自體造血幹細胞體外淨化的方法及試劑盒的製作方法
2023-05-26 10:22:11 2
專利名稱：自體造血幹細胞體外淨化的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及自體造血幹細胞移植過程中，對造血幹細胞中混有的腫瘤細胞的體外淨化方法、相應的試劑盒以及腫瘤的治療方法。
背景技術：
高劑量化放療聯合造血幹細胞移植是治療惡性腫瘤的一項重要技術，根據造血幹細胞的來源，造血幹細胞移植可分為自體造血幹細胞移植和異體造血幹細胞移植。自體造血幹細胞移植較異體移植有著不受供體限制、移植相關死亡率低、安全性高、花費低等優點。目前自體造血幹細胞移植已廣泛用於惡性腫瘤的治療研究，其對多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤患者有著肯定的療效(KumarA，et al.，Lancet Oncol.2003；4293-304；Schouten HC，et al.，J.Clin Oncol.2003；21(21)3918-27)。近10多年來，隨著外周血造血幹細胞移植技術的日趨完善，該項技術更被用於難治性乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、小細胞肺癌、鼻咽癌、兒童纖維母細胞瘤、軟組織肉瘤等實體瘤的治療研究，不少資料已顯示出較好的初步療效。
儘管自體造血幹細胞移植有許多優點，但自體造血幹細胞移植可能帶來的腫瘤細胞回輸，常常是腫瘤復發的根源(Brenner MK，et al.，Lancet.1993；34185-68)，特別是對於多發性骨髓瘤等血液系腫瘤，以及中高度惡性淋巴瘤、乳腺癌、兒童神經母細胞瘤、小細胞肺癌等骨髓高侵犯率腫瘤(Armitage JO，Antman K.High-Dose Cancer TherapyPharmacology，Hematopoietins，Stem cells(Third edition).2000 by LIPPINCOTT WILLIAMSWILKINS，pp301-331)。
90年代初期，有人根據造血幹細胞與惡性腫瘤細胞表面CD34抗原的差異，研發出了CD34陽性細胞免疫磁珠篩選純化技術(MACS)，曾給自體造血幹細胞體外淨化帶來了極大的希望，但經過10多年的臨床評價，人們發現儘管該技術可降低2～6個對數級的瘤細胞，但殘存的腫瘤細胞仍可導致腫瘤復發。
隨後有人根據造血幹細胞與惡性腫瘤細胞表面腺病毒受體的天然差異，提出了應用攜帶抑癌基因或自殺基因的複製缺陷型腺病毒淨化造血幹細胞的方法。但這種方法由於所用的複製缺陷型腺病毒只是一種載體，它本身不能殺死腫瘤細胞，其對腫瘤細胞的殺傷主要依賴攜帶的外源基因，而外源基因的抗腫瘤效應則依賴於腫瘤細胞是否存在對應的基因突變；而當採用攜帶自殺基因的複製型缺陷腺病毒時，抗腫瘤效應不僅依賴於自殺基因在腫瘤細胞內的表達，而且還依賴於腫瘤細胞對由抗腫瘤前藥轉化出的抗腫瘤藥物的敏感性。因此這類方法的應用是有局限性的。
因此，尋求更理想的造血幹細胞體外淨化方法仍是業內學者的主要攻關方向之一。本發明正是針對這一需求而完成的。
發明內容
針對現有技術的狀況並依據造血幹細胞與腫瘤細胞表面腺病毒受體的天然差異，發明人進行了大量深入的研究工作，使得本發明終於得以完成。
首先，本發明人通過攜帶綠色螢光蛋白基因的複製型缺陷型腺病毒(Ad-GFP)轉染造血幹細胞和腫瘤細胞，再通過螢光顯微鏡和流式細胞儀檢測，證實了腺病毒對多數腫瘤細胞轉染率較高，而對造血幹細胞很難轉染。本發明人在這一發現的基礎上，具體完成了如下
