一株衣藻藻株及其應用的製作方法
2023-05-26 17:58:11
專利名稱：一株衣藻藻株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物能源領域，具體地涉及一種衣藻及其製備生物柴油的應用，更具 體地，本發明涉及一株新的衣藻藻株，其油脂含量較好，可用於製備生物柴油、飼料或食用 油的應用。
背景技術：
隨著日益嚴重的環境惡化，控制汽車尾氣排放和溫室效應，保護人類賴以生存的 自然環境成為人類急需解決的問題。同時全球能源需求不斷擴大，尋求可以替代石油在能 源結構中佔主導地位的可再生清潔能源是目前普遍關注的熱點。微藻是一類在水中生長的種類繁多且分布極其廣泛的低等植物，它是由陽光碟機動 的細胞工廠，通過微藻細胞高效的光合作用，吸收CO2,將光能轉化為脂肪或澱粉等化合物 的化學能，並放出02。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生長最為迅速的一種 低等植物，而且某些微藻可以生長在高鹽、高鹼環境的水體中，可充分利用灘涂、鹽鹼地、沙 漠進行大規模培養，也可利用海水、鹽鹼水、工業廢水等非農用水進行培養，還可以利用工 業廢氣中的co2。利用微藻生產生物柴油能夠解決目前使用植物原料發展生物柴油麵臨的 耕地不足、氣候變化對產量影響大和引起農作物價格上漲等突出問題。因此，微藻生物柴油 作為可再生清潔能源成為了潛在的能源研究熱點。衣藻(Chlamydomonas)亦稱「單衣藻」。綠藻門、團藻目、衣藻科中的衣藻屬。藻 體為單細胞，球形或卵形，前端有兩條等長的鞭毛，能遊動。鞭毛基部有伸縮泡兩個；另在細 胞的近前端，有紅色眼點一個。載色體大型杯狀，具澱粉核一枚。無性繁殖產生遊動孢子； 有性生殖為同配、異配和卵式生殖。在不利的生活條件下，細胞停止遊動，並進行多次分裂， 外圍厚膠質鞘，形成臨時群體稱「不定群體」。環境好轉時，群體中的細胞產生鞭毛，破鞘逸 出。其中的萊茵衣藻是一種單細胞真核鞭毛藻類，是研究多種生命活動(如光合作用、生理 節律和趨光性等)的模式生物，與酵母細胞有許多共同的特徵，素有「光合酵母」之稱。關 於衣藻基因方面的研究有大量報導，如專利CN200610026203. 3衣藻紅色螢光標記蛋白基 因CrmRFP、其合成方法及其真核表達載體的構建方法，CN200810066705. 8表達人組織激肽 釋放酶的轉基因萊茵衣藻的構建方法，CN 200610018306. 5 —種萊茵衣藻外源基因表達系 統及其構建生產PHB轉基因藻的方法，卻未見衣藻生產生物柴油的報導，本發明提供了一 種含油量較高的衣藻，其可以進一步進行基因改造。
發明內容
本發明的目的是提供一種產油衣藻及其在生物能源領域的應用。在一個方面中，本發明提供一株衣藻藻株DQA-Ol (Chlamydomonas sp. DQA-01)， 保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No. 3577。此 衣藻藻粉含油量佔乾重量的—一50%，其油脂可以做成生物柴油，飼料或食用油；所 述的產油衣藻是屬於衣藻屬的一個新種，命名為DQA-01，與作為基因工程中微藻模式生物的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在進化樹上非常相近，可為能源微藻基因工程 改造提供材料。在一個實施方案中，所述衣藻藻株DQA-Ol在15-35°C的溫度範圍內培養， 溫度優選為23°C。在一個實施方案中，所述衣藻藻株DQA-Ol在培養過程光照強度控制在 50-—200umol/m2. s。在一個實施方案中，所述衣藻藻株在光照強度150-300umol/m2. s誘導 下積累油脂。在一個實施方案中，所述衣藻藻株首先在60umol/m2. s培養，在第3天時將光 強加大到120umol/m2. s，在第7天時將光強加大到200umol/m2. s。在一個實施方案中，所述 衣藻藻株DQA-Ol在培養期間將培養基的pH值調節在7-9之間，優選pH為7. 2。在另一個方面中，本發明提供篩選所述含油衣藻的方法，所述方法包括下述步 驟1)藻樣採集，選擇含有多種藻類的汙染河流、湖泊或沼澤地，使用藻樣採集器進行 藻樣採集；2)藻種分離純化，利用稀釋鋪平板法或毛細管法將混合在一起的多種藻種進行分 離，得到單個藻種的純藻株；3)藻種培養及油脂誘導，將純藻株在BGll培養基，25°C下進行培養，當藻的濃度 達到l_8g/l的時候，加強光進行油脂誘導；4)油脂含量測定，取油脂誘導後的藻進行尼羅紅染色，在螢光顯微鏡下進行觀察， 選擇螢光比較多的藻種，從而快速得到含油較高的藻種。在一個實施方案中，所述方法還包 括對純藻株進行藻種鑑定，通過形態和分子相結合的方法確定藻種在進化樹中的位置的步
