一種從小腸浸出液中提取肝素和硫酸皮膚素的方法
2023-05-26 10:23:06 2
一種從小腸浸出液中提取肝素和硫酸皮膚素的方法
【專利摘要】本發明提供了一種從豬小腸浸出液中獲得高純度肝素和高純度硫酸皮膚素的方法，本發明以豬小腸黏膜浸出液為原料，通過離子交換層析、透析、旋蒸、有機溶劑沉澱生產高純度的肝素鈉以及高純度的硫酸皮膚素。通過離子交換層析的分步洗脫得到兩步洗脫液，以透析法除鹽，經旋蒸濃縮得濃縮液，再進行一步醇沉即得到高純度肝素與硫酸皮膚素。在離子交換樹脂的洗脫中使用了梯度的氯化鈉溶液洗脫，從而使肝素和硫酸皮膚素能在不同的洗脫液濃度下分離下來，達到了肝素與硫酸皮膚素的分離，並且分別提高了肝素和硫酸皮膚素的純度，且效價也有了提高，分子量分布及旋光度均符合藥典要求。
【專利說明】一種從小腸浸出液中提取肝素和硫酸皮膚素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於製藥與化工領域，涉及肝素和硫酸皮膚素的製備方法，具體涉及從小腸浸出液中提取肝素和硫酸皮膚素的方法。
【背景技術】
[0002]肝素鈉(heparin sodium)是N-硫酸和艾杜糖醒酸含量較多的一種糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙醯氨基葡糖形成重複二糖單位組成的多糖，目前肝素鈉生產主要是從豬的小腸黏膜中提取，它屬粘多糖(GAG)類物質，在體內外都有抗凝血作用。臨床上主要用於血管栓塞性疾病、心血管手術、心臟導管檢查、體外循環和血液透析等。[0003]硫酸皮膚素(dermatan sulfate, DS或CSB)也是糖胺聚糖的一種，由N-乙醯氨基半乳糖-β -1, 4-L-艾杜糖醛酸-α (或D-葡萄糖醛酸-β ) -1，3的二糖重複單位構成的多糖。DS廣泛分布於動物組織中，屬於硫酸軟骨素(CS)的一種，具有抗血栓、抗水腫、促進皮膚更新、阻止皮膚的過度角質化和棘皮症、滋潤皮膚和保持水分的作用，可用於降血脂、骨關節疾病治療以及滴藥液。
[0004]傳統的硫酸皮膚素來源於動物皮層或牛肺中，特別是水生生物(如鮫錬魚等)的皮層，通過酶降解和酸鹼沉澱的方式得到，最後再通過離子交換層析獲得高純度的硫酸皮膚素。目前較為成熟的提取方法是從鮫錬魚皮中進行提取，再通過醇沉凍幹後即可得硫酸皮膚素粗品，該法得到的硫酸皮膚素粗品灰色粉末狀，純度為75 %。
[0005]2006年唐明龍等人(專利申請號:200610039006.5)以粗品肝素為原料，通過離子交換、高錳酸鉀氧化、超濾和有機溶劑分級沉澱生產高純度肝素鈉原料藥，該方法使用不同濃度的氯化鈉溶液進行了多次洗脫，有效的分離了雜質，所得的肝素鈉效價、光吸收等指標均達到國家藥典要求。
[0006]2009年李坦等人(專利申請號:200910039361.6)以肝素副產物為原料，通過酸鹼
沉澱，再以離子交換吸附，線性梯度洗脫，最後以濃縮醇沉後得到高純度的硫酸皮膚素，其所得的硫酸皮膚素的HPLC測定純度，旋光度及抗凝效價的檢測均較為理想。
[0007]目前國內的肝素生產以粗品肝素為主，其中含有大量的硫酸皮膚素，本發明提供的從豬小腸黏膜浸出液中一步純化肝素和硫酸皮膚素的方法，不僅提高了產品的質量，得到了高純度的肝素，並且充分利用了生產的副產物，得到了高純度硫酸皮膚素，所得的肝素和硫酸皮膚素的純度均較高，適合用於工業的大規模生產。
【發明內容】
[0008]本發明的任務是提供一種從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法和一種從小腸浸出液中提取肝素的方法，以改進現有粗品肝素的生產工藝，提高肝素產品的純度，以解決目前生產的粗品肝素中含有大量硫酸皮膚素雜質的問題，獲得能用於生產注射級精品肝素以及藥用級硫酸皮膚素。[0009]實現本發明的技術方案是:
[0010]本發明提供的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，包括以下步驟:
[0011]步驟一:稱取新鮮豬小腸黏膜，在絞肉機中絞碎，加入重量為豬小腸黏膜重量
0.25%的市售胰蛋白酶，37°C攪拌30分鐘；加入重量為豬小腸黏膜重量3%的氯化鈉一邊攪拌一邊加入30%的氫氧化鈉溶液，直至pH達到9.0 ;於55°C保溫繼續以20rpm速度攪拌2~3小時；升溫至95°C 10分鐘，迅速冷卻到室溫，即得豬小腸黏膜浸出液；將豬小腸黏膜浸出液用2層市售醫用紗布過濾，除去大顆粒的不溶物，得澄清的無色液體；加入0.5-1.5倍體積的去離子水，使豬小腸黏膜浸出液總體積達到稀釋1.5-2.5倍，即得到稀釋後的豬小腸黏膜浸出液；
[0012]步驟二:取已填充D254樹脂或Amberlite樹脂或Lewatit樹脂的填充柱,將填充柱固定到常規的層析設備上，填充柱以去離子水清洗2個柱體積；利用蠕動泵以3mL/min的速度將稀釋後的豬小腸黏膜浸出液加入D254樹脂填充柱，加入稀釋後豬小腸黏膜浸出液體積為柱體積的1.5~2.0倍；待豬小腸黏膜浸出液後全部加到填充柱後，向填充柱加入2倍柱體積的PH8.5的Tris-HCl的緩衝液；
[0013]步驟三:向填充柱加入1.1~1.3mol/L氯化鈉溶液，進行第一次洗脫，洗脫流速為5mL/min，具體收集體積以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準，將收集的洗脫液標為洗脫液I ;向填充柱加入2.0~2.3mol/L氯化鈉溶液，進行第二次洗脫，洗脫流速為5mL/min ；具體收集體積也以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準，將收集洗脫液標為洗脫液2 ;
[0014]步驟四:先按以下(A)、(B)兩種方法中的一種製取濃縮洗脫液1: [0015](A)將步驟3獲得的洗脫液I通過1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液I ;旋蒸度具體可以是60°C。
[0016](B)採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液I進行超濾，當體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液I ;所述的採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液I進行超濾的具體方法可以是:採用密理博公司的Pellicom超濾系統，以1000Da的超濾膜進行超濾，當體積濃縮4.5~5.0倍即可。
[0017]再向所得濃縮洗脫液I中加入分析純無水乙醇，使乙醇濃度達到40~50%，出現白色沉澱物，通過離心，去除上清，將沉澱在60°C烘箱中放置過夜，獲得純度為85~89%的硫酸皮膚素。
[0018]本發明提供的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法是:
[0019]先將權利要求1之步驟三獲得的洗脫液2，按照以下(a)、(b)兩種方法中的一種製備濃縮洗脫液2:
[0020](a)將步驟3獲得的洗脫液2通過1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液2 ;旋蒸度具體可以是60°C ；