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種自體造血幹細胞體外淨化的新方法。在本發明的方法中，包括將含有腫瘤細胞的造血幹細胞與基因工程改造後的增殖性溶瘤病毒接觸和使增殖性溶瘤病毒進入腫瘤細胞的步驟。其中所述的腫瘤細胞包括血液系腫瘤細胞例如多發性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、惡性淋巴瘤等，還包括非血液系腫瘤細胞例如惡性淋巴瘤、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、小細胞肺癌、鼻咽癌、兒童纖維母細胞瘤、軟組織肉瘤等實體瘤細胞。所述的增殖性溶瘤病毒包括能選擇性在腫瘤細胞中增殖複製的腺病毒、單純皰疹病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和呼腸孤病毒。本發明優選的增殖性溶瘤病毒是增殖性腺病毒，特別是能被腫瘤細胞表面的腺病毒受體識別的缺失了E1B基因的腺病毒。所述的增殖性腺病毒包括缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒。
本申請人於1998年保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)的一種腺病毒就是一種缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒，其保藏號為CCTCC98003。下文中有時將CCTCC98003簡稱為H101。
在本發明的淨化方法中，若以腫瘤細胞為感染目標細胞，優選的是將增殖性腺病毒與造血幹細胞移植物中混有的腫瘤細胞按照10～10000MOI(腺病毒/腫瘤細胞)範圍進行接觸，較優選的MOI範圍為10-5000，更優選的MOI範圍是50-1000。當MOI低於10時，由於腺病毒的密度較低可能會使個別的腫瘤細胞沒能和腺病毒充分接觸並結合上，因而存在腫瘤細胞殘存的可能性；這時可藉助其他一些造血幹細胞的純化方法如MACS技術或再次進行與增殖性腺病毒接觸結合，以達到100％的淨化效果。當MOI高於10000時，可能對造血幹細胞回輸後的血液重建產生一些不利的影響；這時可能需要對患者施用一些有利於血液重建的藥物或其他醫療手段，因而，可能給患者增加醫療負擔。
在本發明的淨化方法中，優選的是將造血幹細胞移植物與增殖性腺病毒接觸30分鐘至8小時的時間，優選的是接觸1-4小時，更優選接觸2-4小時。當接觸時間低於30分鐘時，可能會由於腫瘤細胞與腺病毒結合不充分，而導致結合的病毒數量不夠，從而影響淨化效果。當接觸時間長於8小時時，對於淨化效果的提高不但沒有幫助，反而由於造血幹細胞在離體條件下存在的時間較長，可能導致造血幹細胞的存活力下降。
在本發明的淨化方法中，對於將造血幹細胞移植物和增殖性腺病毒的接觸方式沒有特別的限制，可以將造血幹細胞移植物加入到腺病毒保存液中，也可反過來。優選將腺病毒保存液加入到造血幹細胞移植物中。
在本發明的淨化方法中，還包括在將造血幹細胞移植物和增殖性腺病毒接觸之前，對從患者體內採集的造血幹細胞移植物進行離心和洗滌的步驟。離心的目的在於除去血清和血小板，減少血清和血小板存在對病毒感染腫瘤細胞的影響，洗滌步驟在於將殘存的血清和血小板成分除去。在本發明方法中所用的離心、洗滌和去除血清和血小板的方法、儀器和試劑均是本領域技術人員已知的。在和增殖性腺病毒接觸之前，優選用細胞培養液將造血幹細胞濃度調整為106-109個細胞/毫升，優選107-108個細胞/毫升。
在本發明的淨化方法中，對於造血幹細胞和腺病毒的混合體積沒有十分特別的限制。但是，從提高混勻的效率和腺病毒與腫瘤細胞結合的效率這一角度考慮，優選進行較小體積的混合，例如在MOI為100-1000時，使混合後的總體積為0.1-100毫升，優選的是混合後的總體積為0.5-10毫升。當混合後的總體積太小例如小於0.1毫升或太大例如超過100毫升時，都可能影響腺病毒和腫瘤細胞的結合效率。
本發明的另一目的在於提供一種用於自體造血幹細胞體外淨化的試劑盒。本發明的用於造血幹細胞體外淨化的試劑盒，包含含有增殖性溶瘤病毒的試劑和描述增殖性溶瘤病毒使用方法的說明書。所述的增殖性溶瘤病毒包括能選擇性在腫瘤細胞中增殖複製的單純皰疹病毒、腺病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和呼腸孤病毒。優選的增殖性溶瘤病毒是增殖性腺病毒，特別是能被腫瘤細胞表面的腺病毒受體識別的缺失了E1B基因的腺病毒。這樣的增殖性腺病毒包括缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒，例如CCTCC98003。
