一種雙光子比率螢光探針及其在檢測β-半乳糖苷酶中的應用的製作方法

2023-05-26 13:41:01 1

本發明涉及螢光探針領域，具體涉及一種雙光子比率螢光探針及其在檢測β-半乳糖苷酶中的應用。本發明在具有較大雙光子吸收截面的螢光母體上引入β-半乳糖苷結構作為與β-半乳糖苷酶識別及反應的活性中心，利用反應物與產物的螢光波長差別，實現雙光子激發比率檢測β-半乳糖苷酶。

背景技術：
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β-半乳糖苷酶是人體中一種重要的酶，它能催化乳糖、神經節苷脂、乳糖基醯基神經醯胺及各種糖蛋白水解生成相應的產物，具有十分重要的生理功能，例如神經節苷脂貯積症與黏多糖貯積症IV型均與β-半乳糖苷酶的缺乏有關。另外，在分子與細胞生物學中，β-半乳糖苷酶還常被用作報告標記以確定外源基因是否成功進入細胞，並能進一步用於指導優化轉染條件。然而，長久以來檢測手段的缺乏阻礙了人們對β-半乳糖苷酶在生命體系中作用的研究。

螢光探針是有效檢測生命體內β-半乳糖苷酶的手段之一。一個具有應用前景的螢光探針應具有作用前後螢光變化明顯、對目標分子響應快、選擇性好、合成簡單等優點。Ching-Hsuan Tung等公開了一種用以檢測β-半乳糖苷酶的螢光探針DDAOG(結構見圖1a，Ching-Hsuan Tung et al.，Cancer Res,2004,64,1579)，經β-半乳糖苷酶催化水解後螢光增強從而檢測β-半乳糖苷酶的存在。但是該探針發射光譜太窄且與激發光譜重疊嚴重，因而檢測靈敏度大打折扣。基於水解前後發生光致電子轉移過程的效率不同，YasuteruUrano等以螢光素為螢光母體設計了螢光探針TG-βGal(結構見圖1b，Yasuteru Urano et al.,J.AM.CHEM.SOC.2005,127,4888)用於檢測β-半乳糖苷酶。但是該螢光探針發射波長偏短，且依然存在發射光譜與激發光譜相隔太近的問題。Tetsuo Nagano等發表了一個以羅丹熒為螢光母體的螢光探針HMDER-βGal(結構見圖1c，Tetsuo Nagano et.al,J.AM.CHEM.SOC.2011,133,12960)，利用水解前後在生理pH(7.2-7.4)下螺環化程度不同導致螢光強度的不同實現檢測β-半乳糖苷酶的目的。但是該螢光探針激發光波長偏短，無法消除背景螢光、探針分布及入射光強度對檢測結果的影響。因此開發具有更高靈敏度和信噪比的可用於生物體系中β-半乳糖苷酶檢測的螢光探針具有重要意義。

技術實現要素：
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本發明就是針對上述問題，提供了一種可用於雙光子激發比率檢測細胞內β-半乳糖苷酶的螢光探針，此探針可以在生理條件下經β-半乳糖 苷酶催化水解，所得產物螢光相對於原探針顯著紅移，同時探針與水解產物均具有雙光子吸收性能，可用紅外雷射進行雙光子激發。

本發明採用如下技術方案：在具有較大雙光子吸收截面的螢光母體上引入β-半乳糖苷結構作為與β-半乳糖苷酶識別及反應的活性中心，利用反應物與產物的螢光波長差別，實現雙光子激發比率檢測β-半乳糖苷酶。所述螢光探針的通式為：

通式I中，R1、R2為H、烷基、芳基或含雜原子的取代基，R3為烷基、芳基或含雜原子的取代基。R1、R2、R3為烷基、芳基時，一般為C1～C20的烷基、芳基，最佳為C1～C10的烷基、芳基；R1、R2、R3為雜原子取代基時，為磺酸基、羧基、羥基、滷素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。

