乾酪乳桿菌Bd－II菌株及其在降低血脂方面的應用的製作方法

2023-05-26 00:48:46 1

專利名稱：乾酪乳桿菌Bd－II菌株及其在降低血脂方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種乳桿菌屬的新菌株，以及該菌株在降低血脂方面的應用。
背景技術：
人和動物的腸道，傳統發酵食品等棲居著大量的有益菌群，在營養物質的消化與吸收、機體的生長與發育、免疫與拮抗等方面均發揮著重要的生理作用。近年來，微生態學家發現益生菌群中的乳桿菌、雙歧桿菌以及腸球菌等與膽固醇的代謝有直接的關係。國外大量的體內和體外研究都發現和證實了某些益生乳酸菌具有降低人體或動物的血清膽固醇含量的功效。而我國傳統食品中有著豐富的尚未被西方科學家發現的此類菌種資源，有待進一步開發利用。

發明內容
本發明人針對上述課題，研究了以我國傳統食品泡菜和醃製苜蓿中的微生物群為目標菌群，應用高膽固醇培養基，從中篩選具有降低膽固醇功效的益生乳酸菌，並進一步研究其在調節血脂方面的應用。
因而本發明的目的是提供一種乾酪乳桿菌Bd-II；本發明的另一目的是公開上述乾酪乳桿菌Bd-II在降低血脂方面的應用。
本發明的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)Bd-II製備過程如下將泡菜汁或苜蓿汁作為樣品冷藏，測定其pH值，並接種於MRS平板(Merck公司購得)且進行總菌落計數；然後採取上述樣品，根據上述測定結果用pH 6.8的PBS緩衝溶液浸泡混勻並梯度稀釋；吸取合適的稀釋度(每毫升含有100個左右細菌)100微升塗布於LBS平板，進行培養；挑取典型菌落轉接到MRS平板進一步純化；挑取理想單菌落轉接於MRS液體進行增菌，獲得乳酸菌菌株並冷藏保存；將上述新鮮的乳酸菌菌株以體外模型初步篩選具有降膽固醇功能的益生菌(USMAN and A.HOSONO.Bile tolerance，taurocholate deconjugation，andbinding of cholesterol by lactobacillus gasseri strains.J.Dairy Sci.199982243-248.)，進行菌種鑑定，其中可獲得乾酪乳桿菌Bd-II。
該乾酪乳桿菌Bd-II的微生物學特性示於表1。
表1乾酪乳桿菌Bd-II的微生物學特性