本發明的試劑盒優選還進一步包括用於洗滌造血幹細胞移植物的試劑。所述的洗滌試劑一般為能保持造血幹細胞活力的任何適當的細胞培養液如RPM1640或和細胞等滲的溶液如生理鹽水等。
本發明的試劑盒優選還進一步包括用於抗凝的試劑。該抗凝的試劑包括肝素、枸櫞酸鈉。
本發明的試劑盒還任選地包含混合容器如試管等和/或混合裝置如攪拌棒或震蕩器等。
本發明的另一目的在於提供一種用於治療腫瘤的方法，包括如下步驟1)從腫瘤患者獲取造血幹細胞移植物；2)將步驟1)獲得的造血幹細胞移植物和增殖性腺病毒接觸以除去移植物中的腫瘤細胞；3)將步驟2)獲得的造血幹細胞移植物回輸給腫瘤患者本人。
在本發明的治療腫瘤患者的方法中，優選在實施步驟1)之前對腫瘤患者進行大劑量的放、化療，以殺死患者體內大部分的腫瘤細胞。
在本發明的治療腫瘤患者的方法中，優選在實施步驟2)之前對造血幹細胞移植物進行離心和洗滌以除去其中的血清和血小板。而且，在將淨化後的造血幹細胞回輸給腫瘤患者之前，優選對其進行洗滌以除去未結合的腺病毒的步驟，所用的洗滌液可以是細胞培養液如RPM1640，也可以是生理鹽水等。
在上述步驟2)中，所述的腫瘤細胞包括血液系腫瘤細胞例如多發性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、惡性淋巴瘤等，還包括非血液系腫瘤細胞例如惡性淋巴瘤、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、小細胞肺癌、鼻咽癌、兒童纖維母細胞瘤、軟組織肉瘤等實體瘤細胞。所述的增殖性溶瘤病毒包括能選擇性在腫瘤細胞中增殖複製的單純皰疹病毒、腺病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和呼腸孤病毒。優選的增殖性溶瘤病毒是增殖性腺病毒，特別是能被腫瘤細胞表面的腺病毒受體識別的缺失了E1B基因的腺病毒。這樣的增殖性腺病毒包括缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒，例如CCTCC98003。
本發明人在體外實驗中，通過四氮唑蘭(MTT)法、腫瘤集落形成法、粒單核細胞集落形成法(CFU-GM)，證實了增殖性腺病毒CCTCC98003若以腫瘤細胞為轉染目標細胞，則至少在100-1000MOI範圍內，可完全清除造血幹細胞中混有的腫瘤細胞，而對造血幹細胞的增殖能力沒有影響。
在非肥胖型糖尿病-嚴重聯合免疫缺陷(NOD-SCID)鼠體內，通過組織連續病理切片、上皮細胞角蛋白(CK 19)的RT-PCR檢測，完成了對增殖性腺病毒CCTCC98003對腫瘤細胞淨化清除的評價；還通過對小鼠外周血和骨髓中人源性血細胞和造血幹細胞的流式細胞檢測，完成了CCTCC98003是否影響造血幹細胞造血重建能力的評價。結果顯示CCTCC98003在一定劑量、混合培養體積、混合培養時間條件下，可完全清除造血幹細胞中混有的腫瘤細胞，而對造血幹細胞的重建造血能力沒有影響。
除非另有說明，本說明書中所用的術語和縮略語具有本領域中所用的一般常規含義。
附圖簡述
圖1顯示的是攜帶螢光蛋白基因的複製缺陷型腺病毒(Ad-GFP)100MOI對不同類型細胞的螢光顯微鏡觀察結果。每種細胞均進行同視野可見光、螢光顯微鏡計數，求出螢光細胞比率即為腺病毒轉染率。具體見圖1中，圖AK、圖AY、圖BK、圖BY、圖CK、圖CY、圖DK、圖DY。結果可見在Ad-GFP 100MOI感染滴度，乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、多發性骨髓瘤細胞SKO-007均可獲完全轉染，而外周血造血幹細胞(PBSC)即使高達800MOI也未見轉染。