馬聚ο在另一個方面中，本發明提供一種生產生物柴油的方法，所述方法特徵在於使用 本發明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進行。在另一個方面中，本發明提供一種生產飼料的方法，所述方法特徵在於使用本發 明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進行。在另一個方面中，本發明提供一種生產食用油的方法，所述方法特徵在於使用本 發明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進行。在另一個方面中，本發明提供一種對衣藻藻株進行基因改造的方法，所述方法特 徵在於使用本發明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol進行。在又一個方面中，本發明提供所述衣藻藻株DQA-Ol用於製備生物柴油、飼料或食 用油的應用。在又一個方面中，本發明提供所述衣藻藻株DQA-Ol用於製備基因改造藻株的應用。在又一個方面中，本發明提供一種飼料，其由本發明提供的所述衣藻藻株DQA-Ol 製備而來。在又一個方面中，本發明提供一種食用油，其由本發明提供的所述衣藻藻株 DQA-Ol製備而來。在又一個方面中，本發明提供一種生物柴油，其特徵在於，其是通過培養本發明提 供的衣藻藻株DQA-01，並從中分離油脂製備而來。本發明中的衣藻藻體為單細胞，球形或卵形，前端有兩條等長的鞭毛，能遊動。鞭 毛基部有伸縮泡兩個；另在細胞的近前端，有紅色眼點一個。載色體大型杯狀，具澱粉核一
4枚。無性繁殖產生遊動孢子；有性生殖為同配、異配和卵式生殖。在不利的生活條件下，細 胞停止遊動，並進行多次分裂，外圍厚膠質鞘，形成臨時群體稱「不定群體」。環境好轉時，群 體中的細胞產生鞭毛，破鞘逸出。其用於藻種鑑定的ITS序列是(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG GTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGAATCTATCACAATCCACAACCCGCGAACCATACTGTTGGCCTTC CTTGGTTTCGGCCAAGGAGCCAGGCTCTGTCGGTGCTCACGCGCCGTACGGCAGCCTGGGTCGCCTGCCCAATTAAT TATTAATTAATTAGCTGGGCCGGCGTCGGTCTCTTAACCAACCACACACCAAACATAACAATAATAAAAAACGAGCG CTTGGCTTAGAGCCGACGCTCACCAACCAAAGACAACTCTCAACAACGGATATCTTGGCTCTCATAACGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGCGAATTGCAGAAATACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAATTGCGCTCGA GGCTTCGGCCAAGAGCATGTCTGCCTCAGCGTCGGGTTAATACTCGCCTGCTGCACTGCCTGTGCATGCAAGCGGAG CTGGCTGTCTCGGCCCCTCGTAAAACAGGTGCCGGGTCTGCTGAAGTACAGAGGTTGATGCATGGACCCGCTCATGG GCCTCAACTGGGTAGGCAACTCGTTGCTAATGCTTTAGTTGATGGCTTGGATCCGCGCTTGTCGACCCGAACCAGGA ACTCGGCTTCTGCCGAGCAAACCCCTCATTTTCTCGACCTGAGCTCAGGCAAGAACACCCGCTGAACTTAAGCATAT CAATAAGCGGAGGA) (SEQ ID NO :1)，與最相近的 Chlamydomonas callosa 的相似度為 89%, 是衣藻屬的一個新種。發明人已將所述衣藻DQA-Ol藻株(Chlamydomonas sp. DQA-01)於2010年1月6 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號院 3號，簡稱CGMCC)，其保藏號為CGMCCNo. 3577。發明效果本發明分離的衣藻藻株在高光的情況下可以積累佔乾重20%以上的油脂，其油具 有很好的流動性，是品質比較好的油脂。此株衣藻本身就含有比較高油脂的特徵，將對微 藻生物柴油利用基因工程改造突破現有能源微藻產量低、成本高等難題具有十分重要的意 義。
