植物中有關硝酸鹽水平的轉錄因子及其使用方法

2023-05-26 09:38:21 2

植物中有關硝酸鹽水平的轉錄因子及其使用方法
【專利摘要】本公開涉及植物氮源應答。實施方案涉及有助於對植物中的氮源和/或它們的代謝物的應答的調節因子。
【專利說明】植物中有關硝酸鹽水平的轉錄因子及其使用方法
[0001] 優先權聲明
[0002] 本申請要求獲得於2012年3月5日提交的"植物中有關硝酸鹽水平的轉錄因子及 其使用方法"的美國臨時專利申請系列號61/606, 852的申請日的利益。

【技術領域】
[0003] 本公開涉及氮水平對植物中基因表達的影響。實施方案涉及有助於植物對環境中 的含氮分子的應答的基因和由它們編碼的調節因子。
[0004] 背景
[0005] 氮（N)是植物必需的大量營養素，其可得性是植物生長和作物產量的主要限制因 素。硝酸鹽（NO3)是有氧土壤植物無機氮的主要來源。見，例如Crawford和Glass(1998) TrendsPlantSci. 3:389-95 ;Hirsch和Sussman(1999)TrendsBiotechnol. 17:356-61。通 過特異性轉運蛋白，例如AtNRTLl(Tsayetal. (1993)Cell72:705-13) ;AtNRT1.2(Huang etal. (1999)PlantCell11:1381-92) ；AtNRT2.I(Littleetal. (2005)Proc.Natl.Acad. Sci.USA102:13693-8);和AtNRT2.2(Lietal. (2007)PlantPhysiol. 143:425-33)，利用 植物根系吸收硝酸鹽。一旦進入根細胞，硝酸鹽可分別通過硝酸鹽還原酶（NR)和亞硝酸 鹽還原酶（NIR)的作用而被還原為亞硝酸鹽（NO2-)，進而還原成銨鹽（NH4+)。Crawford和 Glass(1998)，同上。然後，通過穀氨醯胺合成酶（GS)和穀氨酸合成酶（GOGAT)循環，生成 的銨鹽被同化為穀氨酸和穀氨醯胺。Stitt(1999)Curr.Opin.PlantBiol. 2:178-86。
[0006] 在擬南芥中，硝酸鹽用作營養素，還用作控制基因表達和發育應答的有力信號。 Vidal和Gutierrez(2008)Cu;r;r·Opin.PlantBiol. 11:521-9;Krouketal. (2010a)Curr· Opin.PlantBiol. 13:266-73;Tsayetal.(2011)Annu.Rev.PlantBiol. 62:207-26。在 擬南芥中，硝酸鹽和亞硝酸鹽可用作調節全局基因表達的信號。Wangetal. (2007)Plant Physiol. 145:1735-45。關於亞硝酸鹽的信號效應知之甚少，且特異性功能不與亞硝酸 鹽-應答基因相關聯。然而已經提出，擬南芥根系中的硝酸鹽-感測系統能識別亞硝酸鹽 和硝酸鹽，因為這兩種信號具有廣泛的重疊應答。見上文.
[0007] 擬南芥中的硝酸鹽應答基因有數量繁多且種類多樣，包括硝酸鹽轉運蛋白 NR和NIR、轉錄因子、脅迫應答基因、涉及N/C平衡的碳（C)同化酶、以及其產物參與 信號轉導途徑的基因。Vidal和Gutierrez(2008)，同上；Krouketal. (2010a),同 上；Tsayetal. (2010)，同上。轉錄組學分析已經鑑定出許多擬南芥硝酸鹽應答基 因。Wangetal. (2003)PlantPhysiol. 132:556-7;Scheibleetal. (2004)Plant Physiol. 136:2483-99；ffangetal. (2004)PlantPhysiol. 136:2512-22；Gutierrezet al. (2007)GenomeBiol.8:R7.然而，僅有少數涉及引起硝酸鹽應答的調節因子已鑑定。
[0008] 已經提出硝酸鹽轉運蛋白NRTL1為擬南芥中的硝酸鹽傳感器。Hoetal. (2009) Cell138:1184-94。另外，已經描述NIN樣蛋白7轉錄因子涉及硝酸鹽同化作用的調節 (Castaingsetal.(2009)PlantJ. 57:426-35)，而ANR1MADS盒基因已被鑑定為應答於 外部硝酸鹽的側根生長的調節子（Zhang和Forde(1998)Science279:407-9)。此外，發 現一種類鈣調磷酸酶B亞基（CBL)-互作蛋白激酶（CIPK)基因，CIPK8,涉及硝酸鹽感測。Huetal.(2009)PlantJ.57:264-78。還有，發現抑制N應答基因的LBD37/38/39 轉錄因 子是硝酸鹽攝取和同化所需要的。Rubinetal. (2009)PlantCell21:3567-84。更近來 發現，硝酸鹽應答性iR393/AFB3模塊應答於擬南芥外部和內部N可得性而控制根繫結構 (Vidaletal. (2010b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA107:4477-82)，並且有一種負責側根結 構控制的、由根中的穀氨醯胺導致的細胞特異性調節被歸因於miR167/ARF8模塊（Gifford etal. (2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:803-8) 〇
[0009] 發明公開
[0010] 本文中描述了新的氮應答調節因子TGAl和TGA4。TGAl和TGA4介導涉及氮攝取 和還原的基因的表達的氮調節。在實施方案中，這些轉錄因子可以用來改變氮的吸收和同 化，影響根組織的生長，和/或影響植物的生長和生產力。
[0011] 在tgal/tga4雙突變體中觀察到初生根和側根生長受到影響，表明在硝酸鹽存在 下促進根生長的積極作用。因此，在一些實施方案中，例如，在氮受到限制的條件下，可利用TGAl和/或TGA4來促進植物初生根和/或側根的生長。
[0012] 在tgal/tga4雙突變體植物中，幾乎所有（97% )被鑑定為在TGAl和TGA4的調節 控制之下的基因都是被氮調節。因此，在一些實施方案中，可利用TGAl和/或TGA4應答於 氮而基因（例如，在圖5中鑑定的基因）的表達。例如，在特定的實施方案中，可利用TGAl 和/或TGA4來影響硝酸鹽轉運蛋白NRT2. 1、NRT2. 2,和/或亞硝酸鹽還原酶NIR的表達。 在特定的實施方案中，可利用TGAl和/或TGA4來與TGAl或TGA4結合基序可操作連接的 基因的表達。
[0013] 在一些實施方案中，在本文中描述的方法中使用的TGAl多肽可包含選自SEQID NO: 1-10的胺基酸序列或與SEQIDNO: 1-10中的一者或多者享有序列同一性的同源物。在 一些實施方案中，在本文中描述的方法中使用的TGA4多肽可包含選自SEQIDN0:ll-14的 胺基酸序列或與SEQIDNO: 11-14中的一者或多者享有序列同一性的同源物。在一些實施 方案中，在本文中描述的方法中使用的核酸可包含編碼TGAl或TGA4多肽的核苷酸。
[0014] 一些實施方案包括轉基因植物或其後代，所述轉基因植物或其後代包含異源TGAl 多肽和/或TGAl編碼核酸、和/或異源TGA4多肽和/或TGA4編碼核酸。在特定的實施方 案中，異源TGAl-和/或TGA4-編碼核酸在轉基因植物或其後代中表達。在某些實施方案 中，其中該異源TGAl-和/或TGA4-編碼核酸被表達的組織是根。根據一些實施方案的方 法包括，使前述轉基因植物或其子代在具有有限氮源的環境條件下生長。在一些實例中，包 含異源TGAl和/或TGA4多肽和/或異源TGAl-和/或TGA4-編碼核酸的轉基因植物或後 代在氮受限條件（例如，低氮條件）下展示出增強的生長和/或耐受。
[0015] 一些實施方案包括用於產生其中初生根和/或側根生長被促進的植物的方法。這 種方法可以包括,例如但不限於,將TGAl-和/或TGA4-編碼核酸（例如在載體中）導入植 物、或其細胞或組織中；任選地培養所述細胞或組織以產生植物；和選擇初生根和/或側根 生長被促進的植物。在一些實例中，選擇的植物在氮受限條件下培養。
[0016] 在一些實施方案中，在本文所述方法中使用的植物可以是擬南芥種類。在一些 實施方案中，該植物可以選自下組：十字花科（Brassicaceae);豆科（Fabaceae);禾本科 (Poaceae);爺科（Solanaceae);葡萄科（Vitaceae);大戟科（Euphorbiaceae);楊柳科 (Salicaceae);和桃金孃科（Myrtaceae)。通過任何上述方法獲得的植物、植物材料、植物 細胞、和種子也是特定實施方案的特徵。
[0017] 附圖簡要說明
[0018] 圖1包括TGAl和TGA4對硝酸鹽和硝酸鹽還原下遊信號的應答的圖解。圖IA包括 野生型"Col-Ο"植物中的TGAl的硝酸鹽應答。圖IB包括"Col-Ο"植物中的TGA4的硝酸 鹽應答。圖IC包括NR缺失突變植物中的TGAl的硝酸鹽應答。圖ID包括NR缺失突變植 物中的TGA4的硝酸鹽應答。TGAl(E)和TGA4 (F)基因的硝酸鹽應答。TGAl(G)和TGA4 (H) 基因的銨應答。星號（*)指示在對照條件和處理條件之間顯著不同的均值（P〈〇. 05)。
[0019] 圖2包括與銨比較的TGAl和TGA4的亞硝酸鹽應答的圖解。圖2A包括TGAl的 亞硝酸鹽應答。圖2B包括TGA4的亞硝酸鹽應答。圖2C顯示TGAl的銨應答的缺乏。圖 2D顯示TGA4的銨應答的缺乏。星號（*)表示在對照條件和處理條件之間顯著不同的均值 (Ρ〈0· 05)。
[0020] 圖3包括TGAl和TGA4應答於硝酸鹽對初生根和側根生長的影響的圖解。圖3Α 包括tgal/tga4植物和Col-O植物的初始（initiating)和萌發（emerging)側根的數量。 圖3B包括Col-0、tgal、tga4、和tgal/tga4植物當用KNO3或KCl處理時在第15天測量的 初生根長度。條形代表標準差。不同的字母指示統計學差異均值（P〈〇. 05)。
[0021] 圖4包括在中柱鞘細胞中TGAl和TGA4的硝酸鹽調節的圖解。圖4A包括通過 RT-qPCR測定的來自用KNO3或KCl處理2小時的幼苗的中柱鞘細胞中TGAlmRNA的相對 量。圖4B包括通過RT-qPCR測定的來自用KNO3或KCl處理2小時的幼苗的中柱鞘細胞中 TGA4mRNA的相對量。所標繪的值為三個重複的均值土標準差。星號（*)指示在處理之間 顯著不同的均值（P〈〇. 05)。
[0022] 圖5包括由TGA1/TGA4控制的硝酸鹽應答基因網絡的表示，包括在N代謝中涉及 的基因。個體基因顯示為三角形（轉錄因子）和正方形（靶基因）。綠色線條指示預測的 轉錄激活，而紅色線條指示預測的轉錄抑制。細線條指示在相應基因上遊區域中的一個轉 錄因子結合部位，而粗線條指示該結合部位的過度表現（over-representation)。箭頭指 示正調節，而在末端具有垂直線的邊緣指示負調節。基於功能將節點進行顏色編碼：發信號 (紫色）；未知基因（白色）；脅迫應答（青色）；氮代謝（黃色）；和其他功能（灰色）。
[0023] 圖6包括TGAl和TGA4對NIR、NRT2. 1和NRT2. 2基因的硝酸鹽依賴性上調的影 響的圖解。圖6A包括在用KNO3或KCl處理所指示的時間的Col-O和tgal/tga4植物中的 NRT2.ImRNA轉錄物水平。圖6B包括在用KNO3或KCl處理所指示的時間的Col-O和tgal/ tga4植物中的NRT2. 2mRNA轉錄物水平。圖6C包括在用KNO3或KCl處理所指示的時間的 Col-O和tgal/tga4植物中的NIRmRNA轉錄物水平。
[0024] 圖7包括TGAl以硝酸鹽依賴方式與NRT2. 1和NRT2. 2啟動子區結合的圖解。使 用抗TGAl免疫沉澱包含NRT2. 1和NRT2. 2啟動子的DNA。使用非特異性IgG作為陰性對 照。使用針對NRT2. 1和NRT2. 2啟動子區設計的引物，通過定量PCR將免疫沉澱的啟動子 DNA定量。
[0025] 圖8展示，在chi1-5和chi1-9突變體中，應答於硝酸鹽的TGAl和TGA4的表達受 到影響。以ImM銨作為唯一氮源，以水培方式培養Col-0、chll-5、chll-9和TlOlD植物。 在第15天的光周期開始時，用5mMKN03或作為對照的5mMKCl處理植物所示的時間。分 離RNA並通過RT-qPCR測量mRNA水平。使用網格蛋白基因（At4g24550)作為標準化參考。 (A)TGAl轉錄物水平，（B)TGA4轉錄物水平。所標繪的值相應於三個獨立生物重複的均值土 標準差。星號指示在突變植物與野生型植物之間顯著不同的均值（P〈〇. 05)。
[0026] 圖9展示了在初生根的維管組織和側根中表達的TGAl和TGA4。以ImM銨作為 唯一氮源，以水培的方式培養PTGA1:⑶S和pTGA4:⑶S品系兩周，用5mMKN03或KCl處 理兩個小時，進行染色以測定⑶S活性。5mMKN03處理的pTGAl:⑶S(A)、5mMKCl處理的 pTGAl:⑶S(B)、5mMKN03 處理的pTGA4:⑶S(C)、以及 5mMKCl處理的pTGA4:⑶S(D)。用硝 酸鹽處理的PTGAl:⑶S植物的初生根的成熟部分的橫截面（E)以及從初生根萌發的側根的 縱截面（G)。來自用硝酸鹽處理的pTGA4:GUS植物的初生根的成熟部分的橫截面（F)以及 側根和初生根的縱截面（H)。（比例尺：〇.Imm.)。在（E)和（F)上的數字表示：1為中柱，2 為內皮層。在每種基因型的八個獨立轉基因品系中觀察到相似的定位模式。