圖2顯示的是Ad-GFP 100MOI對不同類型細胞轉染的流式細胞檢測結果。流式細胞儀檢測發現，Ad-GFP在100MOI感染滴度時，對MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007分別為93.1％、95.1％、86.9％，而PBSC的轉染率即使高達800MOI轉染率也僅為1.75％。
圖3顯示的是96小時MTT法檢測CCTCC98003對不同類型細胞的殺傷效應。結果發現CCTCC9800396小時對MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007三種細胞的半數抑瘤藥物劑量(IC50)分別為25、46.6、2.1MOI病毒感染滴度，而對照藥物Ad-GFP對上述三種細胞沒有明顯殺傷效應。
圖4顯示的是14天集落形成法檢測CCTCC98003對不同類型細胞的殺傷效應。結果發現CCTCC98003對MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007三種細胞的半數抑瘤藥物劑量(IC50)分別為2.1、3.4、0.3MOI病毒感染滴度，其中100MOI病毒滴度均可獲得完全腫瘤生長抑制。而對照藥物Ad-GFP對上述三種細胞沒有明顯殺傷效應圖5顯示的是CCTCC98003對造血幹細胞CFU-GM形成影響。結果發現CCTCC98003在800MOI以下時，對造血幹細胞CFU-GM形成無明顯影響，與Ad-GFP結果一致。
圖6顯示的是CCTCC98003劑量依賴性實驗結果。在混合培養體積為1ml、混合培養時間2小時條件下，可見CCTCC98003在≥50MOI滴度，已經可以完全抑制MCF-7細胞生長。
圖7顯示的CCTCC98003體積依賴性實驗結果。在CCTCC98003感染滴度為100MOI、混合培養2小時情況下，0.5～10.0ml範圍均可完全抑制MCF-7細胞生長。對照為不加CCTCC98003，混合培養體積為0.5ml。
圖8顯示的是CCTCC98003時間依賴性實驗。在CCTCC98003感染滴度為100MOI、混合培養體積為0.5ml情況下，0.5～8小時範圍混合培養時間均可完全抑制MCF-7細胞生長。對照為不加CCTCC98003，混合培養時間為2小時。
圖9顯示的是CCTCC98003模擬淨化體外實驗。把105MCF-7細胞與107PBSC細胞混合，CCTCC98003以10、100、250、500MOI進行淨化，可見CCTCC98003對腫瘤細胞在≥100MOI感染滴度時，可完全抑制腫瘤細胞生長。對照藥物Ad-GFP對MCF-7無淨化效果。
圖10顯示的是CCTCC98003模擬淨化造血重建評價。通過造血幹細胞的CFU-GM形成實驗發現，CCTCC98003淨化MCF-7細胞的同時，對造血幹細胞的CFU-GM形成能力沒有影響。與對照藥物Ad-GFP結果一致。
圖11是顯示NOD-SCID鼠連續病理切片評價CCTCC98003(H101)體外淨化效果的照片。連續病理切片可見，RPM1640培養液空白對照組、Ad-GFP對照組小鼠肺內多髮乳腺癌瘤結節，而H101淨化組未見肺內瘤結節。
圖12顯示的是NOD-SCID鼠肺組織CK19RT-PCR檢測電泳結果的照片。可見在CCTCC98003淨化組380bp處未見CK 19的條帶，CK19為人源上皮腫瘤細胞的特異性基因標記，而RPM1640培養液空白對照組、Ad-GFP對照組均可見CK 19擴增條帶，Tubulin為內參對照。
圖13顯示的是CCTCC98003淨化對人源性造血幹細胞在NOD-SCID鼠體內重建造血的影響。圖13A為NOD-SCID鼠外周血人源性血細胞流式檢測結果，圖13B為NOD-SCID鼠骨髓人源性血細胞流式檢測結果，其中CD45+細胞為人源性白細胞標記，CD45+CD34+細胞為人源性造血幹細胞標記，CD45+CD19+細胞為人源性B淋巴細胞標記。結果顯示CCTCC98003對於人類造血幹細胞在NOD-SCID鼠體內造血重建沒有顯著影響。
