含有Exendin-4的融合蛋白、製備方法及其應用的製作方法

2023-05-26 18:16:46

專利名稱：含有Exendin-4的融合蛋白、製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及與糖尿病相關的藥物領域，具體而言，本發明涉及一種具有延長的胰升血糖素樣肽類的體內半衰期的融合蛋白。本發明還涉及該融合蛋白的製備方法以及其在製備糖尿病藥物中的應用。
背景技術：
糖尿病是一種遺傳因素和多種環境因素相關聯的以慢性高血糖為特徵的代謝紊亂綜合症。由於糖尿病還伴隨著諸多併發症，現已成為僅次於惡性腫瘤和心血管疾病之後的第三大健康殺手。1984年，胰升血糖素肽-1 (GLP-I)類藥物被發現，它是一種具有30個胺基酸的腸降血糖素。然而GLP-I作為降血糖藥物在應用上受到了限制，其主要原因是GLP-I 的體內半衰期僅為3-5分鐘。Exendin-4是一條39個胺基酸組成的直鏈多肽，最初由南美巨蜥的唾液分離提取獲得。它的胺基酸殘基與哺乳動物GLP-I序列有52%的同源性，其與GLP-I的最大不同之處在於N端第2位的甘氨酸耐血液中二肽基肽酶(DPP-IV)的酶切作用，而GLP-I的相同位置則為極易被DPP-IV切斷的丙氨酸，故Exendin-4被吸收入血後的半衰期較長(tl/2 = 2. 4小時)。Exendin-4是一種強效GLP-I受體激動劑，能模擬GLP-I這種內源性多肽的糖調控作用，降低空腹和餐後血糖。Exendin-4的活性主要通過與人體胰臟GLP-I受體結合而介導，由環腺苷酸(cAMP)依賴和β細胞分化機制引發葡萄糖依賴的胰島素合成和分泌。 因為Exendin-4的胺基酸結構及生物活性與GLP-I均具有相關性，故通常它也被視為腸促胰島素的一種。由於Exendin-4的降糖作用時間較GLP-I長，延緩胃排空和抑制攝食衝動對肥胖病人體重的有益作用又有別於傳統的降糖藥物，因此其在作為2型糖尿病治療藥物開發方面具有巨大的潛力。隨著Exendin-4結構為活性單體的藥物(英文通用名為Exenatide，中文名為艾塞那肽，由Lily公司生產)於2005年在美國上市，Exendin-4作為GLP-I家族中的一員在治療糖尿病方面引起廣泛的關注。但是，現在上市的Exendin-4藥物依然存在著半衰期短的問題，藥用的Exenatide 為每日注射兩次，極大地增加的患者的痛苦。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種融合蛋白，該融合蛋白具有GLP-I或其類似物 Exendin-4的活性，並且在體內的存留時間長，從而克服現有技術中GLP-I或Exendin-4需要每天多次注射給藥的缺陷。本發明的另一目的是提供編碼該融合蛋白的核酸序列、包含該核酸序列的重組載體以及包含該重組載體的宿主細胞。本發明的再一個目的是提供製備該融合蛋白的方法。本發明的又一個目的是提供該融合蛋白的應用。本發明的還一個目的是提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含所述融合蛋白有效成分以及一種或多種藥學上可接受的輔料。
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用於實現上述目的的技術方案如下一方面，本發明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4(I)其中，連接肽為GGGGS ；人源蛋白選自人血清白蛋白(HSA)或IgG的Fc片段。優選地，所述人源蛋白為HSA。相應地，本發明還提供了編碼上述融合蛋白的核酸序列，包含該核酸序列的重組載體，以及包含該重組載體的宿主細胞。另一方面，本發明提供一種上述融合蛋白的製備方法，所述製備方法包括在表達可檢測量的所述融合蛋白的條件下轉錄和翻譯上述核酸序列的步驟。具體來說，上述融合蛋白的製備方法包括以下步驟1)構建所述融合蛋白的核酸序列；2)構建包含步驟1)的核酸序列的表達載體；3)將步驟2、的表達載體用於轉染或轉化宿主細胞，並使所述核酸序列在宿主細胞中表達。又一方面，本發明提供了上述的融合蛋白、核酸序列、重組載體或宿主細胞在製備治療糖尿病，肥胖症，和/或糖尿病、肥胖症相關疾病的藥物中的應用。再一方面，本發明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含上述融合蛋白和一種或多種藥學上可接受的輔料。優選地，所述藥物組合物為液體注射劑或凍幹注射劑。現結合本發明的目的對本發明逐一加以描述。本發明的通式I的融合蛋白如下述所示Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4通式I其中，連接肽優選為含有5個胺基酸殘基的肽鏈，序列為GGGGS (SEQ IDNO 5)；Exendin-4 胺基酸序列(SEQ ID NO 6)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS人源蛋白為人血清白蛋白或IgG Fc部分。