記物建立SVM預測模型。該過程如下：將生物標記物的峰面積作 為輸入變量，隨機選擇數據作為訓練集和測試集建立預測模型，通過優化找到最優的懲罰 參數（c)和核函數（g)。然後，我們以逐一排除一個生物標誌物為基礎，利用SVM進行分類 預測，得到相應的模型預測準確度。分析準確度，對其是否與腎毒性密切相關進行區分。 [0010] 本發明具有的有益效果在於： 臨床中用Scr和BUN作為腎損傷的檢測指標，但是它們常在腎臟組織出現明顯病理性 損傷之後才會發生顯著性變化，表明用生化指標來診斷腎損傷具有延後性。因此，及時發 現、預防、治療腎損傷就顯得十分重要。首先，通過本發明發現的腎毒性生物標記物能夠比 生化指標更加快速、靈敏地判斷腎臟是否受到損傷，有助於我們對腎損傷進行及時地預防 和治療。其次，它們能從代謝水平上揭示藥物對體內內源性物質代謝的影響情況，並且從它 們所涉及的生物學意義為切入點解釋藥物腎毒性的發生機制。最後，關於相關毒性的專屬 生物標記物的發現，為建立一套基於代謝組學技術的藥物毒性評價方法有著推動作用，同 時也為疾病診斷提供一條新的思路。
[0011] 【專利附圖】
【附圖說明】： 圖1 :整個實驗的總體流程圖； 圖2 :腎毒性各藥物組多元統計分析的PLS-DA得分圖； 圖3 :用維恩圖顯示整合化分析篩選得到28個腎毒性共同代謝物； 圖4 :鑑定得到的7個腎毒性共同生物標記物； 圖5 :支持向量機模型的預測準確率，其中：
【權利要求】
1. 內源性小分子物質在快速檢測腎毒性方面的應用；其中所述的內源性小分子物質 指7個腎毒性生物標記物，它們是基於代謝組學技術篩選出來的，包括肌酸酐、花生四烯酸 以及溶血磷脂醯膽鹼類[溶血磷脂醯膽鹼（16:1) [LPC(16:1)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:5) [LPC (20:5)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:3) [LPC (20:3)]、溶血磷脂醯膽鹼（20:2) [LPC (20:2)]、 溶血磷脂醯膽鹼（22:5) [LPC (22:5)]]。
2. 內源性小分子物質在快速判斷腎臟是否受到損傷方面的應用；其中所述的內源性 小分子物質指的是3個腎毒性專屬生物標記物，它們是在腎毒性生物標記物的基礎上經過 專屬性考察和SVM驗證與與優化篩選出來的，包括溶血磷脂醯膽鹼（20:3) [LPC(20:3)]、溶 血磷脂醯膽鹼（20:2) [LPC (20:2)]、溶血磷脂醯膽鹼（22:5) [LPC (22:5)]。
3. 權利要求1-2任一項所述的應用，其中基於代謝組學技術結合SVM的腎毒性生物標 志物的篩選方法，包括樣品前處理、數據採集、數據處理(多元統計分析)、生物標記物的專 屬性考察、專屬生物標記物的驗證與優化步驟；其特徵在於：在數據採集中使用梯度洗脫 的條件：0-0.5 min，A: 99%-99%;0· 5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min， 八：1%-1%;10-10.5 11^11，六：1%-99%;10.5-12 11^11，六：99%-99%，其中流動相六指0.1% 甲酸的水，流動相B指0. 1%甲酸的乙腈；在專屬生物標記物的驗證與優化中使用MATLAB R2010a軟體（USA)基於腎毒性生物標記物建立SVM預測模型，該過程如下：將生物標記物在 生理鹽水組和各個藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機選擇數據作為訓練集和測試集建 立預測模型，通過優化找到最優的懲罰參數（c)和核函數（g)，然後以逐一排除一個生物標 志物為基礎，利用SVM進行分類預測，得到相應的模型預測準確度，分析準確度，對其是否 與腎毒性密切相關進行區分。
【文檔編號】G01N30/02GK104280478SQ201410607906
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】李遇伯, 張豔軍, 鄧皓月 申請人:天津中醫藥大學