為了更加清楚地描述本發明的內容，以下以實施例的方式對本發明作示例性的說明。這些實施例不構成對本發明的任何限制。
實施例I Ad-GFP對造血幹細胞、乳腺癌細胞、多發性骨髓瘤細胞轉染效率測定記數造血幹細胞PBSC、乳腺癌細胞MCF-7以及MDA-MB-231、多發性骨髓瘤細胞SKO-007細胞，以105個/皿接種於35mm皿中，每皿加入500μl無血清1640培養液(購自美國GIBCO公司)。以0、25MOI、50MOI、100MOI、200MOI、400MOI、800MOI滴度，加Ad-GFP於上述細胞培養皿中，37℃混勻晃動2小時，加入含20％胎牛血清的1640培養液500μl，置入37℃CO2孵箱，48小時後在螢光顯微鏡下記數Ad-GFP感染率，並經流式細胞儀檢測。結果可見，在螢光顯微鏡下，Ad-GFP 100MOI滴度，MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007可獲得100％轉染，而對於PBSC，即使Ad-GFP感染滴度高達800MOI，也未見細胞轉染。結果見圖1所示。同時流式細胞儀檢測發現MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的感染率分別為93.1％、95.1％、86.9％，而對於PBSC，即使Ad-GFP感染滴度高達800MOI，轉染率僅有1.75％。結果見圖2所示。
實施例II CCTCC98003對乳腺癌細胞、多發性骨髓瘤細胞殺傷效應評價以每孔8×103細胞，接種MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007細胞於96孔板中。每孔加入100μl無血清1640培養液，分別以0、25MOI、50MOI、100MOI、200MOI滴度轉染Ad-GFP、CCTCC98003，Ad-GFP作為對照。37℃培養箱晃動混勻培養2小時，加入含20％胎牛血清的1640培養液100μl，置入37℃CO2孵箱培養，96小時後進行MTT法檢測。MTT檢測按照常規方法，最後計算不同感染滴度細胞存活率。細胞存活率公式見下。繪製劑量-細胞存活率曲線，用最小二乘法進行曲線擬合，根據所得的公式求得抑制50％細胞存活的IC50。細胞存活率(％)＝(加藥細胞OD值-空白細胞OD值)/(對照細胞OD值-空白細胞OD值)×100％混合培養96小時後，CCTCC98003對MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的IC50分別為25、46.6、2.1MOI，對照Ad-GFP對MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的生長影響不明顯。結果見圖3；腫瘤集落形成法體外培養14天結果發現，CCTCC98003對MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的IC50分別為2.1、3.4、0.3MOI，對照Ad-GFP對MCF-7、MDA-MB-231生長影響不明顯。結果見圖4。
實施例III CCTCC98003對造血幹細胞CFU-GM形成能力的影響新鮮分離的PBSC細胞，以每孔2000個CD34+細胞接種於24孔板，加入200d1640，分別接受0、100MOI、200MOI、400MOI、600MOI、800MOI、1500MOI轉染CCTCC98003、Ad-GFP。37℃混勻晃動培養2小時，加入半固體CFU-GM培養液(購自美國STEM CELL公司)400μl，混勻後放入37℃CO2孵箱培養，14天後，當培養皿中出現肉眼可見集落時，終止培養，顯微鏡下記數CFU-GM集落數。按下面公式計算集落形成率。集落形成率＝集落數/接種細胞數×100％結果顯示在CCTCC98003小於800MOI時，對造血幹細胞CFU-GM形成能力沒有顯著影響。結果見圖5。