本發明的通式I的Exendin-4融合蛋白是通過下述方法製備的構建編碼本發明的融合蛋白的DNA 本發明中的融合蛋白可以從各種來源獲得野生型白蛋白和免疫球蛋白，例如這些蛋白可以從由表達野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的組織或細胞的cDNA文庫獲得。本發明採用標準的PCR方法對相關的融合蛋白的mRNA進行篩選，通過公開的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列設計引物。 本發明的融合蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)優選來源於天然人序列，以減少融合蛋白在人體內潛在的免疫原性危險。本發明中將根據人血清白蛋白的公開序列設計PCR引物，從人血RNA中釣取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通過標準的mRNA逆轉錄技術，將融合的mRNA逆轉錄為DNA。
構津本發明中Exendin-4融合蛋白載體利用本領域常規的PCR突變技術製備連接有連接短肽的Exendin-4用以與蛋白表達質粒的連接。連接技術是本領域常規操作，本發明利用PCR將含有連接肽的Exendin-4 與蛋白表達質粒通過T4連接酶進行連接，得到本發明中所有融合蛋白的表達載體。一旦產生了編碼完整融合蛋白的表達載體，它可以用來轉染大腸桿菌，生產融合蛋白。重組DNA載體轉化或轉染細胞的技術是本領域的常規技術。隨汰本劍月_輔_一細去用本發明中的表達載體轉染或轉化宿主細胞，用於表達融合蛋白。參考本領域常規的蛋白表達技術優化本發明中各種融合蛋白的表達，用於增加細胞培養物的原則、技術(例如培養基、溫度、PH 等)可以參見 Mammalian CellBiotechnology :A Practical Approach, Μ. Butler。本發明中的Exendin-4融合蛋白的表達採用本領域常規的Iac啟動子大腸桿菌融合蛋白表達技術，使用IPTG啟動Exendin-4融合蛋白的產生。本發明融合蛋白的純化:一旦本發明的融合蛋白在適當的宿主細胞中表達，可以通過標準的蛋白分離和純化技術對本發明中的融合蛋白進行純化。例如根據融合蛋白表達載體內的標籤進行融合蛋白的粗提純。本發明中，純化後的融合蛋白可以通過超濾方法將其濃縮至藥用濃度，融合蛋白經過紫外線的處理用以增加其藥用的安全性。本發明的融合蛋白的表徵本發明中，可以用許多方法表徵本發明的融合蛋白。這些方法中的一些包括與蛋白染色偶聯的SDS-PAGE或免疫印跡技術。本發明中的融合蛋白通過免疫印跡的鑑定，例如使用Exendin-4的抗體。本發明的組合物本發明的Exendin-4融合蛋白，可以與一種或多種藥學上可接受的輔料共同製成藥物組合物，這些輔料包括水溶性填充劑、PH調節劑、穩定劑、注射用水、滲透壓調節劑等等。該藥物組合物可以通過肌肉、靜脈內、皮下等注射途經給藥，優選的劑型為凍幹或溶液注射劑；本發明所述的水溶性填充劑輔料包括甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一種或幾種的組合；PH調節劑包括枸櫞酸、磷酸、鹽酸等非揮發性的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銨，碳酸鈉、碳酸鉀或碳酸銨鹽，碳酸氫鈉或鉀或銨鹽等生理可接受的有機或無機酸和鹼及鹽等一種或幾種的組合；穩定劑包括EDTA_2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、穀氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。優選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。滲透壓調節劑包括氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。本發明提供包含所述融合蛋白的注射製劑，所述注射製劑的製備可以示範性參考以下步驟(1)凍幹劑