[0027]圖10展示了以ImM銨作為唯一N源，以水培方式培養兩周的表皮（Epi)、皮層、內 皮層（Endo)、中柱鞘（Peri)和中柱GFP標記品系的TGAl和TGA4轉錄物水平，其中在第15 天用5mMKN03或5mMKCl處理幼苗2小時。
[0028] 圖11展示了NTR2. 1、NRT2. 2和NIR基因的由硝酸鹽所致的細胞特異性調節。以 ImM銨作為唯一N源，以水培方式培養表皮（Epi)、皮層、內皮層（Endo)、中柱鞘（Peri)和中 柱GFP標記品系兩周。在第15天的黎明，用5mMKNO3或5禮KCl處理幼苗2小時。分離總 RNA並利用RT-qPCR測量NRT2. 1、NRT2. 2和NIR的mRNA水平。展示了 ：(A)NRT2. 1轉錄物 水平；(B)NRT2. 2轉錄物水平；和（C)NIR轉錄物水平。
[0029] 圖12展示在低硝酸鹽濃度處理下，TGAl和TGA4對NRT2. 1和NRT2. 2表達的調節。 以ImM銨作為唯一氮源，以水培方式培養Col-O和gal/tga4植物。在第15天的光周期開 始時，用250μMKNO3或作為對照的5μMKCl處理植物2小時。分離RNA並通過RT-qPCR 測量mRNA水平。展示了 ：(A)NRT2. 1轉錄物水平；(B)NRT2. 2轉錄物水平；和（C)Col-O和 tgal/tga4植物的淨硝酸鹽攝取。
[0030] 圖13展示了暴露於5mMKNO3或5mMKCl指示的時間的TGA家族成員的硝酸鹽應 答。
[0031] 圖14展示了對暴露於5mMNH4Cl或5mMKCl指示的時間的植物上的⑶H2的影響。
[0032] 圖15展示了在暴露於5mMKNO3或5mMKCl指示的時間的chll-5和TlOlD突變 體中NRT2. 1應答於硝酸鹽的表達。
[0033] 圖16展示了用5mM KNO3或5mM KCl處理的Col-O和gal/tga4植物的NIAl基因 的mRNA水平的硝酸鹽依賴性上調。
[0034] 實施本發明的模式
[0035]I.若干實施方案概述
[0036] 硝酸鹽攝取和同化基因的轉錄調節對於植物是非常重要的，因為硝酸鹽同化是一 種能量需求過程，必須與其他代謝和生理過程適當協調，以便使植物在變化的環境中最優 地生長。本文中披露了轉錄因子TGAl和TGA4在植物應答於硝酸鹽的情況下的新作用。
[0037] 利用一種整合生物信息學方法，將TGAl和TGA4鑑定為在擬南芥根中介導氮應答 的調節因子。在根器官中進行硝酸鹽和亞硝酸鹽處理之後，TGAlmRNA和TGA4mRNA迅速積 累。TGAl和TGA4涉及受硝酸鹽調節的初生根和側根生長，並且通常硝酸鹽處理對NRT2. 1、 NRT2. 2和NIR基因的誘導需要TGAl和TGA4。tgal/tga4雙突變體植物的表型分析表明，TGAl和TGA4對於硝酸鹽依賴性初生根生長和硝酸鹽依賴性側根生長都是必需的。全局 基因表達分析揭示，97%的在tgal/tga4雙突變體中具有表達改變的基因受硝酸鹽處理調 節，表明TGAl和TGA4轉錄因子在根的硝酸鹽應答中具有特殊作用。
[0038] 在依賴於TGAl和TGA4來進行基因表達的正常氮調節的硝酸鹽應答基因中，鑑定 了硝酸鹽轉運蛋白基因NRT2. 1、NRT2. 2,和亞硝酸鹽還原酶（NIR)基因。通過染色質免疫 沉澱測定，驗證了TGAl與這些靶基因的啟動子上的相關DNA序列特異性結合。
[0039]TGA因子牽涉針對病原體攻擊的植物防禦、脅迫應答（Kesarwaniet al. (2007)PlantPhysiol. 144:336-46)和花葯發育（Murmuetal. (2010)Plant Physiol. 154:1492-1504)。然而，TGA轉錄因子以前未曾與硝酸鹽應答或任何營養素應答 相關聯。因此，本公開闡明了氮與涉及TGAl和TGA4轉錄因子的防禦信號之間的一種新的、 未被預見過的相互作用。
[0040] 基於描述於本文實施例中的轉錄組學數據的網絡分析可知，先前所述的涉及硝 酸鹽應答調節的基因都不會在TGAl和TGA4的下遊。參見Vidaletal. (2010a)Wiley Interdiscip.Rev.Syst.Biol.Med. 2:683-93。同樣，根據先前的全局基因表達分析可知， CIPK8、NLP7和LDB37/38/39水平的改變對於應答於硝酸鹽的TGAl或TGA4表達沒有影響。 見Castaingsetal. (2009)，同上；Huetal. (2009)，同上；Rubinetal. (2009)，同上。 由此可見，TGAl和TGA4可能在一種與業已表徵的途徑不同且獨立於它們的途徑中起作用 來調節硝酸鹽和/或亞硝酸鹽應答。
[0041]II.縮寫
[0042]ANOVA 方差分析
[0043]bZIP 鹼性亮氨酸拉鏈結構域
[0044] BLASTK)基本局部比對搜索工具
[0045] ChIP 染色質免疫沉澱
[0046]ELISA 酶聯免疫吸附測定
[0047]EMSA 電泳遷移率變動分析
[0048]FACS 螢光激活細胞分選
[0049]FDR 錯誤發現率
[0050]NCBI 美國國家生物技術信息中心
[0051]PCR 聚合酶鏈反應
[0052] qPCR 定量聚合酶鏈反應
[0053] RMA 穩健多陣列分析
[0054]RT-PCR 逆轉錄聚合酶鏈反應
[0055]III.術語
[0056] 為了便於概述本公開的各種實施方案，提供了以下特殊術語解釋：
[0057] 內源的：如本文中使用的，術語"內源的"是指起源於特定生物、組織、或細胞之內 的物質（例如核酸分子和多肽）。例如，在植物細胞中表達的"內源"多肽可以是指通常在 與相同物種非基因工程植物相同的類型的細胞中表達的多肽。同樣，在植物細胞中包含的 "內源"核酸可以是指通常在與相同物種非基因工程植物相同的類型的細胞中發現的核酸 (例如，基因組DNA)。例如，"天然"或"內源"核酸為不含這樣一種核酸元件的核酸（例如 基因），所述核酸元件不同於通常在染色體或其他遺傳物質（其上通常自然發現核酸）中存 在的核酸元件。內源基因轉錄物由在其天然染色體基因座上的核苷酸序列編碼，且並非人 工供應給細胞。
[0058] 相反，相對於多核苷酸的核苷酸序列和/或基因組定位、以及相對於多肽的氨基 酸序列和/或細胞定位而言，"外源"或"異源"分子是對於一個指定的系統（例如種質、品 種、優良品種、和/或植物）而言不是天然的分子。在實施方案中，外源或異源多核苷酸或 多肽可以是已經被人工供應給某個生物系統（例如植物細胞、植物基因、特定的植物種類 或品種、和/或植物染色體）中且對於該特定的生物系統而言不是天然的分子。因此，核酸 被指定為"外源"可表示該核酸起源於天然存在的來源之外的來源，或可表示該核酸具有非 天然的構型、基因定位或元件排列。
[0059] 表達：如本文中使用的，編碼序列（例如基因或轉基因）的"表達"是指這樣的過 程，通過該過程，核酸轉錄單元（包括例如基因組DNA或cDNA)的編碼信息被轉化為細胞的 運作性部分、非運作性部分、或結構部分（例如蛋白質）。基因表達可能受到外部信號的影 響，例如細胞、組織、或生物暴露於某種增加或降低該細胞、組織、或生物中包含的基因的表 達的因素。基因表達也可以在從DNA到RNA再到蛋白質的途徑中的任何位置受到調節。例 如，通過控制對轉錄、翻譯、RNA運輸和加工、中間分子比如mRNA的降解的作用，和/或通過 在特異性蛋白分子以已經產生之後的活化、失活、區室化、或降解，或任何前述項的組合，由 此發生基因表達的調節。通過本領域已知的方法，包括但不限於，Northern印跡、RT-PCR、 Western印跡以及體外、原位或體內蛋白活性測定，可以在RNA水平或蛋白質水平測量基因 表達。
[0060] 增加表達：如本文中使用的，術語"增加表達"是指表達的起始、以及從模板構建體 產生的表達產物的量的定量增加。在一些實施方案中，可以向細胞或生物提供至少一種異 源基因，所述細胞或生物另外包含相同基因的內源拷貝，從而增加由該基因編碼的多肽的 表達。在這樣的實施方案中，通過將在包含該異源基因和內源基因的細胞中產生的多肽的 量與在僅僅包含該內源基因的細胞中產生的量進行比較，可以確定表達的增加。在一些實 施方案中，可以向細胞或生物提供影響轉錄的第一多肽（例如TGAl和/或TGA4)，從而增加 由在該第一多肽控制下的基因編碼的第二多肽的表達。在這樣的實施方案中，通過將在存 在該第一多肽的情況下從該基因產生的多肽的量與在不存在該第一多肽的情況下從該基 因產生的量進行比較，可以確定表達的增加。在一些實施方案中，可將調節序列與基因可操 作連接，從而增加該基因的表達。在這樣的實施方案中，通過將在該調節序列與基因可操作 連接之後從該基因產生的多肽的量與在該調節序列可操作連接或導入之前從該基因產生 的量進行比較，可以確定表達的增加。
[0061] 異源的：如本文中使用的，術語"異源的"是指不是來源於特定生物、組織、或細胞 之內的物質（例如核酸分子和多肽）。例如，在植物細胞中表達的"異源"多肽可以是指通 常在相同物種的非基因工程植物的相同類型的細胞中不表達的多肽（例如，在相同生物的 不同細胞中或者在不同生物的細胞中表達的多肽）。
[0062] 分離的："分離的"生物組分（例如，核酸或多肽）已經與該組分天然存在的生物 細胞中的其它生物組分（例如，其它染色體或染色體外DNA和RNA，和蛋白質）實質上分離、 與之分別產生、或從之純化出來，在分離、產生和純化的同時實現了該組分的化學或功能變 化。例如，核酸可以通過斷裂連接該核酸與染色體中其餘DNA的化學鍵而從染色體分離。已 經"分離的"核酸分子和蛋白可包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術語包 括通過在宿主細胞內重組表達製備的核酸和蛋白，以及化學合成的核酸分子、蛋白和肽。 [0063] 氮限制條件：如本文中使用的，術語"氮限制條件"是指其中在土壤或培養基中具 有受限量的氮源（例如硝酸鹽和銨）的條件。在一些實例中，該量"限制"在從〇.〇到〇.2mM的氮濃度範圍；例如從〇到〇.ImM，從〇到〇. 〇3mM，和從0到0. 05mM的氮濃度範圍。
[0064] 核酸分子：如本文中使用的，術語"核酸分子"可以是指核苷酸的聚合物形式，可包 括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈，以及上述者的合成形式和混合聚合物。核苷酸 可以指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸的任一者的修飾形式。如本文中 使用的"核酸分子"與"核酸"和"多核苷酸"是同義詞。除非另外指明，核酸分子通常在長 度上具有至少10個鹼基。該術語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。核酸分子可以包括天然存 在的核苷酸或/和通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸聯接而連接在一起的修飾核苷 酸。正如本領域技術人員易於理解的，核酸分子可被化學修飾或生物化學修飾，或者可以含 有非天然或衍生的鹼基。
[0065] 一些實施方案採用了特殊的核酸形式，即寡核苷酸（例如"引物"寡核苷酸）。寡 核苷酸是相對較短的核酸分子，通常包含50個或更少的核鹼基（nucleobases)(雖然一些 寡核苷酸可包含50個以上）。該寡核苷酸可以通過切割（例如限制性消化）較長的包含該 寡核苷酸序列的核酸而形成，或者可從單獨的核苷亞磷醯胺以序列特異性方式化學合成。 [0066] 可將寡核苷酸用作探針序列，以檢測包含特定核苷酸序列的核酸分子。根據上文， 可通過合成或克隆來製備寡核苷酸探針。適合的克隆載體是本領域技術人員已知的。寡核 苷酸探針可以是標記的或未標記的。存在多種用於標記核酸分子的技術，包括例如，但不限 於藉助於切口平移的放射性標記術；隨機引物法（randompriming);以及藉助於末端脫氧 轉移酶的加尾法，其中所採用的核苷酸是標記的，例如，用放射性32P標記。可以使用其他標 記物，例如包括，但不限於：螢光團；酶；酶底物；輔酶；和酶抑制劑。或者，提供可檢測信號 的標記物的應用（單獨地或與其他反應劑聯合）可以用與受體結合的配體代替，其中所述 受體被標記（例如，藉助於以上指示的標記物），以便通過它們自身或與其他試劑結合而提 供可檢測信號。見，例如Learyetal. (1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4045-9。
[0067] 本發明的一些實施方案包括與核苷酸靶序列"能夠特異性雜交"或"特異性互補" 的多核苷酸。"能夠特異性雜交"或"特異性互補"是這樣的術語，它們表明足夠程度的互補 性，使得在該多核苷酸與包含該特定的核苷酸靶序列的核酸分子之間發生穩定且特異的結 合。核酸分子與其能夠特異性雜交的靶序列不需要是100%互補的。當存在足夠的互補程 度時，核酸分子可特異性地雜交，以便避免核酸在期望特異性結合的情況下（例如在嚴格 雜交條件下）與非靶序列的非特異性結合。