上述通式I表示的化合物應用於雙光子比率檢測β-半乳糖苷酶，在β-半乳糖苷酶作用下生成具有通式II結構的化合物，後者相對於前者在生理pH(7.2-7.4)下會部分脫去質子，更容易發生分子內電荷轉移過程，因而螢光光譜發生顯著紅移，此過程可比率檢測β-半乳糖苷酶。

通式II中，R1、R2為H、烷基、芳基或含雜原子的取代基，R3為-OH或-O-。R1、R2為烷基、芳基時，一般為C1～C20的烷基、芳基，最佳為C1～C10的烷基、芳基。R1、R2為雜原子取代基時，為磺酸基、羧基、羥基、滷素、氨基、胺基、烷氧基、氰基或硝基。

通式I應用於雙光子比率檢測β-半乳糖苷酶，其特徵在於，β-半乳糖苷酶的測定包括以下工序：

(a)使具有通式I結構的化合物與β-半乳糖苷酶反應；

(b)測定由上述工序中的反應引起的螢光變化。

本發明的有益效果：

本發明提供的螢光探針在β-半乳糖苷酶存在下螢光波長發生顯著紅移，可用於高靈敏性地比率檢測β-半乳糖苷酶，同時，這類探針具有雙光子吸收性能，可用紅外雷射進行雙光子激發，不僅使發射光與激發光完全分開以消除激發光對檢測的影響，而且更容易穿透生物樣品，減少背景螢光對檢測結果的影響，這對於深入研究β-半乳糖苷酶在生物體內的生理和病理作用具有重要意義。

附圖說明：

圖1背景技術中所舉的已公開的用於檢測β-半乳糖苷酶的螢光探針；

圖2實施例1製備的螢光探針NI-βGal檢測β-半乳糖苷酶的原理示意圖；

圖3實施例1中合成螢光探針NI-βGal的流程圖；

圖4實施例2中螢光探針NI-βGal及水解產物NI在不同pH下用445nm光激發時的螢光強度示意圖；

圖5實施例3中螢光探針NI-βGal在加入β-半乳糖苷酶後的螢光強度隨時間變化示意圖；

圖6實施例4中NI-βGal及水解產物NI的雙光子作用光譜示意圖；

圖7實施例5中螢光探針NI-βGal用於細胞內β-半乳糖苷酶比率檢測的雙光子共聚焦螢光顯微鏡照片。

具體實施方式：

實施例用於進一步說明本發明，但本發明不限於實施例。

實施例中所用的主要實驗藥品來源如下：

2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl bromide(純度≥98％)與β-半乳糖苷酶(400單位/毫克)均購買自百靈威科技有限公司，甲醇鈉(純度≥50％)購買自國藥集團化學試劑有限公司，C6/lacZ7細胞購買自美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection)。

實施例1(探針的合成)：

如圖3所示，實施例所採用的探針化合物的結構用代號NI-βGal表示。

NI-βGal Tetraacetate的合成：向100mL三口燒瓶中加入0.9g4-羥基-氮-正丁基-1，8萘醯亞胺，2.1g 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl bromide，1.34g碳酸鉀，真空/氮氣置換3次，加入15mL HPLC純級乙腈，氮氣保護下加熱回流4小時，冷卻至室溫後將反應混合物倒入水中，過濾，水洗濾渣三次，用乙酸乙酯溶解濾渣，真空旋幹，所得固體經柱層析純化得NI-βGal Tetraacetate。

NI-βGal的合成：向50mL燒瓶中加入0.62g NI-βGal Tetraacetate，0.11g甲醇鈉，40mL甲醇，室溫下攪拌3h，加入事先稀釋10倍的37％濃鹽酸0.8mL，過濾，將濾液真空旋幹，用甲醇重結晶，過濾得固體後再在甲醇中進行二次重結晶得白色薄紙狀固體，即為目標產物NI-βGal。