[0021](b)採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液2進行超濾，當體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液2 ;所述的採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液2進行超濾的具體方法可以是:採用密理博公司的Pellicom超濾系統，以1000Da的超濾膜進行超濾，當體積濃縮4.5~5.0倍即可；[0022]再向所得濃縮洗脫液2中加入分析純無水乙醇，使乙醇濃度達到40~50%，出現白色沉澱物，通過離心去除上清，將沉澱在60°C烘箱中放置過夜，獲得純度為95~98%的肝素。
[0023]本發明以豬小腸黏膜浸出液為原料，在原有工藝的基礎上，通過離子交換層析、梯度洗脫、透析、旋蒸和醇沉最終生產得到高純度肝素和硫酸皮膚素。對獲得的硫酸皮膚素與肝素採用常規旋光儀測定其旋光度，採用常規高效液相色譜測定其純度，採用羊血漿法測定其效價。本發明利用硫酸皮膚素和肝素的離子強度差異所導致的與強陰離子樹脂的吸附強度的不同，在不同的氯化鈉濃度下洗脫使肝素與硫酸皮膚素分離，硫酸皮膚素在較低濃度的洗脫下得到充分的分離，肝素在第二個梯度的洗脫液濃度下得到充分的分離，洗脫步驟中應嚴格按照規定濃度的洗脫液進行，否則將影響硫酸皮膚素與肝素的純度。本發明仍然是採用傳統的離子交換層析的方法進行分離，對肝素和硫酸皮膚素的分子結構與性質並沒有影響，本發明在維持了當前肝素生產工藝的生產成本的基礎上，提高了產品的質量，並且充分利用也生產中的副產物，純化所得到的肝素的效價及分子量測定均符合《中國藥典》相關要求。
[0024]本發明與現有公開的中國專利申請號為200610039006.5的技術方案相比，200610039006.5號專利的主要特徵是將粗品肝素通過二次離子交換層析獲得更純的肝素，而本發明與其主要差別在於省去了第二次的重複層析步驟；直接以豬小腸黏膜為原料進行，而不是以粗品肝素為原料；改進了現在常用的洗脫方法，使肝素純度得到了提升；同時得到了純度為85~89%的硫酸皮膚素。本發明不僅簡化了肝素生產工藝，同時也提高了生產的收益，獲得了更大的綜合效益。在肝素與硫酸皮膚素濃縮階段引進與應用超濾技術，可直接擴大到生產規模，提高了生產效率，節約了生產成本。與現有公開的硫酸皮膚素的專利(中國專利申請號:200910039361.6)提取方法相比，本發明的優勢在於，不是在肝素生產工藝之外，專門從從副產物裡分離純化硫酸皮膚素，而是在肝素生產的同時，基本不增加額外的工藝手段，僅僅更改一次洗脫濃度，即獲得了純度高達85~89%的硫酸皮膚素，大大減少了工藝步驟並且縮短了生產周期。
[0025]總體而言，本發明的優勢`在於一次層析技術，分步洗脫獲得純度高達95~98%的肝素與純度高達85~89%的硫酸皮膚素，工藝技術可直接擴大到生產規模。本發明可一次實現傳統的粗品肝素生產、粗品肝素再加工成精品肝素(純度95%以上的肝素)、肝素生產副產品中提取硫酸皮膚素等三類生產過程，極大提高生產效率。
[0026]本發明在分析肝素與硫酸皮膚素在結構上的差異(硫酸化程度不同而導致的帶電荷數與分子量的差異)基礎上，利用離子交換層析對豬小腸黏膜浸出液進行純化，通過兩次不同的洗脫液濃度將肝素和硫酸皮膚素分別洗脫下來，通過精確的控制洗脫液的濃度及其它相關條件，本發明不僅有效地分離肝素和硫酸皮膚素，而且肝素和硫酸皮膚素純度經SAX-HPLC分析，分別達到95~98%和85~89%，旋光度分別為+55和-40，效價分別為170USP/mg和 8USP/mg。