[0068] 產生特定嚴格程度的雜交條件將取決於所選擇的雜交方法的性質以及雜交核 酸序列的組成和長度而變化。通常，雜交溫度和雜交緩衝液的離子強度（尤其是Na+和 /或Mg++濃度）有助於雜交的嚴格性，儘管洗滌時間也影響嚴格性。關於達到需要的 特定嚴格性程度所需的雜交條件是本領域普通技術人員已知的，並且在例如Sambrook etal. (ed.)MolecularCloning:ALaboratoryManual, 2nded. ,vol. 1-3,ColdSpring HarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY， 1989,chapters9and11;以及Hames和Higgins(eds.)NucleicAcidHybridization，IRLPress,Oxford, 1985 中有 論述。關於核酸雜交的進一步詳細說明和指導例如可見於Tijssen，"Overviewof principlesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays，，'in LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-Hybridization withNucleicAcidProbes，PartI，Chapter2,Elsevier，NY，1993 ; 和Ausubelet al.，Eds.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter2,GreenePublishing andWiley_Interscience，NY， 1995。
[0069] 如本文中使用的，"嚴格條件"涵蓋這樣的條件，在此類條件下，只有當雜交分子與 DNA靶之間的錯配小於25%時才發生雜交。"嚴格條件"包括其他的具體嚴格性水平。因 此，如本文中使用的，"輕度嚴格性"條件為具有25%以上序列錯配的分子不會雜交的條件； "中等嚴格性"條件為具有15%以上錯配的分子不會雜交的條件；並且"高等嚴格性"條件 為具有10%以上錯配的序列不會雜交的條件。"非常高的嚴格性"條件為具有6%以上錯配 的序列不會雜交的條件。
[0070] 在特定的實施方案中，嚴格條件為：在65°C在雜交緩衝液（例如6x鹽水-檸檬酸 鈉（SSC)緩衝液、5xDenhardt溶液、0. 5%SDS、和100μg剪切的鮭睪丸DNA)中雜交過夜， 然後在65 °C在0.IXSSC/0. 1%SDS中40分鐘順序洗滌。
[0071] 可操作連接的核苷酸序列：當第一核苷酸序列與第二核苷酸序列有功能關係時， 該第一核苷酸序列與該第二核苷酸序列"可操作連接"。例如，如果啟動子影響編碼序列的 轉錄或表達，則該啟動子與該編碼序列可操作連接。當以重組方式產生時，可操作連接的核 苷酸序列之間通常是連續的，並且在有必要將兩個蛋白質編碼區連接在一起的情況下，處 於相同的閱讀框內。然而，可操作連接的核苷酸序列不一定必須是連續的。
[0072] 在有關基因調節序列和編碼序列的情況下使用時，術語"可操作連接"意味著該調 節序列影響該連接的編碼序列的表達。"調節序列"或"控制元件"是指影響轉錄的周期和 水平/量、RNA加工或穩定性、或可操作連接的編碼序列的翻譯的核苷酸序列。常規的調節 序列例如包括，但不限於，5'非翻譯區；啟動子；翻譯前導序列；內含子；增強子；莖環結構； 阻遏物結合蛋白；終止序列；和多腺苷酸化識別序列。特定的調節序列可位於與其可操作 連接的編碼序列的上遊和/或下遊。並且，與編碼序列可操作連接的特定調節序列可位於 雙鏈核酸分子的相關互補鏈上。
[0073] 與編碼序列"可操作連接"的元件不限於啟動子或其他常規的調節序列。例如，在 一些實施方案中，轉錄因子多肽（例如TGAl或TGA4)可與位於編碼序列的上遊或下遊的核 苷酸序列結合，以影響該編碼序列的轉錄。在這樣的實例中，儘管在不存在轉錄因子的情況 下該核苷酸序列可能完全不影響該編碼序列的轉錄，與轉錄因子多肽結合的核苷酸序列仍 然與該編碼序列"可操作連接"。
[0074] 調節元件：如本文中使用的，術語"調節元件"是指具有基因調節活性的核酸分子； 艮P，具有影響可操作連接的可轉錄核酸分子的轉錄或翻譯的能力的核酸分子。調節元件，例 如啟動子、前導序列、內含子、和轉錄終止區，為具有基因調節活性的非編碼核酸分子，它們 在活細胞的總體基因中扮演不可或缺的角色。因此，通過分子工程技術，在植物中起作用的 分離的調節元件可用於修飾植物表型。因此，"調節元件"可以是決定特定基因是否表達、 表達時間和表達水平一系列核苷酸。在一些實例中，調節元件是與調節蛋白例如TGAl和/ 或TGA4特異性地相互作用的DNA序列。
[0075] 如本文中使用的，術語"基因調節活性"是指由核酸分子或多肽對可操作連接的核 酸分子的轉錄或翻譯所施加的作用。具有基因調節活性的分離的核酸分子可以提供可操作 連接的核酸分子的時序表達或空間表達、和/或調節表達水平和速率。在本文中描述的一 些實例中，TGAl和/或TGA4被提供為具有基因調節活性的多肽，其增加至少一種與特異性 地結合TGAl和/或TGA4多肽的調節DNA元件可操作連接的核苷酸序列的表達。
[0076]啟動子：如本文中使用的，術語"啟動子"是指可以在轉錄起始上遊的、且可能涉及 RNA聚合酶與其他蛋白質的識別和結合而影響轉錄的DNA區域。啟動子可與用於在細胞中 表達的編碼序列可操作連接，或者啟動子可與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所 述核苷酸序列可與用於在細胞中表達的編碼序列可操作連接。"植物啟動子"可以是能夠啟 動植物細胞轉錄的啟動子。
[0077] 在發育控制下的啟動子的實例包括優先啟動某些組織中的轉錄的啟動子，所述組 織例如但不限於，葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織。這樣的啟動子稱為"組 織優選性"啟動子。僅啟動某些組織中的轉錄的啟動子被稱為"組織特異性"啟動子。"細 胞類型特異性"啟動子主要影響一個或多個器官中某些細胞類型（例如但不限於根或葉 中的維管細胞）中的轉錄。組織特異性或組織優先啟動子的實例，例如包括，但不限於，根 優選性啟動子（例如菜豆蛋白基因啟動子）；葉特異性和光誘導啟動子，例如來自cab或 rubisco的啟動子；花葯特異性啟動子，例如來自LAT52的啟動子；花粉特異性啟動子，例如 來自Zml3的啟動子；和花粉粒優選性啟動子，例如來自apg的啟動子。
[0078] "誘導型"啟動子可以是在環境控制之下的啟動子。見Wardetal. (1993)Plant Mol.Biol. 22:361-366。可通過誘導型啟動子啟動轉錄的環境條件的實例，包括例如，但不 限於，厭氧條件和光的存在。利用誘導型啟動子，轉錄速率應答於誘導劑而增加。誘導型啟 動子的實例包括但不限於，來自應答於銅的ACEI系統的啟動子；應答於苯磺醯胺除草劑安 全劑的來自玉米的In2基因啟動子；來自TnlO的Tet阻遏物；和來自留體激素基因的誘導 型啟動子，其轉錄活性可被糖皮質激素誘導（Schenaetal. (1991)Proc.Natl.Acad.Sci. USA88:0421)。
[0079] 組織特異性啟動子、組織優選性啟動子、細胞類型特異性啟動子、和誘導型啟動子 構成"非組成型"啟動子類別。"組成型"啟動子是可在大多數環境條件下具有活性的啟動 子。組成型啟動子的實例例如包括，但不限於，植物病毒啟動子（例如來自花椰菜花葉病毒 (CaMV)的35S啟動子）；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU;MAS;玉米H3 組蛋白啟動子；和ALS啟動子，歐洲油菜ALS3結構基因的Xbal/Ncol片段5'（或與Xbal/ NcoI片段相似的核苷酸序列）（PCT國際專利公開No.WO96/30530)。
[0080] 任何前述組成型和非組成型啟動子均可在特定的實施方案中使用。例如，可以將 要被植物細胞中的硝酸鹽和/或亞硝酸鹽調節的基因提供給該植物細胞，其中該基因與特 異性結合TGAl和/或TGA4多肽和啟動子的調節DNA元件可操作連接。作為進一步的實例， 可向細胞提供TGAl或TGA4基因，其中該基因與組成型或非組成型啟動子可操作連接，從而 提供TGAl或TGA4基因的表達並賦予在該啟動子控制的情形下的擬南芥硝酸鹽應答屬性。
[0081] 序列同一性：在兩個核酸或多肽序列的情況下，如本文中使用的術語"序列同一 性"（或"同一性"）可以是指在指定比較窗口上以最大對應性對齊這兩個序列時在這兩個 序列中相同的殘基。
[0082] 如本文中使用的，術語"序列同一性百分比"可以是指通過在比較窗口上比較兩個 最優比對序列（例如核酸序列、和胺基酸序列）而確定的值，其中為了實現兩個序列的最優 對齊，在該比較窗口中的序列部分可以包含相比於參考序列（不包含添加或缺失）的添加 或缺失（即，空位）。通過確定相同核苷酸或胺基酸殘基出現在兩個序列中的位置的數目而 產生匹配位置的數目，用該匹配位置的數目除以比較窗口中的位置的總數，將結果乘以100 而產生序列同一性的百分比，從而計算出該百分比。
[0083] 用於比較的序列比對方法是本領域技術人員熟知的。各種程序和比對算法例 如描述於Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math. 2:482;Needleman和Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443;Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85: 2444 ; Higgins和Sharp(1988)Gene73:237-44;Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-3; Corpetetal. (1988)NucleicAcidsRes. 16:10881-90；Huangetal. (1992)Comp.Appl. Biosci. 8:155-65；Pearsonetal. (1994)MethodsMol.Biol. 24:307-31；Tatianaet al. (1999)FEMSMicrobiol.Lett. 174:247-50。序列比對方法和同源性計算的詳細描述可 見於例如Altschuletal. (1990)J.Mol.Biol. 215:403-10。
[0084] 美國國家生物技術信息中心（NCBI)基本局部比對搜索工具（BLAST?;Altschul etal. (1990))可從幾個來源獲得，包括網際網路，其與幾種序列分析程序結合使用。怎樣使 用該程序確定序列同一性的描述可在網際網路的BLAST?的"幫助"部分獲得。為了比較核酸 序列，可以採用利用默認參數的BLAST?(Blastn)程序的"Blast2序列"函數。在用這種方 法評估時，與參考序列具有較大相似性的核酸序列將顯示出同一性百分比的增加。
[0085] 如本文中關於核苷酸序列使用的，術語"基本上相同"可以是指85%以上相同的序 列。例如，基本上相同的核昔酸序列可以與參考序列至少85. 5% ;至少86% ;至少87% ;至 少88% ;至少89% ;至少90% ;至少91% ;至少92% ;至少93% ;至少94% ;至少95% ;至 少96% ;至少97% ;至少98% ;至少99% ;或至少99. 5%相同。
[0086] 特異性結合：如本文中關於多肽和蛋白質結構域使用的術語"特異性結合"是指在 多肽或蛋白質結構域與其結合伴侶（例如包含特異性核苷酸序列的核酸）之間的相互作用 足夠強，使其與結合伴侶而不與缺乏由特異性結合多肽識別的特定胺基酸序列或特定核苷 酸序列的其他分子發生特異性結合。可通過對於本領域技術人員而言的常規技術例如"下 拉（pulldown)"測定（例如GST下拉（pulldowns))、酵母-2-雜交測定、酵母-3-雜交測 定、ELISA等來確定穩定且特異性的結合。彼此具有"特異性結合"屬性可以被看作是與彼 此"特異性地結合"。
[0087] 轉化：如本文中使用的，術語"轉化"是指將一個或多個核酸分子轉移到細胞中。 當核酸分子通過核酸分子併入細胞基因組中、或通過附加型複製而由該細胞穩定複製時， 細胞被轉移到該細胞中的核酸分子"轉化"。如本文中使用的，術語"轉化"涵蓋所有可將核 酸分子導入這種細胞中的技術。實例包括但不限於：用病毒載體轉染；用質粒載體轉化；電 穿孔（Frommetal. (1986)Nature319:791-3);脂質體轉染$6]^11616七31.(1987)?1'〇(3· Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7);顯微注射（Muelleretal. (1978)Cell15:579-85) ;土壤 桿菌介導的轉移（Fraleyetal. (1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7);直接DNA 攝取；和微粒轟擊（Kleinetal. (1987)Nature327:70)。
[0088] 轉基因：外源核酸序列。在一些實例中，轉基因可以是編碼TGAl或TGA4多肽的序 列。在一些實例中，轉基因可編碼與特異性結合TGAl和/或TGA4的調節DNA元件可操作 連接的感興趣基因（例如報告基因或對農業上重要的植物性狀有貢獻的基因）。在這些和 其他實例中，轉基因可含有一個或多個與該轉基因編碼序列可操作連接的調節序列。為了 本公開的目的，當使用術語"轉基因的"來指稱一種生物時（例如植物），是指包含外源核酸 序列的生物。在一些實例中，包含外源核酸序列的生物可以是經由分子轉化技術導入了該 核酸序列的生物。在其他實例中，包含外源核酸序列的生物可以是通過例如基因滲入或異 花受粉導入了該核酸序列的生物。
[0089] 載體：如本文中使用的，術語"載體"是指可被導入細胞中（例如為了產生轉化細 胞）的核酸分子。載體可包括允許它在宿主細胞中複製（比如複製起點）的核酸序列。載 體的實例包括但不限於：質粒；粘粒；細菌噬菌體；和攜帶外源DNA進入細胞中的病毒。載 體還可包括一種或多種基因、反義分子、和/或選擇標記基因和本領域已知的其他遺傳元 件。載體可以轉導、轉化或感染細胞，由此引起細胞表達核酸分子和/或由該載體編碼的 蛋白質。任選地，載體包括輔助核酸分子實現進入細胞中的物質（例如脂質體、蛋白質包衣 等）。