取Exendin-4融合蛋白和水溶性填充劑、穩定劑、滲透壓調節劑等，加入注射用水適量，調節PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌 10-20分鐘，脫碳，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，採用冷凍乾燥法，製得白色疏鬆塊狀物，封口即得。(2)溶液注射液取Exendin-4融合蛋白和水溶性填充劑、穩定劑、滲透壓調節劑等，加入注射用水適量，調節PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌 10-20分鐘，脫碳，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，封口即得。本發明的Exendin-4融合蛋白具有更長的體內存留時間，可作為有效成分製備糖尿病治療藥物。其在相當寬的劑量範圍內是有效的，劑量可由醫生根據有關的情況來決定， 這些情況包括被治療者的身體狀態、給藥途徑、年齡、體重、對藥物的個體反應，症狀的嚴重程度等。一般來說，本發明活性成分的有效量lX10_7-20mg/kg/天，可以單劑量給藥或分劑量給藥。與現有技術相比，本發明至少具有以下優點1、本發明的融合蛋白在體內的存留時間較長，避免了同類產品在用於治療時需要每天多次注射給藥的缺陷，便於臨床應用。2、本發明的融合蛋白優選來源於人的天然序列，減少了融合蛋白在人體內潛在的免疫原性風險。3、本發明的融合蛋白可以通過濃縮至藥用濃度，作為藥物有效成分與一種或多種藥學上可接受的載體等組分製備成藥用組合物，用於糖尿病及肥胖症等疾病和相關病症或疾病的治療中。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施例，其中圖1顯示了融合蛋白免疫印跡結果，其中1為融合蛋白的Exendin-4免疫印跡，2 為本發明的融合蛋白的HSA免疫印跡；圖2顯示了本發明的融合蛋白的降血糖功能圖3顯示了本發明的融合蛋白的克隆載體構建圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其後所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。實施例1 人血清白蛋白編碼DNA的構建本發明中將根據人血清白蛋白的公開序列設計PCR引物(SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2)，從人血RNA中釣取人血清白蛋白的mRNA。在進行人血清白蛋白mRNA逆轉錄實驗中，設計PCR引物使人血清白蛋白的編碼DNA末端含有適合與載體連接的酶切位點 (KpnI-HSA-NotI)。通過標準的mRNA逆轉錄技術，將融合的mRNA逆轉錄為DNA。
SEQ ID NO 1 :5TTATA GGT ACCAAG TGG GTA ACC TTT ATT TCCCTT3SEQ ID NO 2 :5AATTAT GCG GCC GCTAA GCC TAA GGC AGC TTGACT3將PCR產物進行KpnI/NotI雙酶切，產物進行純化以去除內切酶。實施例2 :「Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-」 編碼 DNA 的構津本專利採用全基因合成方法製備編碼「Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exen din-4-GGGGS-」的雙鏈DNA，基因序列為SEQID NO 3。本實施例中合成的編碼DNA具有以下特徵1、5』端具有NdeI酶切位點，其用於與表達載體pETMb連接；2、3』端具有KpnI酶切酶切位點，其用於與HSA的5』端連接。SEQ ID NO 3 5TATATCATATGCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAAC GGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCGGTACCATATT3將產物進行(Ndel/Kpnl)雙酶切，並進行純化。純化後的DNA與實例例1中的 HSA (KpnI/NotI酶切後)利用！"4連接酶進行連接，由此構建Exendin-4-GGGGS-Exendin_4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-HSA 完畢。實施例3 :「-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4」 編碼 DNA 的構建本專利採用全基因合成方法製備編碼「-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGG GS-Exendin-4」的雙鏈DNA，基因序列為SEQ ID NO 4。本實施例中合成的編碼DNA具有以下特徵1、5』端具有NotI酶切位點，其用於與HSA的3』端連接端；2、3』具有BamHI酶切位點，其用於與表達載體PETMb連接。SEQ ID NO 4 5TAATTTAGCGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGGGCGGCGGCGGCTCCCATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCGTAATAAGGATCCATTGATT3將產物進行(Notl/BamHI)雙酶切，並進行純化。純化後的DNA與實施例2中的E
7xendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-HSA 利用 T4 連接酶進行連接。由此 「Exendin-4-GGG-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-HSA-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4」 構建完畢。t施例4 構律本發明中Exendin-4融合蛋白表汰裁體及融合蛋白的鈍化將表達質粒pETMb進行雙酶切(Ndel/BamHI)，然後與實施例4中的產物通過 Ndel/BamHI酶切位點進行連接。一旦產生了編碼完整融合蛋白的表達載體，它可以用來傳染大腸桿菌，生產融合蛋白。重組DNA載體轉化或轉染細胞的技術是本領域的常規技術。將構建完畢的 pETMb [Exendin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4GGGGS-HSA-GGGGS-Exe ndin-4-GGGGS-Exendin-4-GGGGS-Exendin-4](命名為 pET15b6Exendin_4HSA，示意圖見圖 3)以熱擊轉化的方法轉入BL21(DE!3)感受態細胞，熱擊轉化方法為本領域常規的技術。將轉化後的融合蛋白表達載體在含有氨苄青黴素抗生素的LB培養平皿上培養篩選具有氨苄青黴素抗性的細胞。將得到的具有氨苄青黴素抗性的細菌細胞擴大培養後，進行質粒提取及純化，質粒進行序列鑑定完全正確。將過夜的菌液1 100比例以LB新鮮培養基稀釋，37°C培養菌液直至0D600達到 0.6，使用IPTG啟動融合蛋白的表達，並將體系溫度降至25°C。融合蛋白表達16小時後，將菌液離心，收集後，超聲波破碎菌體，操作程序為dOcycles，15秒/cycle。將破碎後的菌液高速離心，上清液被注入鎳柱。用鎳柱捕獲含6XHIS標籤的融合蛋白，並利用咪唑的濃度梯度對融合蛋白進行洗脫。將洗脫的蛋白收集，利用具有IOkDa半透膜的離心管對收集的蛋白進行透析及濃縮。凝血酶處理純化後的融合蛋白用來切除N末端的6XHIS標籤，凝血酶的酶切技術參考hvitrogen公司的實驗手冊。利用GelFiltration S-200蛋白純化柱進行反應混合物的分離，同時對目標融合蛋白進行精純。上述純化後的融合蛋白經IOK過濾膜過濾濃縮後，紫外線滅菌處理。實施例5 :Exendin-4融合蛋白的免疫印跡鑑定用含1 % SDS和2mg溴酚藍的PBS稀釋純化後的融合蛋白。煮沸變性後，取20 μ 1 樣品置SDS-PAGA膠上，電泳後，將蛋白轉至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉溫室封閉2小時，加入鼠抗人Exendin-4的單抗(SantaCruz，USA)室溫下孵育1小時，然後用HRP標記的兔抗鼠的多抗進行二抗結合，用ECL試劑盒發光顯色(Amersham Pharmacia Biotech，USA)。 結果如圖1所示本發明的融合蛋白得到了較好的表達。^mm 6 ^m^^mm^m^mmm^取實施例5的融合蛋白10mg，穩定劑精氨酸0.2g，聚乙二醇60000.05g置於容器中，加注射用水80ml，攪拌使溶解，再加入甘露醇Sg、山梨醇2g，攪拌使溶解，以0. lmol/L的氫氧化鈉調節PH至6. 0-8. 0，補加水至100ml。加入0. 3g活性碳，在10-25°C下攪拌20分鐘，脫碳，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支Iml進行分裝。預凍2小時後，冷凍下減壓乾燥18小時，至樣品溫度到15-20°C後，再乾燥5小時，製得白色疏鬆塊狀物，封口即得白色凍乾粉針，規格IOOug/支。 ^mm τ ^m^^mm^m^mmm^ 取實施例5的融合蛋白25mg，加穩定劑磷酸氫二鉀0. 05g，氯化鈉0. 9g，置於容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g攪拌使溶解，用0. lmol/L的氫氧化鈉調節PH至6. 5-8. 5，補加水至100ml，加入0. 25g活性碳，在10_2(TC下攪拌20分鐘，脫碳，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支2ml進行分裝，預凍2小時後，冷凍下減壓乾燥15 小時，至樣品溫度到15-20°C後，再乾燥5小時，製得白色疏鬆塊狀物，封口即得白色凍乾粉針，規格500ug/支。實施例8 含融合蛋白的藥物組合物溶液製劑的製備取實施例5的融合蛋白50mg，加入穩定劑三羥甲基氨基甲烷0.2g，焦亞硫酸鈉 0. lg、氯化鈉0. 9g至容器中，加注射用水80ml中攪拌溶解，加入碳酸氫鈉調節PH為6_8，補加水至100ml，加入0. 