實施例IV CCTCC98003對乳腺癌MCF-7細胞體外淨化參數的確定(1)劑量依賴性研究。取對數生長期的MCF-7細胞，經胰酶消化記數，於60mm皿中接種1000個細胞。37℃CO2孵箱培養，24小時後，吸盡含血清1640培養液，PBS緩衝液洗兩遍，每皿加入200μl無血清1640培養液，分別以0、0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI、1MOI、10MOI、50MOI、100MOI、200MOI滴度轉染H101。37℃培養箱晃動混勻培養2小時，吸去培養液，加入含10％胎牛血清的1640培養液4ml，置入37℃CO2孵箱培養，7～14天後，當培養皿中出現肉眼可見集落時，終止培養，棄去培養液，用PBS緩衝液洗兩次，進行0.2％結晶紫染色15分鐘，清水緩慢衝洗染色液，室溫乾燥，顯微鏡下記數大於50個細胞的集落數。結果發現當CCTCC98003為10MOI時，對MCF-7細胞生長有顯著抑制，當劑量為≥50MOI時，可完全抑制MCF-7細胞的生長。結果見圖6。
(2)體積依賴性研究。應用腫瘤集落形成法進行評價。CCTCC98003以100MOI為病毒感染滴度，2小時為病毒混合培養時間，在不同病毒-細胞混合培養體積條件下，觀察腫瘤集落形成差異。混合培養體積選擇500、1000、2000、5000、10000μl 5個不同體積單位。CCTCC98003對MCF-7細胞的體積依賴性研究發現，在100MOI病毒感染滴度、2小時混合培養時間情況下，混合培養體積在500-10000μl範圍，可完全清除腫瘤細胞。結果見圖7。
(3)時間依賴性研究。應用腫瘤集落形成法進行評價。CCTCC98003以100MOI為病毒感染滴度，500μl為病毒混合轉染體積，在不同病毒-細胞混合培養時間條件下，觀察腫瘤集落形成的差異。混合培養時間選擇0.5、1、2、4、8小時，5個不同時間段。結果可見，在混合培養0.5小時CCTCC98003可顯著抑制MCF-7細胞生長，在混合培養時間≥1小時時，可完全清除造血幹細胞中混有的腫瘤細胞。結果見圖8。
實施例V CCTCC98003體外模擬淨化乳腺癌MCF-7細胞與造血幹細胞混合物把MCF-7細胞與PBSC細胞以1/100比例混合(1×104個MCF-7混入1×106個PBSC細胞)，以MCF-7細胞為轉染目標細胞，分別給予0、10MOI、100MOI、250MOI、500MOI滴度，轉染混合培養細胞。病毒-細胞混合培養體積為500μl，混合培養時間為2小時。最後同時把淨化處理後的混合細胞，分別進行腫瘤集落形成評價和造血幹細胞CFU-GM形成評價。腫瘤細胞集落評價在7～14天，CFU-GM評價在14～21天。結果可見，當MCF-7以1/100比例與PBSC混合時，CCTCC98003在感染滴度≥100MOI、混合培養體積0.5ml、混合培養時間為2小時，可獲得完全的瘤細胞淨化。結果見圖9。並且在上述條件下CCTCC98003對造血幹細胞的CFU-GM形成能力沒有影響。結果見圖10。
實施例VI CCTCC98003體外淨化乳腺癌MCF-7細胞的NOD-SCID鼠體內評價選擇6～8周齡、體重20-30克的NOD-SCID鼠共24隻，隨機分成三組，每組8隻，分別為1640培養液空白對照組、Ad-GFP對照組、CCTCC98003淨化組。把經造血幹細胞刺激因子動員後，從健康自願者體內採集的PBSC，與MCF-7細胞混合。混合情況為2×105個MCF-7細胞、2×106PBSC細胞，混合總體積為500μl。然後按體外實驗的淨化結果，應用CCTCC98003對上述混合物進行淨化處理。CCTCC98003淨化條件為感染滴度100MOI、混合體積500μl、培養時間為2小時。淨化後的500μl混合物，從小鼠尾靜脈注入。輸注淨化後的混合細胞前，常規對NOD-SCID鼠進行Co60全身照射，劑量為220cGY，以進一步抑制NOD-SCID鼠的免疫功能。