[0090] 除非特別指明或暗示，如本文中使用的術語"一個"、"一種"和"該"表示"至少一 個/種"。
[0091] 除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術術語和科學術語具有與屬於本公開 的領域之內的普通技術人員通常所理解的相同的含義。在分子生物學中常用術語的定義 可見於例如LewinB. ,GenesV1OxfordUniversityPress, 1994(ISBN0-19-854287-9)； Kendrewetal. (eds. ).TheEncyclopediaofMolecularBiology.BlackwellScience Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9);和MeyersR.A. (ed. ).MolecularBiologyand Biotechnology:AComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
[0092]IV.氮應答調節因子TGAl和TGA4
[0093] 本公開提供了應用轉錄因子TGAl和TGA4的預料不到的新用途的組合物和方法。 如本文中公開的，TGAl和TGA4是應答於環境中某些氮源而影響許多特定的靶基因表達的 轉錄因子。因此，例如，TGAl和/或TGA4可以用來調節植物細胞、植物材料、植物組織、或 者植物的硝酸鹽和/或亞硝酸鹽應答。例如，可以利用本文中描述的TGAl和TGA4的特性， 來提供具有改變的硝酸鹽-和亞硝酸鹽-應答表型的轉基因植物，和提供其中感興趣基因 的表達被至少部分地被植物或植物細胞可利用的氮源（或其缺乏）所調節的轉基因植物或 植物細胞。例如，可在植物中表達或過表達TGAl和/或TGA4,以啟動和/或增加植物中初 生根和/或側根的生長。
[0094] -些實施方案包括TGAl鹼性亮氨酸拉鏈轉錄因子多肽。根據特定實施方案的 TGAl多肽包含當與SEQIDNO: 1(擬南芥TGAl)比對時顯示增加的百分比同一性的胺基酸 序列。在這些和其他實施方案內的具體胺基酸序列可包含與SEQIDNO: 1具有例如至少 約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 同一性的序列。例如，一些實施方案包括含有選自下組的胺基酸序列的TGAl多肽：SEQ IDN0:2(小鹽芥（Thellungiellahalophila));SEQIDN0:3(深山南芥（Arabidopsis lyrata));SEQIDNO: 4 (完菁（Brassicarapa));SEQIDNO: 5(Arabidopsisarenosa); SEQIDNO:6 (葡萄（Vitisvinifera));SEQIDNO:7 (菜豆（Phaseolusvulgaris));SEQ IDN0:8(漢藜苜猜（Medicagotruncatula));SEQIDN0:9(大豆）；和SEQIDN0:10(菌 麻（Ricinuscommunis))。
[0095] -些實施方案包括TGA4鹼性亮氨酸拉鏈轉錄因子多肽。根據特定實施方案的 TGA4多肽包含當與SEQIDNO: 11 (擬南芥TGA4)比對時顯示增加的百分比同一性的胺基酸 序列。在這些和其他實施方案內的具體胺基酸序列可包含與SEQIDNO: 11具有例如至少 約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 同一性的序列。例如，一些實施方案包括含有選自下組的胺基酸序列的TGA4多肽：SEQID N0:12(蒺藜苜蓿）；SEQIDN0:13(葡萄）；和SEQIDN0:14(玉米）。
[0096] 在許多實施方案中，包含當與SEQIDNO: 1(TGA1多肽）和/或SEQIDNO: 11 (TGA4 多肽）比對時具有上述序列同一性的多肽被包含在具有硝酸鹽-和亞硝酸鹽-應答調節活 性的肽或這樣的肽的一部分之內。例如，TGAl多肽可通過在序列資料庫中搜索與SEQID NO: 1具有閾值序列同一性的多肽序列來加以鑑定。例如，可以通過在序列資料庫中搜索與 SEQIDNO: 11具有一定序列同一性的多肽序列來鑑定TGA4多肽。可以通過本領域技術人 員已知的許多方法的任何一種（例如，利用NCBI的BLAST?工具），來搜索有用的序列數 據庫。通過許多種公共的和私有的商業來源，其他資料庫可用於許多植物和其他生物。本 領域技術人員會理解，TGAl和TGA4是同源蛋白質，因此，被鑑定為包含與SEQIDN0:1或 SEQIDNO: 11共享序列同一性的胺基酸序列的特定多肽也可以與SEQIDNOs: 1和11的另 一者共享序列同一'I"生。
[0097] -些實施方案包括含有編碼TGAl和/或TGA4多肽的核苷酸序列的核酸，例如上 文所述。例如，在一些實施方案中的核酸序列當與SEQIDN0:15(擬南芥TGAl)和/或 SEQIDNO: 16 (擬南芥TGA4)比對時顯示出增加的百分比同一性。在這些和其他實施方案 內的特異性核酸序列可包含與SEQIDNO: 15和/或SEQIDNO: 16具有例如但不限於至少 約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、81%、82%、83%、84%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 同一'I"生的序列。
[0098] 本領域的技術人員能夠容易地鑑定大量的包含編碼TGAl和/或TGA4多肽的核苷 酸序列的核酸。例如，根據密碼子簡併性，藉助於導入容許的核苷酸取代，可以例如修飾核 酸分子而基本上不改變所編碼的多肽的胺基酸序列。因此，應當理解的是，任何具有給定的 胺基酸序列的TGAl或TGA4多肽均可以被迅速反向工程化為許多種冗餘核苷酸序列的任何 一種。作為進一步的實例，編碼TGAl或TGA4多肽的基因可以選自許多可用的植物基因組 文庫、cDNA文庫、EST文庫等的任何一種（例如藉助於與SEQIDNO: 14或SEQIDNO: 15的 同源性、或藉助於編碼的多肽與SEQIDNOs: 1-14的一者或多者的序列相似性），或可以根 據在分子生物學領域中可靠且熟知的技術從生物中克隆這種基因。
[0099]對於TGAl多肽、TGA4多肽、以及編碼兩者之一的核酸分子，它們之中的任一者或 全部都可用於本發明的某些實施方案中。
[0100] 一些實施方案包括含有特異性結合TGAl和/或TGA4多肽的調節核苷酸序列的 核酸，從而賦予與該調節核苷酸序列可操作連接的核苷酸序列以硝酸鹽和/或亞硝酸鹽控 制。在一些實例中，特異性結合TGAl和/或TGA4多肽的調節核苷酸序列包含在內源擬南 芥啟動子中，所述啟動子來自被TGAl和/或TGA4調節的基因，例如但不限於選自下組的基 因：NRT2. 1、NRT2. 2、和NIR。可以通過本領域技術人員已知的任何技術，例如，染色質免疫 沉澱或EMSA，來檢測TGAl和/或TGA4多肽與調節核苷酸序列的特異性結合。
[0101] 在一些實施方案中，本發明的核酸分子包含基因調節元件（例如啟動子）。可以 基於其中要插入載體構建體的細胞的類型來選擇啟動子。在細菌、酵母、和植物中起作用 的啟動子是本領域熟知的。也可以基於它們的調節特徵來選擇這些啟動子。這種特徵的 實例包括：對轉錄活性、可誘導性、組織特異性、和發育階段特異性的增強。在植物中，可 誘導的、病毒或合成來源的、具有組成性活性、可時序調節的、和可空間調節的啟動子已經 有人描述。參見，例如Poszkowskietal.(1989)EMB0J.3:2719;0delletal. (1985) Nature313:810;和Chauetal. (1989)Science244:174-81)。
[0102] 有用的誘導型啟動子包括例如，通過應用安全劑（取代的苯磺醯胺除草劑）誘導 的由水楊酸或聚丙烯酸誘導的啟動子、熱激啟動子、源於菠菜硝酸鹽還原酶可轉錄核酸分 子序列的硝酸鹽誘導型啟動子、激素誘導型啟動子、和與RuBP羧化酶小亞基和LHCP家族相 關的光誘導型啟動子。
[0103] 其他有用的啟動子包括：胭脂鹼合酶啟動子、甘露鹼合酶啟動子、和章魚鹼合酶 啟動子，這些啟動子由根癌土壤桿菌的腫瘤誘導質粒攜帶；CaMV19S和35S啟動子；增強 的CaMV35S啟動子；玄參花葉病毒35S啟動子；來自1，5-二磷酸核酮糖-羧化酶小亞基 (ssRUBISCO)的光誘導型啟動子；來自菸草的EIF-4A啟動子（Mandeletal. (1995)Plant Mol.Biol. 29:995-1004);玉米蔗糖合成酶；玉米醇脫氫酶I;玉米捕光複合物；玉米熱激蛋 白；來自擬南芥的殼多糖酶啟動子；LTP(脂質轉移蛋白）啟動子；矮牽牛查爾酮異構酶；大 豆富甘氨酸蛋白（beanglycinerichprotein) 1 ;馬鈴薯塊莖特異蛋白（patatin);泛素啟 動子；和肌動蛋白啟動子。有用的啟動子尤其包括根特異性啟動子。
[0104] 為了獲得更高的異源基因表達，優選的是將所述基因再工程化，使其在表達宿主 細胞（例如植物細胞，例如加拿大油菜、水稻、菸草、玉米、棉花、和大豆）中更有效地表達。 因此，在設計編碼TGAl和/或TGA4多肽的用於植物表達的基因中，任選的額外步驟（即， 除了提供一個或多個基因調節元件之外）是針對優化表達將異源基因蛋白質編碼區再工 程化。特定的實施方案包括重新設計的擬南芥基因，所述擬南芥基因已被優化，使得該優化 的基因在來自第二植物種類的轉基因植物細胞中的表達水平相比於在來自用原始（即，未 修飾的）擬南芥基因序列轉化的第二植物種類的植物細胞中的表達水平得以增加（即，產 生更多的蛋白質）。
[0105] 由於由遺傳密碼的冗餘/簡併性（即，一些胺基酸由一個以上的密碼子指定）提 供的可塑性，在不同生物或生物類別中的基因組的演化已導致同義密碼子的使用頻率差 異。這種"密碼子偏好"反映在蛋白質編碼區的平均鹼基組成中。例如，基因組中G+C含量 相對較低的生物使用更多在同義密碼子第三位中具有A或T的密碼子，而G+C含量較高的 生物則使用更多在第三位是G或C的密碼子。此外，人們認為在mRNA中存在的"稀有"密 碼子可能會降低該mRNA的絕對翻譯速度，特別是當相應於該稀有密碼子的負載tRNA的相 對豐度較低時。這個推理的一個推論是，對於多個稀有密碼子而言，單個稀有密碼子對翻譯 速度的減少可能至少是疊加性的。因此，在特定表達宿主中具有高相對含量的稀有密碼子 的mRNA的翻譯速度會相應降低。該速度可能反映在所編碼蛋白的相應低水平上。
[0106] 在用於植物細胞（例如水稻、菸草、玉米、棉花、和大豆）中表達的編碼TGAl和/ 或TGA4多肽的優化基因的工程化過程中，如果已經確定預期宿主植物的密碼子偏好，將是 有幫助的。有很多公眾可訪問的DNA序列資料庫，在這些資料庫中可以找到有關植物基因 組的密碼子分布或各種植物基因的蛋白質編碼區的信息。
[0107] 密碼子偏好是表達宿主用於編碼其蛋白質的胺基酸的密碼子的統計分布。密碼子 偏好可以計算為單個密碼子相對於所有胺基酸密碼子的使用頻率。或者，密碼子偏好可以 計算為單個密碼子相對於特定胺基酸的所有其他密碼子（同義密碼子）被用來編碼所述氨 基酸的頻率。
[0108] 在設計用於植物表達的TGAl和/或TGA4多肽的優化編碼區的過程中，當存在多 種選擇時，應當確定所述植物優選的主要（"第一選擇"）密碼子、以及優選密碼子的第二、 第三、第四等選擇。然後，可設計編碼TGAl和/或TGA4多肽的胺基酸序列的新的DNA序 列，所述新的DNA序列與天然DNA序列（編碼該多肽的）的差異在於換用了表達宿主優選 的（第一優選的、第二優選的、第三優選的、或第四優選的等等）密碼子來指定在所述氨基 酸序列內的每個位置處的胺基酸。然後針對所述新的序列，分析可能已經通過修飾產生的 限制性酶切位點。對於鑑定出的假定限制性位點，通過用次一級優選密碼子代替這些密碼 子來加以修飾，以去除限制性位點。該序列中其它可能影響異源序列轉錄或翻譯的位點為： 外顯子：內含子接點（5'或3'）、多聚-A添加信號、和/或RNA聚合酶終止信號。可以對 序列進行進一步的分析和修飾，以減少TA或CG雙聯體（doublet)的頻率。除了這些雙聯 體之外，具有超過約6個相同的G或C核苷酸的序列區塊也會對該序列的轉錄或翻譯造成 不利影響。因此，通過用次一級優選的密碼子選擇來替換密碼子的第一或第二選擇等，對這 些區塊進行有利的修飾。
[0109] 如上所述的方法使得本領域的技術人員可以修飾對於特定植物而言為外源 性的基因，使得所述基因在植物中最優地表達。這種方法在PCT國際專利公開No.WO 97/13402A1中有進一步說明。因此，可以利用在功能上等同於一些實施方案的TGAl和/或 TGA4基因的優化的合成基因來轉化宿主，包括植物和植物細胞。此外，也可以在計算機上從 初始胺基酸序列產生TGAl-和TGA4-編碼核苷酸序列。更多有關合成基因產生的指導可見 於，例如，美國專利5, 380, 831。
[0110] 一旦在紙上或計算機上設計了TGAl-和/或TGA4-編碼核苷酸序列，可以在實驗 室中合成包含該序列的真實核酸分子，使之在序列上精確地與所設計的序列對應。可以對 這些合成的DNA分子進行克隆和進行其他操作，完全如同它們來自自然或天然的來源一 樣。
[0111] V.TGAl和/或TGA4介導植物氮應答