2g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，採用微孔濾膜過濾除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，規格IOOOug/支。實施例9 含融合蛋白的藥物組合物溶液製劑的製備取實施例5的融合蛋白5mg，穩定劑穀氨酸O.Olg、氯化鉀0.09g至容器中，加注射用水70ml攪拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖Ig攪拌溶解。加氫氧化鈉調節PH為7. 0-8. 5， 補加水至100ml，加入0. 05g活性炭，在10-25°C攪拌吸附20分鐘，除炭，採用微孔濾膜過濾除菌，以每支Iml灌封、即得融合蛋白注射液，規格50ug/支。實施例10 融合蛋白的體內藥代動力學給大鼠注射Exendin-4及其融合蛋白(折合含Exendin-4為0. 5mg/kg)，分別於注射前及注射後0. 5、1、3、6、9、12、24、36和48小時後於眼叢靜脈取血約0. ^il,製備血清備用。Exendin-4濃度測定方法採用酶聯免疫吸附方法(ELISA)檢測小鼠血清中融合蛋白的濃度，操作如下4°C離心分離血漿。用羊抗鼠的Exendin-4濃度測定試劑盒(R&D System Co.，Ltd)對鼠血漿中的Exendin-4融合蛋白的濃度進行測定。將1 1稀釋後的鼠血漿樣品加入96孔板，加入同體積的Exendin-4抗體後，37°C孵育1小時。使用洗液清洗96孔板3次，加入HRP後孵育30分鐘。同樣的方法對96孔板進行清洗，然後加入50 μ 1 底物A及底物B，37°C孵育10分鐘。用硫酸中止反應後測定450-570nm值，並與標準濃度的 Exendin-4進行比對及根據ELISA結果計算藥代動力學參數。融合蛋白的體內藥代動力學結果見表1，結果顯示本發明的融合蛋白在體內的半衰期較單獨的Exendin-4明顯延長，具有長效特性。表1融合蛋白在大鼠體內的末相半衰期
權利要求
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示Exendin-4-連接肽-Exendin_4-連接肽-Exendin_4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4 (I)其中，連接肽為GGGGS ；人源蛋白選自HSA或IgG的Fc片段。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述人源蛋白為HSA。
3.編碼根據權利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列。
4.包含根據權利要求3所述的核酸序列的重組載體。
5.包含根據權利要求4所述的重組載體的宿主細胞。
6.一種根據權利要求1或2所述的融合蛋白的製備方法，所述製備方法包括在表達可檢測量的所述融合蛋白的條件下轉錄和翻譯權利要求3所述的核酸序列的步驟。
7.一種根據權利要求1或2中所述的融合蛋白的製備方法，所述製備方法包括以下步驟1)構建根據權利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列；2)構建包含步驟1)的核酸序列的表達載體；3)將步驟幻的表達載體用於轉染或轉化宿主細胞，並使所述核酸序列在宿主細胞中表達。
8.根據權利要求1或2所述的融合蛋白、權利要求3所述的核酸序列、權利要求4所述的重組載體或權利要求5所述的宿主細胞在製備治療糖尿病，肥胖症，和/或糖尿病、肥胖症相關疾病的藥物中的應用。
9.一種藥物組合物，該藥物組合物包含根據權利要求1或2所述的融合蛋白和一種或多種藥學上可接受的輔料。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物為液體注射劑或凍幹注射劑。
全文摘要
本發明公開了一種新型的Exendin-4融合蛋白，所述融合蛋白由通式I表示Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-人源蛋白-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4-連接肽-Exendin-4(I)其中，連接肽為GGGGS；人源蛋白選自HSA或IgG的Fc片段。本Exendin-4融合蛋白能夠有效增加Exendin-4的血液半衰期，克服其因為半衰期短而無法在臨床上使用的現狀，在糖尿病、肥胖症治療藥物領域較有應用前景。本發明還公開了所述融合蛋白的製備方法及其應用。
文檔編號A61K38/22GK102453094SQ20101052643
公開日2012年5月16日 申請日期2010年11月1日 優先權日2010年11月1日
發明者付剛, 劉鵬, 徐為人, 湯立達, 王玉麗, 鄭學敏, 龔珉 申請人:天津藥物研究院