上述操作均在無菌條件下進行。
本發明的乾酪乳桿菌Bd-II除具有一般乳桿菌的有益作用外，將該菌株應用於調節血脂方面，如開發功能性的乳製品，作為人類膳食補充劑，還起到輔助降低人們血清膽固醇濃度的功效。
通過藉助以下實施例將更詳細說明本發明。以下實施例僅為說明性的，本發明並不受這些實施例限制。
本發明的乾酪乳桿菌Bd-II已於2002年12月6日在地址為中國北京市海澱區中關村北一條13號中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，並收到保藏號CGMCCNO.0849。
具體實施例方式
實施例1樣品採集樣品為泡菜汁捲心菜泡菜，菜葉和汁水一起均質得到的勻漿；苜蓿汁採集蘇州天平山農家的醃製苜蓿，取5克，加入10毫升無菌水均質得到的勻漿；實施例2集和乳酸菌篩選將上述樣品裝入無菌羅口瓶，旋緊，4℃冷藏。24小時內測定泡菜汁和苜蓿汁的pH，並接種於MRS平板測定其總菌落計數，然後按以下步驟處理。
實施例3 LBS平板分離取泡菜汁和苜蓿汁，根據實施例2中所測定的結果，無菌條件下用PBS緩衝溶液(pH 6.8)梯度稀釋，吸取合適的稀釋度溶液(每毫升含有100個左右細菌)100微升塗布於LBS平板，平板倒置放入厭氧培養箱，37℃厭氧培養36-72小時，觀察菌落生長情況，平板4℃保存。
實施例4菌株鏡檢無菌操作，接種環挑取實施例3所得典型菌落培養物，塗於載玻片，製片並革蘭氏染色，油鏡觀察菌體形態，挑取革蘭氏陽性細菌作為目的菌株。
實施例5菌株平板純化無菌條件下，接種環挑取實施例4所初步確定的目的菌落，在MRS平板上劃線分離，37℃倒置厭氧培養24-36小時，挑取單菌落進行鏡檢，直至確定所得的菌株已經純化。
實施例6菌株的增菌過程挑取實施例5所得的理想單菌落，轉接到1毫升MRS液體，37℃靜置培養24小時左右，再按1％(體積比)的接種量將培養液轉接到新的MRS液體，37℃靜置培養24小時，再在液體MRS中重複擴增2次，所得培養液4℃保存。
實施例7以體外模型初步篩選具有降膽固醇功能的益生菌15毫升無菌具塞離心管加入10毫升以無菌雞蛋黃液為膽固醇源的高膽固醇培養液MRSO-CHOL，按1％(體積比)的接種量接入實施例6獲得的新鮮的菌株，37℃培養24小時。培養液12,000×g離心10分鐘，按照鄰苯二甲醛測定膽固醇的方法測定上清夜中膽固醇的含量，以未接種的MRSO-CHOL作為對照，計算出各個實驗菌株對膽固醇的降低率(S.E.Glliland，C.R.Nelson，C.Maxwell.Applied and EnviromentalMicrobiology，1985，49377～381.)，從中選出具有較好的降低膽固醇功效的菌株，結果見表2。
膽固醇的降低率計算公式為D=C-AC100%]]>其中A為各實驗菌株發酵上清液OD550nm[波長550nm(納米)處的吸收光度值]；C為空白對照的OD550nm；D為膽固醇降低率。
表2降膽固醇益生乳酸菌初步篩選結果膽固醇降低率菌株數比例 來源(％)(株) (％) 泡菜醃製苜蓿40以上 6 9.09 4 230-40 9 13.645 220-30 1319.702 820以下 3857.2812 16其中，Bd-II具有較高的膽固醇降低率，達到45.17％，對應的膽固醇降低量為231.95微克/毫升。另外還有5株菌株的膽固醇降低率在40％以上。
實施例8 Bd-II菌種鑑定經中國科學院微生物研究所檢測鑑定，該Bd-II的微生物學特性如上述表1示。
實施例9菌體懸浮液製備方法將本發明的乾酪乳桿菌Bd-II(CGMCC No.0849)接入10％脫脂奶，37℃靜置培養16小時，計數；根據計數結果用脫脂奶做適當的稀釋、懸浮得到如表3中所需的菌液濃度。Bd-II死菌懸浮液製備方法懸浮108cfu/ml(每毫升中所含菌體個數)Bd-II脫脂奶置於100℃水浴加熱15分鐘，冷卻，冰箱保存待用。
應用實施例降血清膽固醇功能性實驗(體內實驗，動物實驗)動物模型在益生乳酸菌降低血清膽固醇功能性實驗研究中得到越來越廣泛的應用(鄭建仙.功能性食品(第三卷).北京中國輕工業出版社，1999.9.408-412.)。高脂高膽固醇飼料誘發動物脂代謝紊亂，血脂水平發生變化血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量降低。降血清膽固醇功能性實驗通常做法是，飼餵高脂高膽固醇飼料的同時，飼餵實驗動物實驗樣品，通過測定動物血清脂類含量的變化來確定實驗樣品對動物血脂的影響效果。
本發明篩選得到的益生乳酸菌是乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)Bd-II(CGMCC No.0849)，該菌株在體外實驗中具有較高的降低膽固醇濃度的能力。
本發明採用SD大鼠，在常規飼料中添加重量比為1％的膽固醇、5％的豬油和0.25％的豬膽鹽來誘發SD大鼠高膽固醇血症。同時飼餵懸浮乾酪乳桿菌的脫脂牛奶，最後檢測SD大鼠血清膽固醇等血脂含量，來判斷該菌株是否具有降低血清膽固醇的功效。
1、實驗動物和動物房條件雄性SD大鼠(8周齡)，40個。常規飼料餵養3天，隨機分成5組，每組8個，分籠餵養。
動物房條件溫度22±2℃，溼度56±5％，1周換2-3次鋸末。控制12小時光照，12小時黑暗。
飼料常規飼料由中科院上海實驗動物中心提供；高膽固醇飼料常規飼料添加重量比為1.0％的膽固醇，5％的豬油以及0.25％豬膽酸鹽，委託中科院上海實驗動物中心加工；所有的飼料進動物房前輻射滅菌。
2、益生乳酸菌Bd-II功能性動物實驗方法(1)實驗動物分組和飼餵安排40隻SD大鼠隨機分成5組，飼餵不同的飼料和菌體懸浮液，具體的分組如表3所示。
表3實驗動物分組和飼餵計劃實驗分組a日常飼餵b灌胃3毫升/個/天1.空白對照常規飼料+水水2.高脂對照高脂飼料+水水3.高脂SKMc對照 高脂飼料+水SKM4.Bd-II活菌 高脂飼料+水懸浮2.5×108cfu/ml活菌Bd-II的SKM5.Bd-II死菌 高脂飼料+水懸浮2.5×108cfu/ml死菌Bd-II的SKM注a每組8個SD大鼠b飼餵實驗共持續21天cSKM——滅菌10％脫脂奶(2)實驗動物的日常管理和飼餵SD大鼠按表3隨機分成1-5個組別，除空白對照組1飼餵常規飼料外，2-5組均飼餵高脂飼料。按照表3中方案，每日上午8點對SD大鼠灌胃3毫升/個/天。
(3)大鼠血清採集和血脂濃度的檢測21天飼餵實驗結束後，禁食12小時，乙醚深度麻醉，摘眼球取血，裝入無菌離心管，離心(3000×g，10分鐘)收集血清，送上海華山醫院檢驗中心測定血清中總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。
(4)統計分析同組數據單因素方差分析。
不同組之間t檢驗，p＜0.05差異有統計學意義，p＜0.01和p＜0.001差異有高度的統計學意義。
3、結果分析21天飼餵實驗結束後，禁食12小時，收集大鼠血清，送上海華山醫院進行血清脂類分析，測定TC、TG、HDL-C和LDL-C含量，計算AI(動脈粥樣硬化因子)。具體結果見表4。
表4大鼠血脂的測定結果