[0112] 一些實施方案利用如下發現：TGA1和TGA4對於正常的硝酸鹽調節的基因表達 (例如NRT2. 1、NRT2. 2和NIR的表達）、以及對於產生針對硝酸鹽和亞硝酸鹽的植物應答 是必需的。在特定的實施方案中，可以在細胞或生物中表達或過表達TGAl和/或TGA4多 肽，例如但不限於如下方式：將TGAl-或TGA4-編碼核酸導入細胞或生物中；將TGAl和/或TGA4多肽導入細胞或生物中；和/或提供足以促進TGAl和/或TGA4多肽表達的正信號或 負信號（通過這些信號在細胞或生物中與可操作連接於TGAl-或TGA4-編碼核酸的調節元 件的相互作用）。在另外的實施方案中，可以將TGAl和/或TGA4多肽敲除或使其在細胞或 生物中低表達，例如但不限於通過下述方式：破壞、突變、或失活化TGAl-和/或TGA4-編碼 核酸（例如TGAl和/或TGA4基因）；將靶向編碼TGAl和/或TGA4多肽的核酸的反義核 酸導入到細胞或生物中；以物理方式將TGAl和/或TGA4多肽從細胞或生物的細胞機構中 去除（通過用抗體或其他特異性結合蛋白結合TGAl和/或TGA4多肽）；和/或提供足以 降低或消除TGAl和/或TGA4多肽的表達的正信號或負信號（通過這些信號與細胞或生物 中可操作連接於TGAl-或TGA4-編碼核酸的調節元件的相互作用）。
[0113] 在一些實施方案中，TGAl和/或TGA4多肽可以在植物細胞或生物中表達或過表 達，從而促進硝酸鹽轉運蛋白NRT2. 1和NRT2. 2之一或兩者的表達。在另外的實施方案中， 可以從植物細胞或生物中去除或在其中低表達TGAl和/或TGA4多肽，從而減少或消除硝 酸鹽轉運蛋白NRT2. 1和NRT2. 2之一或兩者的表達。
[0114] 出於多種原因，可能希望增加NRT2. 1和/或NRT2. 2的表達。除了它的硝酸鹽轉 運功能之外，NRT2.1轉運蛋白起整合側根發生和側根生長的作用。Littleetal. (2005)， 同上；Remansetal.(2006)PlantPhysiol. 140:909-21。在補充有硝酸鹽的培養基中， nrt2.l/nrt2. 2擬南芥突變系顯示出側根伸長減弱。Lietal. (2007)，同上。因此，通過單 獨地改變TGAl和/或TGA4的表達，或者改變TGAl和/或TGA4的表達同時伴隨植物營養 狀態變化，來控制NRT2. 1和NRT2. 2水平，可導致根生長和植物中發育程序的改變。
[0115] 在一些實施方案中，TGAl和/或TGA4多肽可以在植物細胞或生物中表達或過表 達，從而促進至少一種其他氮應答基因的表達。例如，TGAl和/或TGA4多肽可以在植物細 胞或生物中表達或過表達，從而促進在圖5中描述的某種基因的表達。在另外的實施方案 中，可以從植物細胞或生物中去除或在其中低表達TGAl和/或TGA4多肽，從而減少或消 除至少一種其他氮應答基因的表達。例如，可以從植物細胞或生物中去除或在其中低表達 TGAl和/或TGA4多肽，從而減少或消除在圖5中描述的某種基因的表達。
[0116] 在一些實施方案中，可以控制TGAl和/或TGA4在植物細胞或植物中的表達，從而 影響初生根和/或側根生長（例如應答於硝酸鹽）。例如，可以在植物細胞或生物中表達或 過表達TGAl和/或TGA4多肽，從而刺激和/或增強初生根和/或側根生長。相反，可以從 植物細胞或生物中去除或在其中低表達TGAl和/或TGA4多肽，從而消除和/或減弱初生 根和/或側根生長（例如應答於硝酸鹽減弱初生根和/或側根生長）。
[0117] 在一些實施方案中，可以控制TGAl和/或TGA4在植物細胞或植物中的表達，從而 影響植物細胞或植物在氮受限條件下的生長。例如，可以在植物細胞或生物中表達或過表 達TGAl和/或TGA4多肽，從而刺激和/或增強植物在氮受限條件下的生長。相反，可以從 植物細胞或生物中去除或在其中低表達TGAl和/或TGA4多肽，從而消除和/或減弱植物 在氮受限條件下的生長（例如應答於硝酸鹽減弱植物生長）。
[0118] TGAl可以通過憐酸化（Popescuetal. (2009)GenesDev. 23:80-92)或S-亞硝 基化（Lindermayretal. (2010)PlantCell22:2894-907)翻譯後修飾。這些和其他翻 譯後修飾可能在TGAl和/或TGA4的調節中起作用。例如，最近表明，在用S-亞硝基穀胱 甘肽處理之後，TGAl可以被S23亞硝基化，S亞硝基穀胱甘肽是一種生理一氧化氮（NO)供 體。Lindermayretal. (2010)，同上。這種S23亞硝基化增強TGAl的DNA結合活性。見上 文。由於NO產生與NR活性有關（Kolbert和Erdei(2008)PlantSignalBehav.3:972-3)， 並且亞硝酸鹽充當NO形成的基質（Yamasakietal. (1999)TrendsPlantSci. 4:128-9; Rockeletal. (2002)J.Exp.Bot. 53:103-10;Leaetal. (2004)Planta219:59-65;Meyer etal. (2005)Photosynth.Res. 83:181-9;Planchetetal. (2005)PlantJ.41:732_43),硝 酸鹽衍生的代謝物（例如亞硝酸鹽或NO)可能涉及激活TGAl和TGA4轉錄因子活性，從而 執行硝酸鹽/亞硝酸鹽轉錄應答。
[0119] 因此，特定的實施方案包括TGAl和/或TGA4的翻譯後修飾的控制或模擬，從而影 響TGAl和/或TGA4的活性。而且，可以與TGAl和/或TGA4表達一併提供或去除硝酸鹽 應答途徑的上遊信號分子，從而例如將這種作用調節到技術從業者考慮之內的期望水平。
[0120] 不受任何特定理論的束縛，TGAl和TGA4可能是應答於硝酸鹽處理而被激活的至 少兩種調節機制的一部分。首先，硝酸鹽和/或硝酸鹽衍生的信號（例如亞硝酸鹽或NO) 將激活TGAl和TGA4轉錄因子，使得TGAl和TGA4與它們的靶基因的啟動子區結合。結果， 這些硝酸鹽應答靶基因的表達將增加，以使細胞（和包含該細胞的植物）適應富含硝酸鹽 的環境。其次，經過相對較長的時期，硝酸鹽和/或硝酸鹽衍生的信號也可能引起TGAl和 TGA4基因表達的誘導。這種基因表達的誘導可以是獨立調節功能的一部分。這些應答的 時間性差異可涉及被調節過程的性質（例如代謝性與發育性）和/或涉及不同的空間功能 (局部與系統）。因此，在特定的實施方案中，可以按照時間依賴性方式控制植物或細胞中 的TGAl和/或TGA，以實現一種或多種特定的所希望的硝酸鹽應答。
[0121] VI.包含TGAl和/或TGA4的植物、植物部分、和植物材料
[0122] 一些實施方案涉及產生轉化細胞的方法，所述轉化細胞包含一個或多個TGAl和/ 或TGA4多肽（如上所述）、和/或一個或多個包含編碼TGAl和/或TGA4多肽的核酸序列 的核酸分子。這種核酸分子還可以包含例如非編碼調節元件，例如啟動子。還可以將其他 序列與非編碼調節元件和可轉錄核酸分子序列一起導入細胞中。這些其他的序列可包括 3'轉錄終止子、3'多-腺苷酸化信號、其他非翻譯序列、轉運序列或靶序列、選擇標記、增強 子、和操縱基因。
[0123] 轉化方法通常包括以下步驟：選擇適合的宿主細胞，用重組載體轉化宿主細胞，和 獲得轉化的宿主細胞。用於將DNA導入細胞中的技術是本領域技術人員熟知的。這些方法 通常可被分為五類：（1)化學方法（Graham和VanderEb(1973)Virology54(2):536-9; Zatloukaletal. (1992)Ann.Ν·Υ·Acad.Sci. 660:136-53) ; (2)物理方法，例如顯微 注射（Capechi(1980)Cell22(2):479_88)、電穿孔（Wong和Neumann(1982)Biochim. Biophys.Res.Commun. 107 (2) : 584-7;Frommetal. (1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(17) :5824-8 ;美國專利5, 384, 253)、和粒子加速（Johnston和Tang(1994)MethodsCell Biol. 43(A) :353-65；Fynanetal. (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(24):11478-82; (3)病毒載體（Clapp(1993)Clin.Perinatol. 20(I):155-68;Luetal. (1993)J.Exp. Med. 178(6):2089-96;Eglitis和Anderson(1988)Biotechniques6(7):608-14) ;(4)受 體介導的機制（Curieletal. (1992)Hum.Gen.Ther. 3(2) :147-54;Wagneretal. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(13):6099-103);和（5)細菌介導的機制，例如用土壤桿菌。 或者，可通過直接注射植物的生殖器官將核酸直接導入花粉中。Zhouetal. (1983)Methods inEnzymology101:433；Hess(1987)Intern.Rev.Cytol. 107:367；Luoetal. (1988) PlantMol.Biol.Reporter6:165;Penaetal. (1987)Nature325:274。其他的轉化方法 包括，例如，如在美國專利5, 508, 184中說明的原生質體轉化。也可將核酸分子注射到未成 熟胚中。Neuhausetal. (1987)Theor.Appl.Genet. 75:30。
[0124] 最常用的植物細胞轉化方法為：土壤桿菌介導的DNA轉移過程（Fraleyetal. (I983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8〇:48〇3)(如美國專利 5,824,877 ;美國專利 5,59I, 616 ; 美國專利5, 981，840 ;和美國專利6, 384, 301中例示的）和基因槍或微粒轟擊介導的 過程（即，基因槍）（例如描述於美國專利5, 550, 318 ;美國專利5, 538, 880 ;美國專利 6, 160, 208 ;美國專利6, 399, 861 ;和美國專利6, 403, 865)。一般而言，核轉化是理想的，但 是在期望特異性轉化質體，例如葉綠體或造粉體的場合，可利用某些植物種類（例如擬南 芥、菸草、馬鈴薯、和芸苔屬類）中的期望的核酸分子的微粒介導的遞送來轉化植物質體。
[0125] 通過使用屬於土壤桿菌屬的遺傳工程化的土壤細菌，可實現土壤桿菌介導的轉 化。幾種土壤桿菌種類介導一種被稱為"T-DNA"的DNA的轉移，可將這些土壤桿菌種類 遺傳工程化，以便攜帶期望的DNA片段進入許多植物種類中。標誌著T-DNA介導的致病 過程的主要事件為：毒力基因的誘導、和T-DNA的加工和轉移。這個過程是許多綜述的主 題。見，例如Ream(1989)Ann.Rev.Phytopathol. 27:583-618;Howard和Citovsky(1990) Bioassays12:103-8；Kado(1991)Crit.Rev.PlantSci. 10:1-32；Zambryski(1992) AnnualRev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.43:465-90 ;Gelvin(1993)收錄於 TransgenicPlants,Kung和Wu編輯，AcademicPress,SanDiego,CA,pp. 49-87；Binns 和Howitz(1994)收錄於BactericalPathogenesisofPlantsandAnimals,Dang編 輯,Berlin:SpringerVerlag. ,pp. 119-38；Hooykaas和Beijersbergen(1994)Ann. Rev.Phytopathol.32:157-79;Lessl和Lanka(1994)Cell77:321-4;以及Zupan和 Zambryski(1995)AnnualRev.Phytopathol. 27:583-618。
[0126] 為了在不考慮轉化方法的情況下對轉化的植物細胞進行選擇或評分，導入細胞中 的DNA可以含有這樣的基因，該基因在可再生植物組織中起作用而產生某種化合物，該化 合物賦予該植物組織針對原本有毒性的化合物的抗性。用作選擇標記、篩選標記、或評分 標記的感興趣基因包括但不限於，β-葡糖苷酸酶（GUS)、綠色螢光蛋白（GFP)、螢光素酶、 和抗生素或除草劑耐受基因。抗生素抗性基因的實例包括賦予青黴素類、卡那黴素（和新 黴素G418、博來黴素）；氨甲喋呤（和甲氧苄胺嘧啶）；氯黴素；和四環素抗性的基因。例 如，草甘膦抗性可以由除草劑抗性基因賦予。Della-Cioppaetal. (1987)Bio/Technology 5:579-84。也可以應用其他選擇策略，例如包括，但不限於，對草銨膦、雙丙氨磷的耐受性， 和陽性選擇機制（Joersbroetal. (1998)Mol.Breed. 4:111-7)，這些策略視為在本發明實 施方案的範圍之內。
[0127] 經由選擇或篩選鑑定出轉化的細胞，在支持再生的適當培養基中培養，然後可以 讓其成熟為植物。
[0128]目前公開的方法可以用於任何可轉化的植物細胞或組織。如本文中使用的，可轉 化的細胞和組織包括但不限於能夠進一步繁殖產生植物的細胞或組織。本領域技術人員認 識到，許多植物細胞或組織是可轉化的，其中在插入外源DNA之後並且在適當培養條件下， 所述植物細胞或組織能夠形成分化的植物。適用於這些目的的組織可包括但不限於，未成 熟胚、盾片組織、懸浮細胞培養物、未成熟花序、芽分生組織、節點外植體、愈傷組織、下胚軸 組織、子葉、根、和葉。