圖1為根據DQA-Ol藻株的ITS及5. 8S部分序列構建的進化樹。圖2為DQA-Ol藻株的顯微照片圖3為DQA-Ol藻株的油脂尼羅紅染色螢光顯微照片圖 4 為 DQA-Ol 藻 ITS 序列與 genebank 中 Chlamydomonas callosa 比對結果照片本發明的創新性目前用於基因工程改造的衣藻是不產油或產油非常少的藻種，而其它含油量高的 藻株在基因改造方面難度比衣藻大。本發明中提供的微藻不僅產油，而且是衣藻屬的一個物種，為產生物柴油的微藻 基因改造提供了操作性簡便的材料。下面將通過具體實施方式
來對本發明的優選實施方案進行說明。但是本發明的保 護範圍並不受所述實施例的限制。
具體實施例方式實施例1篩選含油衣藻藻株取無菌水稀釋後的從達旗地區取回的小河水水樣，在400倍顯微鏡觀察後，大約
5細胞濃度為800-1200個/ml，用毛細管取大約Iul的藻液，接種於48孔裝有BGl 1培養基的 培養板中，在25°C、光照強度為50umol/m2. s情況下進行培養，當達到一定細胞濃度時，顯微 鏡觀察，選擇只有單藻株的孔，進行鋪平板，得到單藻株。將純藻株在BGll培養基中，25°C、光照強度為50umol/m2. s下進行培養，當藻的濃 度達到3g/l的時候，加開燈管，使光強達到250umol/m2. s，進行油脂誘導；將單藻株進行尼羅紅染色，藻內油脂被染上了色，在螢光顯微鏡下進行觀察(見 圖3)，選擇螢光多的藻株，即為油脂含量高的藻株。將分離出來的含油量較高的藻株命名為 DQA-O1。實施例2確定藻種在講化樹上的分類。藻株鑑定採取形狀鑑定和分子鑑定相結合。形狀鑑定(見圖2)對上述分離出來的藻株DQA-Ol在1000倍顯微鏡進行觀察， 發現藻體為單細胞，球形或卵形，前端有兩條等長的鞭毛，能遊動。鞭毛基部有伸縮泡兩個； 另在細胞的近前端，有紅色眼點一個。載色體大型杯狀，具澱粉核一枚。無性繁殖產生遊動 孢子；有性生殖為同配、異配和卵式生殖。在不利的生活條件下，細胞停止遊動，並進行多次 分裂，外圍厚膠質鞘，形成臨時群體稱「不定群體」。檢索《中國淡水藻類一系統、分類及生 態》，發現此藻在形態上分類相同的為綠藻門、綠藻綱、團藻目、衣藻科、衣藻屬。分子鑑定A，從分離的衣藻擴增其ITS及5. 8S部分核苷酸序列用CTAB法提取培養4天的DQA-Ol藻基因組DNA。取一定量的細胞，研磨處理後加 入適量CTAB緩衝液，勻漿，加入等體積的酚氯仿抽提，等體積異丙醇沉澱，75 %乙醇洗滌 後溶於一定體積滅菌雙蒸水中，紫外分光光度計檢測其濃度和純度。ITS序列擴增採用真核生物ITS擴增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公 司合成)。引物 1 5，GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3，引物 2 5』 GCATATCAATAAGCGGAGGA 3』取1 μ 1總DNA為模板。擴增條件如下94°C變性5min，然後94°C 40s, 56V 40s, 72°C 2min 30個循環，最後72°C IOmin0 1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增產物，PCR擴 增獲得約750bp片斷。序列如SEQ IDNO :1所顯示。B，所克隆的核苷酸序列同源性搜索將獲得的DQA的ITS及5. 8S部分序列登錄GenBank資料庫進行BLAST比對，結 果顯示與 ACCESSION 號為 U66945 的 Chlamydomonascallosa 的內轉錄間隔區 1 (ITSl)， 5. 8S核糖體RNA及內轉錄間隔區2(ITS2)序列具有較高的相似性達89% (見圖4)，該 Chlamydomonas callosa 序列，I- 217bp 為 ITSl 序列，218-378 為 5. 8S 核糖體 RNA 基因序 列，377-625 為 ITS2 序列。C，根據上述序列作出進化樹，見圖1。利用NCBI資料庫中的BLAST工具對藻株DQA的ITS部分序列進行序列相似性 分析。選取部分同源序列和該藻株的ITS部分序列利用ClustaLx軟體包進行序列同源 進化比對，形成一個多重序列匹配排列矩陣。然後，運用Mega4. 0軟體，採用鄰位相連 (Neighbor-joining)算法，自展數據集bootstraps值為1000構建系統發育進化樹。