[0027]本發明製得的肝素可做為原料藥，用於口服或注射用肝素鈉的生產，亦可用於下遊低分子量肝素鈉的生產；本發明製得的硫酸皮膚素可用於口服或注射用硫酸皮膚素的生產。本發明通過對現有的離子交換層析工藝的改進，在原有工藝上的升級使粗品肝素的生產向上提升了一個臺階，向精品肝素與精品硫酸皮膚素的生產上過渡，對當前國內絕大多數以生產粗品肝素用於出口的現狀改善有一定的幫助。本發明有其獨特的創新性與實用性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1:豬小腸黏膜浸出液AKTA蛋白層析檢測的洗脫峰，其中:A1、A2分別為215nm、298nm吸收光譜下的洗脫液I ;B1、B2分別為215nm、298nm吸收光譜下的洗脫液2。
[0029]圖2、圖3、圖4、圖5:為各類樣品的強陽離子高效液相色譜(SAX-HPLC)圖譜，其
[0030]中:圖2為市售肝素標準品、硫酸皮膚素標準品混合樣品的SAX-HPLC圖譜，圖2中
[0031]A為硫酸皮膚素標準品；B為肝素標準品；
[0032]圖3為市售粗品肝素的SAX-HPLC圖譜，圖3中A為粗品肝素中的硫酸皮膚素雜質；B為粗品肝素中的肝素峰；
[0033]圖4為洗脫液I的SAX-HPLC圖譜，圖4中A為洗脫液I中的硫酸皮膚素峰；B為洗脫液I中的肝素峰；
[0034]圖5為洗脫液2的SAX-HPLC圖譜，圖5中A為洗脫液2中的硫酸皮膚素峰應出現的位置為洗脫液2中的肝素峰。
[0035]圖6:本發明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0036]實施例1:50mL豬小腸黏膜浸出液層析分離肝素與硫酸皮膚素
[0037]取新鮮豬小腸黏膜，在絞肉機中絞碎，加入重量為豬小腸黏膜重量0.25%的市售胰蛋白酶，37°C攪拌30分鐘；加入重量為豬小腸黏膜重量3%的氯化鈉一邊攪拌一邊加入30%的氫氧化鈉溶液，直至pH達到9.0 ;於55°C保溫繼續以20rpm速度攪拌2.5小時；升溫至95°C 10分鐘，迅速冷卻到室溫，即得豬小腸黏膜浸出液；將豬小腸黏膜浸出液用2層市售醫用紗布過濾，除去大顆粒的不溶物，得澄清的無色液體；加入I倍體積的去離子水，使豬小腸黏膜浸出液總體積達到稀釋2倍，得到稀釋後的豬小腸黏膜浸出液；再依次按以下步驟操作:
[0038]1.取發明步驟3所得的豬小腸黏膜浸出液50mL，以2層潔淨的市售醫用紗布過濾除去大顆粒的不溶物；
[0039]2.加入去離子水50mL，充分攪拌；
[0040]3.取200g大孔陰離子樹脂D254，加入4%氫氧化鈉與4mol/L氯化鈉溶液浸泡過夜，將經過浸泡的樹脂填入填充柱(Φ3αιιΧ 15cm)，柱體積為60mL ；
[0041]4.將上步驟製備的填充柱固定在AKTA蛋白純化儀的支架上，上下埠分別連接矽膠管，上端矽膠管固定在蠕動泵上，下端矽膠管連接到檢測器入口 ；
[0042]5.層析實驗條件如下:
[0043]215/298nm 雙波長檢測；
[0044]A泵:去離子水O;
[0045]B 泵:4mol/L 氯化鈉 O ;
[0046]以手動方式控制蠕動泵速度和開關，調控樣品、緩衝液加入填充柱；
[0047]6.以3mL/min的速度加入待分離的樣品共lOOmL，然後開動A泵用緩衝液A淋洗60mL ；
[0048]7.加入1.15mol/L氯化鈉緩衝液進行第1次洗脫，當洗脫峰A2下降到漸趨水平時，收集洗脫液90mL，參見圖1 ;
[0049]8.加入2.0mol/L氯化鈉緩衝液進行第2次洗脫，當洗脫峰B2下降到漸趨平緩時，收集洗脫液60mL，參見圖1 ;
[0050]9.將步驟7、8所得洗脫液收集後分別於60°C下旋蒸濃縮5倍；
[0051]10.取所得的濃縮液各lmL，分別加入4mol/L氫氧化鈉0.1mL,振蕩10分鐘，再分別加入2mol/L鹽酸0.2mL，振蕩10分鐘，進行酸鹼除蛋白處理；