[0129] 從轉化的植物原生質體或外植體再生、發育、和培養出植物是本領域已知的。 Weissbach和Weissbach(1988)MethodsforPlantMolecularBiology, (Eds. )Academic Press,Inc.，SanDiego,CA;Horschetal. (1985)Science227:1229-31。這種再生和生長 過程通常包括以下步驟：選擇轉化的細胞，培養這些細胞，使其經歷胚發育和生根苗期的常 規階段。轉基因胚和種子以相似的方式再生。在這種方法中，通常在選擇培養基的存在下培 養轉化體，該選擇培養基選擇成功轉化的細胞並誘導植物芽的再生。Fraleyetal. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803。通常在兩個月或四個月之內獲得這些芽。此後，將產 生的轉基因的生根芽種植在適當植物生長介質（例如土壤）中。暴露於選擇劑後存活的細 胞、或者在篩選測定中已被評分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的介質中進行培養。然 後，將芽轉移到適當的含有選擇劑和阻止細菌生長的抗生素的根誘導培養基中。許多芽將 產生根。然後，將這些芽移栽到土壤中或其他介質中，使根繼續發育。如上所述的方法通 常取決於所採用的具體植物株系而變化，因此方法的細節在本領域技術人員的自由裁量之 內。
[0130] 再生的轉基因植物可以自花授粉，以提供純合的轉基因植物。或者，從再生的轉基 因植物獲得的花粉可以與非轉基因植物雜交，優選地與農藝學重要的種類的近交系雜交。 相反，可以用來自非轉基因植物的花粉對再生的轉基因植物授粉。
[0131] 該轉基因植物可將轉化的核酸序列傳遞至其後代。該轉基因植物優選地對於轉化 的核酸序列而言是純合的，並且該轉基因植物在有性繁殖時，作為有性繁殖的結果，將該序 列傳遞到它的所有後代。後代可以從轉基因植物產生的種子長出。然後，這些另外的植物 可以自花授粉而產生植物純育系。
[0132] 此外，可以評估來自這些植物的後代的基因表達等。可通過幾種常用的方法，例如 Western印跡、Northern印跡、免疫沉澱、和ELISA，檢測基因表達。對於轉化的植物，還可 以分析導入DNA的存在以及由本發明的核酸分子和胺基酸分子賦予的表達水平和/或脂肪 酸譜。本領域的技術人員知曉眾多的可用於分析轉化的植物的方法。例如，用於植物分析 的方法包括但不限於Southern印跡或Northern印跡、基於PCR的方法、生物化學測定、表 型篩選方法、大田評估、和免疫診斷測定。
[0133] 特異性轉化雙子葉植物的方法是本領域技術人員熟知的。已經針對許多作物描述 了利用這些方法進行的轉化和植物再生，這些作物包括但不限於，擬南芥屬成員、棉花（陸 地棉）、大豆（Glycinemax)、花生（Arachishypogaea)、和芸苔屬成員。已經公開了主要通 過使用根癌土壤桿菌轉化雙子葉植物並獲得轉基因植物的方法，這些植物為棉花（美國專 利5, 004, 863 ;美國專利5, 159, 135 ;美國專利5, 518, 908);大豆（美國專利5, 569, 834 ;美 國專利 5, 416, 011;McCabeetal. (1988)Biotechnology6:923;Christouetal. (1988) PlantPhysiol. 87:671-4) ;Brassica(美國專利 5, 463, 174);花生（Chengetal. (1996) PlantCellR印.15:653-7;McKentlyetal. (1995)PlantCellR印.14:699-703);番木 瓜；和豌豆（Grantetal. (1995)PlantCellRep. 15:254-8)。
[0134]用於轉化單子葉植物的方法也是本領域技術人員熟知的。已經針對許多作物 描述了使用這些方法進行的轉化和植物再生，這些作物包括但不限於，大麥（Hordeum vulgarae);玉米（Zeamays);燕麥（Avenasativa);果園草（鴨茅）；水稻（Oryzasativa， 包括秈稻和粳稻品種）；高粱（Sorghumbicolor);甘鹿（甘鹿屬類）；高羊茅（Festuca arundinacea);草坪草種類（例如匍匍翦股穎、草地早熟禾、偏序鈍葉草）；小麥（Triticum aestivum);和苜猜（Medicagosativa)。對於本領域技術人員而言容易想到的是，可以使 用和修改許多轉化方法，以便產生穩定的針對任何數量的感興趣目標作物的轉基因植物。
[0135] 可以選擇任何植物用於這裡描述的方法中。根據本發明，優選用於改良的植物例 如包括，但不限於，油料種子植物、擬南芥種類（例如，擬南芥）、琉璃苣（琉璃苣屬類）、 加拿大油菜（芸苔屬類）、菌麻（Ricinuscommunis)、可可豆（Theobromacacao)、玉米 (Zeamays)、棉花（棉屬類）、海甘藍屬類（Crambespp·)、萼距花屬類（Cupheaspp·)、 亞麻屬類（Linumspp·)、Lesquerella和池花種類（Limnanthesspp.)、Linola、旱金蓮 屬（Tropaeolumspp·)、月見草屬類（Oenotheraspp·)、撤攬（Oleaspp·)、掠櫚（Elaeis spp.)、花生（Arachisspp.)、油菜、紅花（Carthamusspp.)、大豆（Glycine和Sojaρρ·)、 向日葵（Helianthasspp·)、菸草（Nicotianaspp·)、斑鳩菊屬類（Vernoniaspp·)、小 麥（Triticumspp·)、大麥（Hordeumspp·)、水稻（Oryzaspp·)、燕麥（Avanaspp·)、高梁 (Sorghumspp·)、和黑麥（Secalespp.)或其他禾本科成員。
[0136] 本領域技術人員容易想到可以使用和修改許多轉化方法，以便從任何數量的感興 趣目標作物產生穩定的轉基因植物。
[0137] 提供了以下實例，以便展示某些特定的特徵和/或實施方案。這些實例不應當解 釋為將本發明限制於所述特定的特徵或實施方案。 實施例
[0138] 實施例I:材料和方法
[0139]用於預測硝酸鹽調節某閔的牛物信息學分析：#用棺物某閔相互作用的網絡樽型 進行生物信息學分析，以便鑑定硝酸鹽調節基因。為了富集模型預測，利用了相應於硝酸鹽 處理的可用微陣列表達數據。Wangetal. (2003)，同上；Scheibleetal. (2004)，同上； Wangetal. (2004)，同上；Gutierrezetal. (2007)，同上。
[0140] 首先，選擇所有擬南芥轉錄因子基因。其次，選擇被硝酸鹽顯著調節的基因。第 三，根據在比較每個微陣列分析中的處理實驗和對照實驗時所觀察到的幅度（倍數變化）， 給這些基因分配一個等級分數。第四，根據在網絡模型中觀察到的連接的數量，給這些基 因分配一個等級分數。Gutierrezetal. (2007)，同上。高度連接的基因可能是"調節中 心（regulatoryhubs)"。Barabasi和Oltvai(2004)Nat.Rev.Genet. 5:101-13。第五，我 們根據基因家族的大小給這些基因分配一個等級分數。基因家族大小利用Gutierrezet al. (2004)GenomeBiol.5:R53的方法使用BLASTCLUST?來確定。最後一個標準用來降低 由於功能冗餘所致的相應突變體中表型缺乏的可能性。最後，將所有獨立獲得的評分等級 的中位數進行計算和排序，從而提供最後的基因列表。
[0141]棺物材料和牛長備件：在所有實駘中#用了野牛型擬南芥哥倫比亞-0型 ("Col-Ο")。使用的所有突變體也在Col-O背景中。tgal、tga4單突變體和tgal/tga4雙突變 體植物由Dr.XinnianDong,DukeUniversity,NorthCarolina,USA友情贊助。Kesarwani etal. (2007)，同上。硝酸鹽還原酶（NR)缺失突變系由NigelCrawford,Universityof CaliforniaSanDiego,LaJolla,CA友情提供。Wangetal. (2004)，同上。所使用的標識 中柱鞘（E374)的GFP系來源可從Pennsylvania大學的GFP增強子捕獲系（trapline)獲 得。
[0142] 使用不含氮的MS31改良的基本鹽培養基（PhytotechnologyLaboratories)以水 培方式培育植物。這種培養基補充有〇. 5mM琥珀酸銨和3mM的蔗糖。在22°C下（在Percival 溫箱中），在長白晝（16/8小時光照/黑暗）條件下14天之後，在第15天光周期開始時 用5mMKNO3或作為對照的5mMKCl以所指示的時間處理植物。為了對應答於硝酸鹽處理 的根進行表型分析，如上所述使幼苗生長，然後用5mMKNO3或5禮KCl(作為陰性對照）處 理3天。為了初生根測量，使用EPS0N?PerfectionV700Photo掃描儀獲取植物圖像，使用 IMAGEJ?程序進行根測量。使用NIK0NTMEclipSe 80i顯微鏡上的DIC光學器件對側根進行 計數。
[0143]RNA分離和RT-aPCR:桉照製造商(Invitrogen)的使用說明，用TRIZOLκ試劑從 整根分離RNA。按照製造商（Promega)的使用說明，使用ImProm-II?反轉錄酶進行cDNA合 成。使用StratageneMX3000PqPCR系統上的fcilliantSYBRVGreenQPCR試劑進行 RT-qPCR。相對於網格蛋白（Atg4g24550)將RNA水平標準化。如在圖13中所示，所標繪的 值相應於三個生物重複的均值土標準差；未發現統計差異均值（p〈〇. 05)。
[0144]中梓鞘細朐的原牛質體牛成和細朐分詵:使標記中柱鞘的增強子捕獲系E374幼 苗在以上所述的相同實驗條件下生長。在第15天開始時，將用0. 5mM琥珀酸銨作為唯一 氮源以水培方式培育的植物用5mMKNO3或5mMKCl處理2小時。收集根，根據Birnhaum 等人（2005)Nat.Methods2:615-9 ;和Giffordetal. (2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:803-8的方法通過纖維素酶和果膠裂合酶處理產生原生質體。使用FACS分離GFP24 表達系並直接收集在裂解緩衝液中，該裂解緩衝液來自mirVana?總RNA提取試劑盒 (Ambion，1560M)。如上所述進行cDNA合成和基因表達分析。
[0145]某閔表汰和網絡分析：依照由Affymetrix提供的使用說明，進行cDNA合成、陣列 雜交、和信號強度標準化。使用穩健的多陣列分析（RM)，在R軟體（Affymetrix)中將數 據標準化。Irizarryetal. (2003)Biostatistics4:249-64。將標準化的數據進行雙因 素ANOVA分析（P〈0. 05)，其中錯誤發現率為5%。為了ANOVA分析，使用了模型，該模型將 給定基因Y的表達視為：
[0146]Yi =β0Τ+βA+β2TG+ε，其中Eq. 1
[0147] 為全局均值；^、02和β3分別為處理的效果、表型、和這兩個因素之間的相 互作用；ε為未解釋的方差。
[0148]使用可通過VirtualPlant?(virtualplant.org)訪問的"基因網絡"（Gene networks)工具，建立了具有顯著的處理：基因型相互作用因子的基因的分子網絡。蛋白 質-DNA相互作用被包括在內，考慮上遊基因區中的至少一個轉錄因子結合位點以及對該 轉錄因子結合位點的高於基因組中所有上遊序列中的平均發生率的過度表現（兩個標準 差）。為了改進調節的相互作用預測，將蛋白質-DNA相互作用過濾，使其僅僅包括在我們的 微陣列實驗中其表達值顯著關聯（P〈〇.〇5)的轉錄因子/目標對。使用Cytoscape?軟體使 產生的網絡可視化。Shannonetal. (2003)GenomeRes. 13:2498-504。
[0149]染色質免疫沉澱（ChIP)測定：根據Salehetal. (2008)Nat.Protoc. 3:1018-25 的方法進行Chip測定。簡言之，在第15天黎明（光周期的開始）用5mMKNO3或作為對照 的5mMKCl處理以水培方式以0.5mM琥珀酸銨為唯一氮源培育兩周的植物。收集根，立即 在室溫在真空下，在1 %福馬林中固定10分鐘。通過加入終濃度為0. 125M的甘氨酸終止 交聯。
[0150] 製備用於染色質分離的細胞核：將分離的染色質以1個周期15秒和40%幅度用 超聲處理22次（Dr.HielscherGmbHBioruptor)。移出1小等份的剪切的染色質用作對照 (Input)。稀釋的染色質用於以抗TGAl抗體進行IP，用非特異性IgG作為陰性對照。免疫 沉澱的DNA利用以下引物組，通過定量PCR加以擴增：AtNRT2. 1 (正向，5'-CTATCCTGTATCAC TGTATGTAACCAG(SEQIDN0:17);反向，5'-GGATGGATAGTCAACAATATGGTTGTG(SEQIDN0:18)) 和AtNRT2. 2 (正向，5 '-CTCAACAGAGGGAACACCGG(SEQIDNO: 19);反向，5 '-CCCAAAATATATTA CAATGTAGTTG(SEQIDNO:20))。