實施例2(NI-βGal在生理pH下應用的可行性)：

pH採用PB(磷酸鹽緩衝溶液)控制。測定NI-βGal經β-半乳糖苷酶催化水解產物NI在不同pH下的螢光光譜時，先後將2955μL各種pH下的PB(濃度為0.1M)、45μL濃度為1mM的NI/乙醇溶液加入到1cmⅹ1cmⅹ4cm的比色皿中，使得混勻後探針NI的濃度為15μM，激發光選用445nm，用螢光光譜儀測定550nm處螢光強度。測定NI-βGal的螢光光譜時，除NI-βGal濃度改為3μM外其他測試條件同NI。NI-βGal及NI的螢光強度隨pH的變化如圖4所示。圖4表明在生理pH(7.2-7.4)下，NI-βGal經β-半乳糖苷酶催化水解後的產物NI有很強的螢光，而NI-βGal在此波段幾乎沒有螢光，因而使得NI-βGal具備在生理pH下比率檢測β-半乳糖苷酶的可行性。

實施例3(NI-βGal對β-半乳糖苷酶的比率檢測)：

先後將2973μL PB(pH＝7.4，濃度為0.1M)、27μL濃度為333μM的探針溶液加入到1cmⅹ1cmⅹ4cm的比色皿中，使得混勻後NI-βGal的濃度為3μM。加入24μL濃度為250mL的β-半乳糖苷酶溶液(即最終β-半乳糖苷酶的含量為6U)，並立即開始計時，激發光選用400nm，用螢光光譜儀測量工作液在30分鐘內的螢光光譜變化如圖5所示。圖5表明，加入β-半乳糖苷酶後，在440nm處螢光顯著降低，與此同時，探針水解產物NI的最大發射波長550nm處螢光顯著升高，因而NI-βGal可以實現對β-半乳糖苷酶的比率檢測。

實施例4(NI-βGal與NI的雙光子吸收性)：

配製100μM Rhodamine 6G/甲醇溶液、50μM NI-βGal/PB溶液及60μM NI/PB溶液，其中Rhodamine 6G/甲醇溶液為參比溶液。將上述三種樣品分別取2mL加入到細胞培養皿中，置於雙光子共聚焦螢光顯微鏡 下，選用10倍物鏡，在720-900nm範圍內以10nm為步長，逐漸改變激發光波長，測定上述三種樣品的螢光光譜，將數據輸入到OriginPro 8.5，處理後得NI-βGal與NI的雙光子作用光譜如圖6所示。圖6表明，激發波長在720-840nm範圍內，NI-βGal與NI均具有較為可觀的雙光子吸收性能，因而可以在此波段選擇某一波長為紅外激發光波長，應用雙光子吸收過程，實現對β-半乳糖苷酶的檢測。

實施例5(NI-βGal用於細胞內β-半乳糖苷酶的檢測)：

C6、C6/lacZ7細胞按照American Type Culture Collection規定進行培養。用10.0μM NI-βGal孵育C6細胞45分鐘，置於雙光子共聚焦螢光顯微鏡下拍照，激發光波長為740nm，細胞DIC通道、藍光通道、黃光通道、比率通道成像結果分別如圖7a、7b、7c、7d所示(圖中比例尺表示20μm)。用10.0μM NI-βGal孵育C6/lacZ7細胞(該細胞能夠產生β-半乳糖苷酶)45分鐘，置於雙光子共聚焦螢光顯微鏡下拍照，細胞DIC通道、藍光通道、黃光通道、比率通道成像結果分別如圖7e、7f、7g、7h所示(圖中比例尺表示20μm)。從圖中可以看出，經NI-βGal孵育後的正常C6細胞螢光比率值在0.5以下，而能產生β-半乳糖苷酶的C6/lacZ7細胞螢光比率值在2.5甚至3以上，表明本發明所述的螢光探針NI-βGal能夠有效地用於雙光子激發比率檢測生物體系中的β-半乳糖苷酶。

由以上附圖和實施例可見，本發明所述螢光探針因其具有的雙光子吸收性能和比率螢光特性而能夠有效識別體外試管溶液體系及複雜生物體系中的β-半乳糖苷酶。