其中，*表示與組2相比P＜0.05，差異有統計學意義；**表示與組2相比P＜0.01，差異有高度的統計學意義；***表示與組2相比P＜0.001差異具有高度統計學意義。
從表4可以看出，空白對照組(組1)與高脂對照組(組2)的TC、LDL和AI差異具有高度的統計學意義，TG和HDL差異具有統計學意義，說明實驗動物的高血脂模型建立成功。
從表4還可以看出，高脂脫脂奶對照組(組3)與高脂對照組(組2)相比差異沒有統計學意義，說明單獨的脫脂奶培養基不具有降低血脂的作用。
從表4還可以看出，Bd-II活菌組(組4)與高脂對照組(組2)相比，能非常顯著地降低TC、LDL和AI，TG和HDL差異沒有統計學意義，說明Bd-II具有顯著的降血脂功能，並能降低心血管疾病的風險。Bd-II死菌組(組5)與高脂對照組(組2)相比，TC顯著降低，AI非常顯著降低，TG、HDL和LDL差異沒有統計學意義，說明Bd-II死菌也有降血脂的功能，並也能降低心血管疾病的風險。
權利要求
1.一種乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)Bd-II CGMCC NO.0849。
2.權利要求1所述的乾酪乳桿菌在降低血脂方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)Bd－II CGMCCNO.0849，及其在降低血脂方面的應用。
文檔編號A23L1/30GK1552845SQ0312899
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月30日 優先權日2003年5月30日
發明者蔣能群, 郭本恆, 孫立國 申請人:上海光明乳業股份有限公司