[0151] 開發了分級系統來整合多種多樣的數據類型，該系統將TGAl和TGA4鑑定為可能 重要的控制擬南芥中氮應答的調節因子。我們以實驗證明了TGAl和TGA4作為重要的氮應 答調節子的重要性，並進一步證明TGAl和TGA4介導了涉及硝酸鹽攝取和還原的重要基因 的氮調節。還確定了TGAl和TGA4對於應答於硝酸鹽的初生根生長和側根生長都是重要的 調節因子。這些結果將TGAl和TGA4轉錄因子鑑定為植物根氮應答中的重要調節因子。
[0152] 實施例II:擬南芥中硝酸鹽應答調節子的確定
[0153] 根據在實施例I中提出的方法，基於硝酸鹽處理的絕對應答，在每個實驗中將轉 錄因子評級（應答（誘導性或抑制性）最強者評級最好）。取每個實驗的等級的平均值， 產生一個硝酸鹽調節分數。該分析的最佳候選者為TGAl(At5g65210)，它是一種以前未曾 證實與硝酸鹽應答相關的bZIP轉錄因子。TGA4(At5gl0030)(-種與之密切相關的bZIP 家族成員）也在評級中被發現，其分數較前者為低。鑑於它們的已經被報導的功能冗餘 (Kesarwanietal. (2007)，同上），選擇了TGAl和TG4 進行進一步分析。
[0154] 實施例III:硝酸鹽調節TGAl和TGA4的表達
[0155] 作為分析這些轉錄因子在硝酸鹽應答中的可能作用的第一步，在硝酸鹽處理之後 在時程實驗中測定了TGAl和TGA4mRNA水平。用0. 5mM琥珀酸銨作為唯一氮源以水培方 式將野生型Col-O植物培育兩周。在第15天的光周期開始時，使植物暴露於5mMKNO3或 KCl(對照）。在其後1、2、4、和8小時，收穫根器官，用於RNA分離。使用定量RT-qPCR，測 定TGAl和TGA4的轉錄物水平，並用網格蛋白基因作為參考標準。mRNA是相對於時間0而 言的。圖I(A-B)。如圖IA和IB中所示，在KNO3處理之後TGAl和TGA4mRNA迅速積累，但 是在KCl處理之後則沒有，表明這些基因的表達是由根中的硝酸鹽處理調節的。為了評估 TGAl和TGA4的硝酸鹽調節是否對於所有TGA家族成員都是普遍的（Jakobyetal. (2002) TrendsPlantSci. 7:106-11)，測定了TGA2、TGA3、TGA5、TGA6、TGA7、TGA9、TGAlO和PAN的 mRNA水平。在以上所述的相同實驗條件下，硝酸鹽處理不影響這些其他TGA轉錄因子的表 達，如在圖13中所示。在相同實驗條件下，硝酸鹽處理不影響其他TGA轉錄因子的表達。這 些結果表明，硝酸鹽處理特異性地影響根中的TGAl和TGA4表達。
[0156] 實施例IV:硝酸鹽代謝物調節TGAl和TGA4的表達
[0157] 為了評估所觀察的調節是直接由於硝酸鹽所致、或是由於在硝酸鹽還原之後產生 的N代謝物所致，在NR缺失突變體中進行了類似的實驗。Wang et al. (2004)，同上。在以 銨作為唯一氮源的水培基質中培育植物。在第15天的光周期開始時，收穫根（時間0)或 使其暴露於250mM KN03、250mM KCl、5mMNH4Cl、或5mM KCl指定的時間。收穫根，分離總RNA 用於RT-qPCR分析，並使用網格蛋白基因將RNA水平標準化。圖IC和1D。
[0158] 在NR缺失突變體中NR活性的缺乏阻止硝酸鹽的還原，從而阻斷下遊信號的產生。 Wangetal. (2004)，同上。因而，在野生型和NR缺失突變體中應答於硝酸鹽的基因是直接 被硝酸鹽調節的。在NR缺失突變體中，TGAl和TGA4mRNA水平都在硝酸鹽處理1小時之後 被誘導。圖IC和1D。然而，與野生型植物比較，在NR缺失突變體中的TGAl和TGA4mRNA 的積累在硝酸鹽處理之後顯著降低。在硝酸鹽處理之後的NR缺失突變體植物中檢測出的 TGAl和TGA4mRNA的水平增長雖然嚴重減少，但仍表明這些基因的表達受到硝酸鹽和其他N 代謝物的調節。
[0159] 為了鑑定其他對TGAl和TGA4調節有貢獻的N代謝信號，我們評估了在亞硝酸鹽 或銨處理之後隨著時間變化的TGAl和TGA4mRNA水平。以前的研究表明，250μM的亞硝酸 鹽是獲得亞硝酸鹽應答基因誘導峰值的最佳濃度（Wangetal.，2007)。250μM亞硝酸鹽 誘導了TGAl和TGA4轉錄物水平（圖IE和1F)。觀察到這些基因在銨處理（圖IG和1Η) 之後在mRNA水平方面沒有顯著變化，其中銨處理使用報導的用來評估GDH2和其他銨應答 基因（Pattersonetal.，2010)的銨調節的條件（圖14)。這些結果表明，在擬南芥根中 TGAl和TGA4被硝酸鹽和亞硝酸鹽誘導。
[0160] 實施例V:亞硝酸鹽調節TGAl和TGA4的表達
[0161] 為了鑑定其他對TGAl和TGA4調節有貢獻的氮代謝信號，評估了在亞硝酸鹽或銨 處理之後隨著時間變化的TGAl和TGA4mRNA水平。亞硝酸鹽處理既誘導了TGAl轉錄物水 平，又誘導了TGA4轉錄物水平。圖2 (A-B)。但是，在銨處理之後TGAl和TGA4都沒有觀察 到mRNA水平的顯著變化。圖2(C-D)。這些結果表明，TGAl和TGA4是由在根中的硝酸鹽 和亞硝酸鹽誘導的，表明這些轉錄因子可能涉及硝酸鹽攝取和還原的初始N代謝步驟的調 節。
[0162] 實施例VI:TGA1和TGA4促進初生根和側根生長
[0163] 為了評估TGAl和TGA4對根生長和發育的影響，分析了對tgal和tga4單突變體和 tgal/tga4雙突變體植物用謂03或此1 (對照）處理3天的應答（Kesarwanietal. (2007)， 同上）。測量了在上文所述的相同實驗條件下水培生長兩周的植物的初生根長度，以及在 用5mMKNO3或KCl處理3天之後的初生根長度。確切地說，用0. 5mM琥珀酸銨作為唯一氮 源以水培方式將植物培育兩周。在第15天的黎明，用5mMKNO3或5mMKCl處理幼苗3天。 如實施例I中所述，測量了在這些條件下Col-0、tgal、tga4和tgal/tga4植物的初生根長 度。圖3。
[0164] 在KNO3處理和KCl處理的情況下，與野生型植物相比，tgal和tga4單突變體都顯 示出正常的初生根長度。圖3A。在單突變系中表型的缺乏與這兩種基因之間的高序列相似 性（Xiangetal. (1997)PlantMol.Biol. 34:403-15)和它們的先前報導的在病理應答調 節背景下的功能冗餘一致（Kesarwanietal. (2007)，同上）。
[0165] 與單突變體相反，tgal/tga4雙突變體相比於用KNO3處理的野生型植物顯示出初 生根生長減弱，但在KCl對照處理下則不然。圖3A。此外，評估了在相同實驗條件下應答於 硝酸鹽的側根密度，硝酸鹽處理增加了包含TGAl和TGA4等位基因的野生型（Col-O)植物 中的側根密度。然而，在硝酸鹽處理下，tgal/tga4雙突變體植物顯示出側根應答的改變， 與野生型植物相比展示出側根密度降低。圖3B。
[0166] 中柱鞘是中柱的最外部分，側根從中柱鞘組織發出。Dolanetal. (1993) Development119:71-84;Malamy和Benfey(1997)Development124:33-44。為了評估硝酸 鹽處理是否調節中柱鞘細胞層中TGAl和TGA4的表達，以0. 5mM琥珀酸銨作為唯一氮源以 水培方式將中柱鞘標記品系植物培養兩周。在第15天的黎明，用5mMKNO3或5禮KCl處 理幼苗2小時。從根製備原生質體，並通過FACS分選表達GFP的中柱鞘細胞。從這些中柱 鞘細胞分離總RNA，並使用RT-qPCR測定TGAl和TGA4的mRNA水平。在中柱鞘細胞中，發 現TGAl和TGA4mRNA在KNO3處理之後積累，但是在KCl處理之後不積累。圖4。這個結果 表明，在中柱鞘細胞中TGAl和TGA4表達受到硝酸鹽處理的調節，而中柱鞘細胞是側根發生 出現之處。這些結果表明，TGAl和TGA4對於應答於硝酸鹽而調節根繫結構是重要的。
[0167] 實施例VII:由TGAl和TGA4控制的硝酸鹽應答性基因網絡
[0168] 為了鑑定TGAl和TGA4的靶基因，這些基因可能是這些轉錄因子在氮存在下的初 生根和側根生長中所起作用的基礎，我們使用擬南芥基因晶片（ATHl;AffymetriX)進行了 轉錄組學分析，以評估硝酸鹽在野生型和tgal/tga4雙突變體植物的根中的作用。在以琥 珀酸銨為唯一氮源的MS培養基中培育植物，如上所述用5mMKNO3或KCl處理兩小時。如 實施例I中所述，從根器官分離總RNA，並準備用於基因晶片雜交。使用RMA將基因表達數 據標準化，並根據Krouketal. (2009)PLoSComput.Biol. 5:el000326的方法使用雙因素 ANOVA確定差異基因表達。對於ANOVA模型考慮的因素為：植物基因型（G)、處理（T)、以及 基因型與處理之間的相互作用（TG)，使用5%FDR來定義在基因表達上的顯著變化。結果表 明，在我們的實驗條件下有827種基因受到硝酸鹽處理（T)的調節。在這些實驗中受到硝酸 鹽調節的基因的數量和性質與先前已經報導的關於擬南芥硝酸鹽應答的全基因組分析是 可比較的。Wangetal. (2003)，同上；Scheibleetal. (2004)，同上；Wangetal. (2004)， 同上。
[0169] 鑑定了其中TG因子顯著的96種基因。這96種基因相應於在tgal/tga4雙突變 體中其硝酸鹽應答相比於野生型TGA1/TGA4植物發生了改變的基因。在該模型中僅有四種 基因顯示基因型是唯一的顯著因素，表明tgal/tga4突變的作用在硝酸鹽應答的背景下最 為突出。總的來說，在tgal/tga4雙突變體中，15%的基因顯示出應答於硝酸鹽的表達調節 的改變。此外，97%的在tgal/tga4雙突變體中具有基因表達改變的基因也受到硝酸鹽的 調節。這個結果將TGAl和TGA4與硝酸鹽應答的特定方面緊密聯繫起來。
[0170] 為了揭示其硝酸鹽應答依賴於TGAl和TGA4的基因的調節性相互作用，使用可通 過VirtualPlant?網站訪問的基因網絡（GeneNetworks)工具產生了呈現顯著TG因子的 基因的網絡視圖。Katarietal. (2010)PlantPhysiol. 152:500-15。使用Cytoscape?使 產生的網絡可視化，其中基因被呈現為由顯示調節性相互作用的邊連接的節點。圖5。根 據該網絡，TGAl和TGA4兩者都正向調節硝酸鹽轉運蛋白NRT2. 2.的表達。NRT2. 2在擬 南芥中對於硝酸鹽攝取是重要的。Lietal. (2007)，同上。此外，在該網路中觀察了涉 及其他信號途徑的基因，例如，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A(PP2A，At5g25510);蛋白磷 酸酶2C(PP2C，At4g38520) ;CBL-相互作用蛋白激酶3(CIPK3,At2g26980);和生長素/吲 哚-3-乙酸7(IAA7，At3g23050)轉錄因子。一些參與脅迫應答的基因，例如過氧化物酶類， 也被發現受到TGAl和TGA4的調節。
[0171] 這些結果表明，TGAl和TGA4應答於硝酸鹽處理而調節涉及硝酸鹽攝取、以及細胞 信號、和脅迫應答的靶基因的表達。在tgal/tga4雙突變體中，這種應答於硝酸鹽處理的靶 基因的表達調節改變可以解釋觀察到的表型改變。
[0172] 實施例VIII:TGA1和TGA4在硝酸鹽應答中的調節作用
[0173] 我們的數據預測到，直接參與硝酸鹽攝取的基因是TGAl和TGA4在硝酸鹽應答中 的靶點。為了確定參與硝酸鹽攝取和還原的基因的表達在tgal/tga4雙突變體中是否受到 影響，在野生型和tgal/tga4突變體植物中進行硝酸鹽處理之後，使用RT-qPCR測定了已知 的硝酸鹽應答基因NRT2. 1、NRT2. 2、NIAl和NIR的mRNA水平。確切地說，以銨作為唯一氮 源，在水培系統中培養Col-O和gal/tga4植物。在第15天光周期開始時，用5mMKN03或 5mMKCl(對照）處理植物指示的時間。分離RNA，通過RT-qPCR測定mRNA水平，其中用網 格蛋白基因標準化。
[0174] 在野生型植物中，所有四種基因NRT2. 1、NRT2. 2、NIA1和NIR都被硝酸鹽處理高度 誘導。然而，NRT2. 1、NRT2. 2、和NIR基因的硝酸鹽誘導在tgal/tga4突變體中顯著較低。 圖6A-B(在處理2小時之後，NRT2. 1和NRT2. 2分別比野生型低25%和48% );圖6C(在處 理1小時之後，NIR比野生型低41% )。沒有觀察到NIAl的表達在野生型和tgal/tga4突 變體植物之間有差異。這些結果表明應答於硝酸鹽處理，NRT2. 1、NRT2. 2、和NIR受到TGAl 和TGA4的調節。
[0175] 為了確定參與硝酸鹽還原的基因的表達是否受到TGAl和TGA4的調節，我們評估 了在相同實驗條件下NIAl和NIR的表達。沒有觀察到NIAl的表達在野生型和tgal/tga4 突變體植物之間有差異。（圖16)。然而，在tgal/tga4突變體中在硝酸鹽處理之後1小時 NIR基因的硝酸鹽誘導顯著較低（41% )(圖6C)。這些結果表明NRT2. 1、NRT2. 2和NIR是 TGAl和TGA4的靶基因。
[0176] 由於TGAl和TGA4以組織特異性方式受到調節，我們評估了應答於硝酸鹽處理的 TGA1/TGA4靶基因的根細胞特異性表達。圖IlA和IlB表明，表皮、內皮層中柱鞘和中柱中 NRT2. 1和NRT2. 2受到硝酸鹽的調節。與之相對的是，所有細胞類型中NIR都受到硝酸鹽的 調節。雖然在TGA1/TGA4表達區域與它們的靶基因之間存在重疊，但仍需要另外的調節因 子來調製NRT2. 1、NRT2. 2和NIR應答於硝酸鹽的組織特異性模式。