根據形態和ITS blast的結果，限定DQA-01為衣藻屬-ChlamydomonasSp的一個 新種。發明人已將所述藻株於2010年1月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，簡稱CGMCC)，其保藏號為CGMCC No.3577。實施例3衣藻油脂積累將處在對數生長期的藻種接種在配製好的培養基中，通過光強的調節進行生長培 養和油脂誘導培養。進行衣藻油脂積累的培養基和一般方法如下A，培養基配製根據下表BGl 1配方進行培養基配製NaNO30. 8—1. 5g/lK2HPO4. 3H200. 02-0. 08g/lMgSO4. 7H200. 075g/lCaCl2. 2H200. 036g/lcitric acid0.006g/lFerric ammonium citrate0.006g/lEDTA(dinatrium-salt)0.001g/lNa2CO30. 02g/lA5+Co solution*Iml去離子水919ml*A5+Co solution 的組成成分加到1000ml去離子水中H3BO32. 86gMnCl2. H2O1. 81gZnSO4. 7H200. 222gCuSO4. 5H200. 079gNa2MoO4. 2H200. 390gCo (NO3) 2. 6H200. 049gB，接種將所述衣藻藻株DQA-01綠色遊動細胞接種在配置好的培養基中，使細胞密度達 到 OD75tl 為 0. 2-—0. 8 之間。C,培養培養過程光照強度控制在50-200umOl/m2. s,利用通氣使藻株在培養基中保持均 勻，溫度調控在15-35°C範圍內，在培養期內，通過向培養液中通人二氧化碳，將培養基的 PH值調節在7-9之間。D，油脂積累誘導從培養的第5天起，加大光照強度，使光照強度在150-300umOl/m2. s，在這一階段 內，衣藻開始油脂積累。
E，採收藻培養進行到第12天，藻液顏色變黃或乳白時，將藻液收集，通過離心或自然沉降 的方法獲得藻泥，將藻泥在100°C下進行乾燥。藻粉油脂含量積累及測定按上述步驟進行培養，其初始接種細胞密度OD75tl為0. 5，使用BGll培養基，其中 NaNO3 濃度為 0. 9g/l、K2HPO4 3H20 濃度為 0. 04g/l,光照強度為 60umol/m2· s，pH 為 7. 2， 溫度維持在23°C左右，在第3天時將光強加大到120umol/m2. s，在第7天時將光強加大到 200umol/m2. s,培養到第12天，藻液顏色變黃或乳白時，將藻液收集，通過離心或自然沉降 的方法獲得藻泥，將藻泥在ioo°c下進行乾燥。測定乾燥後的藻粉油脂含量，其測定方法取50mg或IOOmg凍幹藻粉放置在具 Telfnon螺口瓶蓋的體積為15_20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2_4ml 10% DMSO-Methanol溶液，40°C砂浴(盛砂的燒杯放置恆溫加熱磁力攪拌器上)5分鐘；然後 在4°C下磁力攪拌抽提30分鐘，3500轉離心，轉移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加 入1 1的乙醚、正己烷4-8ml 4°C下磁力攪拌抽提1小時，3500轉離心，轉移上清液到上 述一小瓶中。可重複上述過程直到藻渣變白。在上述合併抽提液中加入純水使四者(水、 DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)比例為1 1 1 1，震蕩分相，移取有機相轉移到另一小 玻璃瓶中，在通風櫥中用氮氣吹至成濃縮液，然後轉移到事先稱重過的1. 5ml塑料離心管 中，再用氮氣吹乾至恆重，稱量恆重後的管重，用此管重減去事先稱重過的離心管重得到油 脂重量，然後用油脂重量除以藻粉重，計算出其油脂總含量為藻粉乾重31 %。取25mg-100mg藻粉照上面方法進行提取後，用正己烷溶解，使用Agilent 6820氣 相色譜儀進行氣相色譜分析(色譜條件為載氣氮氣流量lml/min、氫氣流量30ml/min、空 氣流量300ml/min，進樣口溫度280°C，檢測器溫度280°C，檢測器類型FID，分析方法內 標法，進樣口類型分流/不分流進樣口)，其油脂組分含量如下表1。表1氣相色譜測定的樣品總脂組分表(組分含量為重量百分比)