[0052]11.分別加入到常規離心式透析管(1000Da)，離心透析，再分別採用0.45 μ m—次性濾器過濾，利用SAX-HPLC分別檢測；
[0053]12.HPLC 條件如下:
[0054]儀器為AgilentllOO高效液相色譜儀
[0055]色譜柱為1nPac ASll-HC戴安陰離子分析柱(250X4mm)
[0056]流動相A為超純水
[0057]流動相B為2.5mo l/L氯化鈉,含20mmol/LTris,用磷酸調節pH至3.0
[0058]線性梯度洗脫:流速為0.3mL/min,進樣體積為10 μ L，檢測波長為215nm 二元梯度為:02min:95%流動相A和5%流動相B ；26min:100%流動相B ；31min:100%流動相B ；32-40min:95%流動相A和5%流動相B
[0059]13.將市售的肝素標準品與硫酸皮膚素標準品按2: I的質量比混合，按照步驟12的條件進行HPLC檢測，獲得肝素標準品與硫酸皮膚素標準品HPLC液相圖譜，見附圖2，圖2中A為硫酸皮膚素標準品；B為肝素標準品；
[0060]14.將市售的粗品肝素按照步驟12的條件進行HPLC檢測，獲得粗品肝素HPLC液相圖譜，見附圖3，圖3中A為粗品肝素中的硫酸皮膚素雜質；B為粗品肝素中的肝素峰；
[0061]15.將步驟11處理後的濃縮洗脫液I按照步驟12的條件進行HPLC檢測，獲得洗脫液IHPLC液相圖譜，見附圖4，圖4中A為洗脫液I中的硫酸皮膚素峰；B為洗脫液I中的肝素峰；
[0062]16.將步驟11處理後的濃縮洗脫液2按照步驟12的條件進行HPLC檢測，獲得洗脫液2HPLC液相圖譜，見附圖5，圖5中A為洗脫液2中的硫酸皮膚素峰應出現的位置；B為洗脫液2中的肝素峰；
[0063]計算得圖4中硫酸皮膚素的純度為88%,圖5中肝素的純度為96.6% ；
[0064]17.將步驟9分別得到的濃縮洗脫液1、洗脫液2分別加入相同體積的無水乙醇，出現沉澱，將沉澱置於60°C烘箱過夜烘乾；
[0065]18.將步驟17製備的烘乾樣品分別取少量，加入去離子水溶解成40mg/mL的樣品，在實驗室常規旋光度儀上測定旋光度，洗脫液I與洗脫液2的旋光度分別為+55和-40，採用羊血漿法測得效價分別為170USP/mg和8USP/mg。
[0066]【參考文獻:(I)張虹，鮫錬魚皮硫酸皮膚素的提取，食品與發酵工業，2009，35(2):167 ； (2)唐明龍，粗品肝素黃分離純化為高純度肝素鈉的方法，發明專利，2006 ;(3)李坦等，一種從肝素副產物中純化硫酸皮膚素的方法，發明專利，2009 ; (3)國家藥典委員會，《中華人民共和國藥典》(三部)，化學工業出版社，2010.】。
【權利要求】
1.一種從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，包括以下步驟:
步驟一:稱取新鮮豬小腸黏膜，在絞肉機中絞碎，加入重量為豬小腸黏膜重量0.25%的市售胰蛋白酶，37°C攪拌30分鐘；加入重量為豬小腸黏膜重量3%的氯化鈉一邊攪拌一邊加入30%的氫氧化鈉溶液，直至pH達到9.0 ;於55°C保溫繼續以20rpm速度攪拌2~3小時；升溫至95°C 10分鐘，迅速冷卻到室溫，即得豬小腸黏膜浸出液；將豬小腸黏膜浸出液用2層市售醫用紗布過濾，除去大顆粒的不溶物，得澄清的無色液體；加入0.5-1.5倍體積的去離子水，使豬小腸黏膜浸出液總體積達到稀釋1.5~2.5倍，即得到稀釋後的豬小腸黏膜浸出液； 