[0177] 實施例IX:TGA1對NRT2. 1和NRT2. 2表達的影響
[0178] 該網絡模型也預測了TGAl對NRT2.2的表達的直接影響。一項先前的報導 顯示，NRT2. 1和NRT2. 2在擬南芥基因組內定位非常靠近。Orseletal. (2002)Plant Physiol. 129:886-96。另一研究提出，在NRT2. 1和NRT2. 2的硝酸鹽應答中涉及相似的轉 錄機制。Girinetal. (2007)PlantCellEnviron. 30:1366-80。為了確定NRT2.1 是否為 TGAl的直接靶點，人工檢查了NRT2. 1的啟動子區域，並發現距離轉錄起始位點的位置-309 與-304 之間有一個TGAl結合基序（Schindleretal. (1992)PlantCell4:1309-19)。這 些發現表明NRT2. 1和NRT2. 2的表達直接受到TGAl的調節。
[0179] 為了驗證NRT2. 1和NRT2. 2的表達直接受到TGAl調節，使用TGAl-特異性抗體進 行了染色質免疫沉澱（Chip)測定，用非特異性IgG作為陰性對照。在第15天的黎明，用5mM KNO3或5mMKCl處理植物20、60、或120分鐘。對經免疫沉澱的DNA，使用針對含有TGAl結 合基序的NRT2. 1或NRT2. 2啟動子區設計的特異性引物通過qPCR加以定量。TGAl以硝酸 鹽依賴方式結合NRT2. 1和NRT2. 2啟動子。圖7。在與非特異性IgG的免疫沉澱中、或在 KCl處理的植物樣品中，沒有觀察到這些特異性佔用。由此可見，TGAl是一種應答於硝酸鹽 處理而直接調節NRT2. 1和NRT2. 2基因表達的轉錄因子。而且，一旦在硝酸鹽處理20分鐘 之後，即在TGAl的靶基因的啟動子區中檢測到TGA1，表明TGAl和TGA4在硝酸鹽/亞硝酸 鹽的早期應答中起作用。
[0180] 實施例X:TGA1/TGA4表型不是由於硝酸鹽攝取缺陷所致
[0181]NRT2. 1和NRT2. 2是高親和力轉運系統（HATS)的一部分，該系統對於在低硝酸鹽 濃度下的硝酸鹽攝取是必需的（Lietal.，2007)。Hu等人證明，可誘導NRT2.1的硝酸鹽 濃度的範圍很寬，而NRT2. 1硝酸鹽應答由低親和相和高親和相組成（Huetal.，2009)。如 在圖6A和6B中所示，TGAl和TGA4對於NRT2. 1和NRT2. 2在5mMKN03 (在低親和力範圍 內的濃度）處理下的硝酸鹽誘導是必需的。為了探討TGAl和TGA4是否涉及在高親和相中 NRT2. 1和NRT2. 2的硝酸鹽誘導，我們評估了在250μMKN03或250μMKCl處理2小時之 後的順了2.1和順了2.2基因表達。圖124和128顯示，了641和了644對於在25(^]\1謂03處 理下的NRT2. 1和NRT2. 2的硝酸鹽誘導是必需的。這些結果表明TGAl和TGA4在低親和相 和高親和相中都是NRT2. 1和NRT2. 2基因表達的正調節子。
[0182] 為了確定NRT2. 1和NRT2. 2在tgal/tga4雙突變體中的表達降低是否影響硝酸 鹽攝取，我們使用15NCV同位素標記進行了淨硝酸鹽攝取實驗。如上所述以水培方式培養 植物，並用以10% 15NO3-富集過的250M或5mMNO3-處理指示的時間。發現淨硝酸鹽攝取在 野生型和tgal/tga4雙突變體植物中是相似的（圖12C)。由於我們沒有觀察到在野生型 和tgal/tga4之間在長期15N03_暴露（8小時）中在硝酸鹽攝取上的差異（圖12C)，在圖3A 和3B中顯示的觀察到的tgal/tga4表型很可能不是由於硝酸鹽吸收缺陷所致。這些結果 表明，在tgal/tga4中應答於硝酸鹽的對基因表達的影響可能是由於信號傳導途徑缺陷所 致。
[0183] 實施例XI:TGA1以硝酸鹽依賴方式結合NRT2. 1和NRT2. 2啟動子
[0184] 該網絡模型（圖5)預測了TGA1/TGA4對NRT2. 2的表達的直接影響。為了確定 NRT2. 1是否也是TGA1/TGA4的直接靶點，我們人工檢查了NRT2. 1的啟動子區，並在距離它 的轉錄起始位點的位置-1338和-1333以及-371和-266之間發現兩個前人描述的TGAl結 合基序（Schindleretal.，1992)。有趣的是，Girin等人（2007)使NRT2. 1啟動子缺失， 以鑑定控制硝酸鹽誘導的區域，他們觀察到當缺失-456和-245之間的區域時，應答於硝酸 鹽的基因表達劇烈減弱（Girinetal.，2007)。由此可見，TGAl結合位點包含在NRT2.1啟 動子的某個區域中，這個區域對於基因表達的硝酸鹽誘導是重要的。我們使用TGAl特異性 抗體和作為陰性對照的非特異性IgG，利用染色質免疫沉澱（ChIP)測定來評估NRT2. 1和 NRT2. 2是否為TGAl的直接靶基因。如上所述，在第15天的黎明，用5mMKNO3或作為陰性 對照的5mMKCl處理植物20、60、和120分鐘。
[0185] 對於經免疫沉澱的DNA，使用針對下述區域設計的特異性引物，通過qPCR進行 定量：含有位於位置-371和-366的TGAl結合基序的NRT2. 1啟動子區、或含有位於位 置-1287和-1282以及-1194和-1189的兩個TGAl結合基序的NRT2. 2啟動子區。如在圖 7A和7B中所示，TGAl以硝酸鹽依賴方式與NRT2. 1和NRT2. 2啟動子結合。這種結合對於 NRT2. 1和NRT2. 2啟動子區是特異性的，而對這些基因的其他區域不是特異性的，因為當我 們使用針對NRT2. 1和NRT2. 2編碼序列設計的引物時，沒有觀察到擴增（圖7)。NRT2. 1應 答於硝酸鹽的表達水平是NRT2. 2的三倍（圖6)，因此NRT2. 1啟動子區比NRT2啟動子區 募集更多的TGA1。當我們擴增不受TGAl和TGA4調節的硝酸鹽應答基因NIAl的啟動子區 時，沒有觀察到佔用（圖7)。在用非特異性IgG進行的免疫沉澱中、或在用KCl的對照條件 下，沒有觀察到TGAl佔用。這個結果表明，在進行硝酸鹽處理時，TGAl被募集到NRT2. 1和 NRT2. 2的啟動子區來調節它們的表達。
[0186] 實施例XII:在chll-5和TlOlD突變體中，NRT2.1應答於硝酸鹽的表達受到影響
[0187] 使用在"材料和方法"中描述的實驗條件，以水培方式培養Col-0、chll-5、chi1-9 和TlOlD植物。在第15天的光周期開始時，用5mMKNO3或作為對照的5mMKCl處理植物指 示的時間。分離RNA並通過RT-qPCR測量NRT2.ImRNA水平。使用網格蛋白基因（At4g24550) 作為標準化參考。所標繪的值對應於三個獨立生物重複的均值土標準差。（圖15)星號表 示在突變系和col-0之間顯著不同的均值（P〈0. 05)。
[0188] 實施例XII:pTGAl:⑶S和pTGA4:⑶S基因融合物的構建以及⑶S活性測定
[0189] 為了嵌合pTGAl:⑶S和pTGA4:⑶S基因融合，從來自擬南芥生態型Col-O的基因 組DNA擴增TGAl和TGA4翻譯起始密碼子上遊的2000bp片段。以下引物用來擴增TGAl和 TGA4啟動子，並被設計為導入BamHI和NcoI位點：TGAl啟動子（正向，5'-TTGGATCCTTAC TACGTCACCAGAATC(SEQIDN0:21)和反向 5'-AACCATGGITTTCCTCAACTGAAAACAAAG(SEQID N0:22))和TGA4 啟動子（正向，5'-TTGGATCCAGAAGTTGTGGTCACC(SEQIDN0:23)和反向 5' -AACCATGGAITTCTTCAACTAGCAAC(SEQIDN0:24))。用BamHI和NcoI消化重組質粒，將DNA 片段連接到pCAMBIA1381 (CAMBIA,Canberra,Australia)中。通過DNA測序證實這些構建 體的結構。然後通過電穿孔將這些構建體導入根癌土壤桿菌GV3101中。使用花序浸漬法 (floraldip)方案完成根癌土壤桿菌介導的擬南芥植物轉化（CloughandBent, 1998)。 選擇Tl代種子對潮黴素的抗性。對於每個構建體獲得了至少8個獨立的轉基因系，並通過 PCR證實了轉基因的存在。為了⑶S活性的組織化學分析，將幼苗溫育在37°C在加有ImM 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸（X-Gluc)的⑶S反應緩衝液（IOOmM磷酸鈉緩衝 液，pH7.0,0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀、0.1% (vol/vol)TritonX-lOCKO.l% (wt/ vol)十二烷基肌氨酸鈉）中。在染色之後，用含0. 24NHCl的20%甲醇在57°C溫育15分 鍾清洗樣品。該溶液用含7%Na0H、7%羥胺-HCl的60%乙醇代替，並在室溫下溫育15分 鍾。然後，將幼苗分別在仙1%、〗。 1%和10%乙醇中復水5分鐘，然後在5%乙醇、25%甘油 中浸潤15分鐘。將樣品在50%甘油中包埋在顯微鏡用蓋玻片上，然後使用NikonEclipse 80i顯微鏡上的DIC光學器件成像。對於每個標記系和處理，分析了至少15株植物。
【權利要求】
1. 一種用於提高植物中的養分效率的方法，該方法包括： 將至少一種異源多肽導入植物的根組織中，其中所述異源多肽選自下組：TGA1、TGA4 和它們的組合。
2. 根據權利要求1的方法，其中如果所述異源多肽是TGA1，則該異源多肽選自SEQ ID NO. 1。
3. 根據權利要求1的方法，其中如果所述異源多肽是TGA 4,則該異源多肽選自SEQ ID NO. 11。
4. 根據權利要求1的方法，其中所述提高的養分利用效率包括與相同物種的植物相比 提1?的調節硝酸鹽的效率。
5. -種用於提高植物中的根生長的方法，該方法包括： 將異源TGA1和/或TGA4多肽導入植物的根組織中，由此產生包含該異源TGA1和/或 TGA4多肽的修飾植物，其中相比於不含該異源TGA1和/或TGA4多肽的相同物種植物，該修 飾植物包含提高的根生長。
6. 根據權利要求5的方法，其中所述根生長是初生根生長或側根生長。
7. 根據權利要求5的方法，其中導入所述異源TGA1和/或TGA4多肽包括將核酸導入 所述根組織中，其中該核酸包含編碼該異源TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸序列。
8. 根據權利要求5的方法，其中該方法包括使所述修飾植物在氮限制條件下生長。
9. 根據權利要求5的方法，其中所述異源多肽是TGA1轉錄因子。
10. 根據權利要求9的方法，其中所述TGA1轉錄因子包含與SEQ ID NO: 1至少90%相 同的胺基酸序列。
11. 根據權利要求5的方法，其中所述異源多肽是TGA4轉錄因子。
12. 根據權利要求11的方法，其中所述TGA4轉錄因子包含與SEQ ID NO: 11至少90% 相同的胺基酸序列。
13. 根據權利要求7的方法，其中所述TGA1轉錄因子核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 15 至少90%相同的核苷酸序列或與由SEQ ID NO: 15組成的核酸雜交的核酸序列。
14. 根據權利要求7的方法，其中所述TGA4轉錄因子核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16 至少90%相同的核苷酸序列或與由SEQ ID NO: 16組成的核酸雜交的核酸序列。
15. 根據權利要求1的方法，其中所述根組織是根細胞。
16. 根據權利要求7的方法，其中所述編碼異源TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸序列與 根組織特異性啟動子可操作連接。
17. 通過根據權利要求1的方法產生的修飾植物。
18. 從權利要求17的修飾植物產生的種子。
19. 一種核酸分子，其包含具有農藝功能的核酸序列，其中該核酸序列選自下組：與 SEQ ID NO: 15至少90%相同的核苷酸序列、與由SEQ ID NO: 15組成的核酸雜交的核酸序 列、與SEQ ID NO: 16至少90%相同的核苷酸序列、和與由SEQ ID NO: 16組成的核酸雜交的 核酸序列，其中所述核酸序列與異源可轉錄多核苷酸分子可操作連接。
20. 用權利要求19的核酸分子穩定轉化的轉基因植物細胞。
21. -種用於產生轉基因植物的方法，該方法包括： 將核酸導入植物的根組織，其中該核酸包含編碼異源TGA1和/或TGA4多肽的核苷酸 序列，由此產生轉基因植物。
22. 根據權利要求21的方法產生的轉基因植物。
23. 從權利要求22的轉基因植物產生的種子。
24. 權利要求22的轉基因植物，其中，相比於相同物種的野生型植物，該植物包含在圖 5中不出的基因的提商的表達。
25. 權利要求22的轉基因植物，其中所述基因是硝酸鹽轉運蛋白NRT2. 1、硝酸鹽轉運 蛋白NRT2. 2、或亞硝酸鹽還原酶（NIR)。
26. 權利要求22的轉基因植物，其中，相比於相同物種的野生型植物，該轉基因植物包 含提高的初生根和/或側根生長。
【文檔編號】C12N15/82GK104411157SQ201380023486
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年3月5日 優先權日:2012年3月5日
【發明者】R·A·G·艾拉巴卡, J·M·A·赫雷拉 申請人:智利天主教大學