45天處死小鼠，取靜脈血細胞、骨髓細胞，進行人CD45+、CD45+CD34+、CD45+CD19+流式細胞檢測，從而評價人造血幹細胞重建NOD-SCID鼠造血的能力。處死小鼠後取肺組織進行連續病理組織切片檢測，同時再進行CK19RT-PCR檢測，以評價CCTCC98003對乳腺癌細胞的淨化效果。結果發現，在1640培養液空白對照組、Ad-GFP對照組中，NOD-SCID鼠的肺組織連續病理切片顯示肺內多髮乳腺癌瘤結節，而CCTCC98003淨化組未見肺內瘤結節，結果見圖11。NOD-SCID鼠肺組織CK19RT-PCR檢測發現1640培養液空白對照組、Ad-GFP對照組均可見380bp大小的CK19擴增條帶，而CCTCC98003淨化組未見同樣大小的擴增條帶，顯示了CCTCC98003顯著的淨化效果。結果見圖12。
通過對NOD-SCID鼠靜脈血、骨髓中人類CD45+細胞、CD45+CD34+、CD45+CD19+細胞檢測發現，1640培養液空白對照組、Ad-GFP對照組、CCTCC98003淨化組三組間，人類CD45+細胞、CD45+CD34+、CD45+CD19+細胞水平無顯著差異，CCTCC98003對人類造血幹細胞在NOD-SCID鼠體內重建造血沒有明顯影響。結果見圖13A、13B。
權利要求
1.一種自體造血幹細胞體外淨化的方法，包括將含有腫瘤細胞的造血幹細胞與增殖性腺病毒接觸並使所述的增殖性腺病毒進入腫瘤細胞的步驟。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的增殖性腺病毒是缺失了ElB基因的5型增殖腺病毒。
3.權利要求1所述的方法，其中所述的腫瘤細胞選自惡性淋巴瘤細胞、乳腺癌細胞、睪丸癌細胞、卵巢癌細胞、小細胞肺癌細胞、鼻咽癌細胞、兒童纖維母細胞瘤細胞、軟組織肉瘤細胞、多發性骨髓瘤細胞、急性白血病和慢性白血病瘤細胞。
4.權利要求1所述的方法，其中將增殖性腺病毒與造血幹細胞移植物中混有的腫瘤細胞按照腺病毒/腫瘤細胞為10～10000的感染複數進行混合。
5.權利要求3所述的方法，其中感染複數為10～5000。
6.權利要求4所述的方法，其中感染複數為50～1000。
7.權利要求1所述的方法，其中將造血幹細胞移植物與增殖性腺病毒接觸30分鐘至8小時的時間。
8.權利要求7所述的方法，其中將造血幹細胞移植物與增殖性腺病毒接觸1-4小時。
9.權利要求8所述的方法，將造血幹細胞移植物與增殖性腺病毒接觸2-4小時。
10.權利要求1所述的方法，其中還包括在將造血幹細胞移植物和增殖性腺病毒接觸之前，對從患者體內採集的造血幹細胞移植物進行離心和洗滌的步驟。
11.權利要求10所述的方法，其中還包括在洗滌步驟之後，用生理鹽水或細胞培養液將造血幹細胞的濃度調整為106-109個細胞/毫升的步驟。
12.權利要求11所述的方法，其中造血幹細胞的濃度為107-108個細胞/毫升。
13.一種用於自體造血幹細胞體外淨化的試劑盒，其特徵在於包含含有增殖性腺病毒的試劑，描述增殖性腺病毒使用方法的說明書，以及任選的混合容器和混合裝置。
14.權利要求13所述的試劑盒，其中所述的腺病毒是缺失了ElB基因的5型增殖腺病毒。
15.權利要求14所述的試劑盒，還進一步包括用於洗滌造血幹細胞的試劑。
16.權利要求15所述的試劑盒，其中所述的洗滌試劑為細胞培養液。
17.權利要求16所述的試劑盒，其中還進一步包括用於抗凝的試劑。
18.權利要求17所述的試劑盒，其中所述的抗凝試劑為肝素或枸櫞酸鹽。
全文摘要
本發明提供了一種自體造血幹細胞體外淨化的方法，其特徵在於包括將含有腫瘤細胞的造血幹細胞與增殖性腺病毒接觸並使所述的增殖性腺病毒進入腫瘤細胞的步驟。本發明還提供了用於該自體造血幹細胞體外淨化的方法的試劑盒。
文檔編號C12N5/10GK1712522SQ20041004974
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月25日 優先權日2004年6月25日
發明者吳世凱, 林晨, 宋三泰 申請人:上海三維生物技術有限公司