步驟二:取已填充D254樹脂或Amberlite樹脂或Lewatit樹脂的填充柱,將填充柱固定到常規的層析設備上，填充柱以去離子水清洗2個柱體積；利用蠕動泵以3mL/min的速度將稀釋後的豬小腸黏膜浸出液加入D254樹脂填充柱，加入稀釋後豬小腸黏膜浸出液體積為柱體積的1.5~2.0倍；待豬小腸黏膜浸出液後全部加到填充柱後，向填充柱加入2倍柱體積的PH8.5的Tris-HCl的緩衝液； 步驟三:向填充柱加入1.1~1.3mol/L氯化鈉溶液，進行第一次洗脫，具體收集體積以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準，將收集的洗脫液標為洗脫液I ;向填充柱加入2.0~2.3mol/L氯化鈉溶液，進行第二次洗脫，具體收集體積也以298nm吸收峰值下降到洗脫前水平為準，將收集洗脫液標為洗脫液2 ； 步驟四:先按以下(A)、(B)兩種方法中的一種製取濃縮洗脫液1: (A)將步驟3獲得的洗脫液I通過1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液I ; (B)採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液I進行超濾，當體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液I ; 再向所得濃縮洗脫液I中加入分析純無水乙醇，使乙醇濃度達到40~50%，出現白色沉澱物，通過離心，去除上清，將沉澱在60°C烘箱中放置過夜，獲得純度為85~89%的硫酸皮膚素。
2.根據權利要求1所述的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，其特徵在於，在步驟三中，洗脫流速為5mL/min。
3.根據權利要求1所述的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，其特徵在於，在步驟四之方法(A)中，旋蒸溫度為60°C。
4.根據權利要求1所述的從豬小腸浸出液中提取硫酸皮膚素的方法，其特徵在於，在步驟四之方法(B)中，所述的採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液I進行超濾的具體方法是:採用密理博公司的Pellicom超濾系統，以1000Da的超濾膜進行超濾。
5.一種從小腸浸出液中提取肝素的方法，其步驟是: 先將權利要求1之步驟三獲得的洗脫液2，按照以下(a)、(b)兩種方法中的一種製備濃縮洗脫液2: (a)將步驟3獲得的洗脫液2通過1000Da的透析膜，在去離子水中透析除鹽，透析18~22h，體積增大45~55% ;在55~65°C下旋蒸45min，得到濃縮洗脫液2 ； (b)採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液2進行超濾，當體積減小到原體積的20~22%，得到濃縮洗脫液2 ；再向所得濃縮洗脫液2中加入分析純無水乙醇，使乙醇濃度達到40~50%，出現白色沉澱物，通過離心去除上清，將沉澱在60°C烘箱中放置過夜，獲得純度為95~98%的肝素。
6.根據權利要求5所述的從小腸浸出液中提取肝素的方法，其特徵在於，在方法(a)中，旋蒸溫度為60°C。
7.根據權利要求5所述的從小腸浸出液中提取肝素的方法，其特徵在於:方法(b)中所述的採用切向流超濾方法對步驟3獲得的洗脫液2進行超濾的具體方法是:採用密理博公司的Pellicom超濾系統，以1000Da的超濾膜進行超濾。
【文檔編號】C08B37/00GK103804506SQ201410047671
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月11日 優先權日:2014年2月11日
【發明者】朱俊銘, 馬繼華, 楊祥良 申請人:華中科技大學