樣品名稱DQA-OlI (%)畺I釤苗部哄督未知1. 760±0. 002C1401. 587±0. 004C1616. 834±0. 009C16012. 582±0. 011C1822. 481±0. 018C1812. 868±0. 001C1800. 258 ±0. 004C2052. 468±0. 038C2000. 227±0. 004總含量(%)31. 065±0. 091 本發明中的衣藻具有一定的油含量，可用於提煉生物柴油；此藻種為衣藻屬下的 一個種，其與做了大量基因方面研究的萊茵衣藻是同一屬，在進化上具有許多相似處，故可 以借鑑萊茵衣藻基因方面的研究經驗對此產油衣藻進行基因改造，有助於能源微藻基因改
8造方面的研究。序列表
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一株衣藻藻株及其應用
IB096695
1
Patent In version 3.1
1
728
DNA
衣藻藻株(Chlamydomonas sp
1
ggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgta ggtgaacctgcggaaggatcattgaatcta60
tcacaatccacaacccgcgaaccatactgt tggccttccttggtttcggccaaggagcca120
ggctctgtcggtgctcacgcgccgtacggc agcctgggtcgcctgcccaattaattatta180
attaattagctgggccggcgtcggtctctt aaccaaccac acaccaaacataacaataat240
aaaaaacgagcgcttggcttagagccgacg ctcaccaaccaaagacaactctcaacaacg300
gatatcttggctctcataacgatgaagaac gcagcgaaatgcgatacgtagtgcgaattg360
cagaaatacgtgaatcatcgaatctttgaa cgcaaattgcgctcgaggcttcggccaaga420
gcatgtctgcctcagcgtcgggttaatact cgcctgctgcactgcctgtgcatgcaagcg480
gagctggctgtctcggcccctcgtaaaaca ggtgccgggtctgctgaagtacagaggttg540
atgcatggacccgctcatgggcctcaactg ggtaggcaactcgttgctaatgctttagtt600
gatggcttggatccgcgcttgtcgacccga accaggaactcggcttctgccgagcaaacc660
cctcattttctcgacctgagctcaggcaag aacacccgctgaacttaagcatatcaataa720
gcggagga 728
權利要求
一株衣藻藻株DQA 01(Chlamydomonas sp.DQA 01)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCCNo.3577。
2.權利要求1的衣藻藻株，其特徵在於在15-35°C的溫度範圍內培養。
3.權利要求1的衣藻藻株，其特徵在於在培養過程中光照強度控制在50—200umol/o
4.權利要求1的衣藻藻株，其特徵在於，其在光照強度150-300umOl/m2.s下被誘導積 累油脂。
5.權利要求1的衣藻藻株，其特徵在於，在培養期間將培養基的pH值調節在7-9之間。
6.權利要求1-5中任一項的衣藻藻株用於製備生物柴油、飼料或食用油的應用。
7.權利要求1-5中任一項的衣藻藻株用於製備基因改造藻株的應用。
8.—種生產生物柴油的方法，所述方法特徵在於使用權利要求1-5任一項的衣藻藻株 進行生產。
9.一種分離含油量高的微藻藻株的方法，所述方法包含下列步驟1)藻樣採集選擇含有多種藻類的汙染河流、湖泊或沼澤地，使用藻樣採集器進行藻 樣採集；2)藻種分離純化利用稀釋鋪平板法或毛細管法將混合在一起的多種藻種進行分離， 得到單個藻種的純藻株；3)藻種培養及油脂誘導將純藻株在BG11培養基，25°C下進行培養，當藻的濃度達到 lg/l-8g/l的時候，加強光進行油脂誘導；4)油脂含量測定取油脂誘導後的藻進行尼羅紅染色，在螢光顯微鏡下進行觀察，選 擇螢光比較多的藻種，從而快速得到含油較高的藻種。
全文摘要
本發明提供一株衣藻藻株，經過鑑定所述藻株為一株新的藻株，其保藏號為CGMCC No.3577。所述衣藻藻株油脂含量較高，可應用於製備生物柴油，飼料或食用油。
文檔編號A23K1/14GK101892159SQ201010002968
公開日2010年11月24日 申請日期2010年1月15日 優先權日2010年1月15日
發明者吳義誠, 吳洪, 李青, 黃龍耀 申請人:新奧科技發展有限公司