拮抗疫苗中內毒素對畜禽的致熱性作用的組合物及其應用的製作方法

2023-05-26 01:46:36

專利名稱：：拮抗疫苗中內毒素對畜禽的致熱性作用的組合物及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種拮抗內毒素致熱性作用的組合物，尤其涉及一種拮抗革蘭氏陰性菌疫苗中內毒素對畜禽的致熱性作用的組合物，本發明屬於獸藥
技術領域：
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背景技術：
：內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上一種大分子有機化合物，主要成分為脂多糖，其結構具有高度的穩定性，16(TC需2-4小時才能滅活。革蘭氏陰性菌疫苗在生產過程中常出現因配製工藝或是抗生素對動物的不當應用引起菌體崩解，導致內毒素釋放，使注射動物出現一系列臨床反應，諸如腫頭，腫臉，停食停水，局部炎症，休克，死亡；生產性能降低；免疫功能下降，易發病，對疫苗應答下降等。多粘菌素B(PMB)是一種環形陽離子多肽，被認為是惟一具有抗內毒素作用的抗生素，多粘菌素B與LPS的活性中心LipidA具有很高的親和力，直接與LipidA的S042—結合，抑制LPS的生物活性，發揮對內毒素的中和作用。甘氨酸(Gly)是機體固有的最簡單的胺基酸，具有兩性游離的特點，通過其氨基與內毒素結合而改變了內毒素正常結構，也可抑制內毒素誘導的IL-1、TNF的分泌，降低內毒素與單核細胞的結合率。有研究報導甘氨酸(Gly)能顯著拮抗內毒素的致熱性等，能在一定程度上破壞內毒素的超微結構，從而幹擾其活性；而多粘菌素B(PMB)是有效的內毒素拮抗劑。但是，將多粘菌素B和甘氨酸聯合在一起對於革蘭氏陰性菌疫苗中的內毒素對畜禽的致熱性作用是否有協同增效的拮抗效果？其安全性如何？迄今為止，尚沒有任何文獻對此進行披露。
發明內容本發明的目的之一是提供一種能夠有效拮抗革蘭氏陰性菌疫苗中的內毒素對畜禽的致熱性作用的組合物；本發明的目的之二是將上述組合物應用於拮抗革蘭氏陰性菌疫苗中的內毒素對畜禽的致熱性作用；本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的—種能夠有效拮抗革蘭氏陰性菌疫苗中的內毒素對畜禽的致熱性作用的組合物，該組合物由多粘菌素B和甘氨酸組成；優選的，該組合物中，多粘菌素B的濃度為200i！g/ml，甘氨酸的濃度為200mg/ml。本發明通過試驗發現，多粘菌素B(PMB)和甘氨酸(Gly)分別作用於內毒素分子結構中的不同部位，二者聯合應用具有較強的內毒素結合和中和能力，能夠有效拮抗仔豬水腫病多價滅活疫苗的內毒素對於內毒素的拮抗作用，具有協同增效的拮抗效果；此外，兩種拮抗劑同時應用，還可因減少單一拮抗劑的用量而降低藥物的毒副作用。本發明的另一目的是將本發明組合物應用於拮抗疫苗中的內毒素對畜禽的致熱性作用，包括將本發明組合物加入到疫苗中，混合均勻；為了達到更好的拮抗效果，優選的，將本發明組合物加入到疫苗中至每毫升疫苗中含有多粘菌素B2-4iig和甘氨酸20-40mg;更優選的，將本發明組合物加入到疫苗中至每毫升疫苗中含有多粘菌素B2iig和甘氨酸20mg。本發明以小鼠為模型，觀察甘氨酸(Gly)與多粘菌素B(PMB)聯用於疫苗後小鼠的臨床表現和致死性影響，並確定PMB和Gly聯合拮抗疫苗內毒素上述的最佳配合比例，二者採用上述的最佳比例聯用時能夠最為顯著的協同拮抗疫苗中內毒素對畜禽的致熱性作用。本發明中所述的疫苗優選為含菌數不低於300X108CFU/ml的革蘭氏陰性菌疫苗，更優選為仔豬水腫病多價滅活疫苗。圖1PMB+Gly聯用對仔豬的安全性比對試驗結果。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。試驗例lPMB+Gly聯用對小鼠毒性的觀察試驗—、多粘菌素B與甘氨酸的配製滅菌生理鹽水配製儲存濃度為200g/ml的多粘菌素B和200mg/ml的甘氨酸，分別用0.22m的濾膜過濾，置於4"保存。分別向含有內毒素的疫苗中(該疫苗為革蘭氏陰性菌疫苗，疫苗含菌數不低於300X108CFU/ml)加入不同濃度的多粘菌素B與甘氨酸，其終濃度見表1。表1tableseeoriginaldocumentpage5二、PMB+Gly聯用對小鼠毒性的觀察選取16-18g小鼠85隻，隨機分成17組，5隻/組其中組1腹部皮下接種革蘭氏陰性菌疫苗，O.1ml/只；15組分別按表2中比例接種革蘭氏陰性菌疫苗+617、革蘭氏陰性菌疫苗+PMB、革蘭氏陰性菌疫苗+PMB+Gly，0.1ml/只；同時設立生理鹽水對照組，0.1ml/只。觀察7d，記錄注苗反應和臨床表現。表2PMB+Gly聯合應用效果實驗分組情況組另IJ序號PMB(ug/ml)GlyCmg/ml)疫苗1210疫苗+Gly32044051疫苗+PMB6274811091201014011210疫苗+PMB+Gly1222013240144101542016440生理鹽水對照17試驗結果顯示僅接種革蘭氏陰性菌疫苗的小鼠24h內出現眼部腫脹、部分小鼠全身肌肉震顫，在48內死亡率為3/5。接種含有PMB+革蘭氏陰性菌疫苗、Gly+革蘭氏陰性菌疫苗以及PMB+Gly+革蘭氏陰性菌疫苗的小鼠死亡率出現明顯下降；(PMB+Gly+疫苗)組無明顯的臨床反應，(疫苗+PMB+Gly)組對於內毒素的拮抗效果要顯著優於(疫苗+PMB)組和(疫苗+Gly)組對於內毒素的拮抗作用。試驗結果說明將PMB與Gly聯合應用對於革蘭氏陰性菌疫苗中的內毒素的拮抗作用有顯著的協同增效效果。當PMB濃度在2-4g/ml，Gly濃度在20-40mg/ml時，小鼠未見死亡，且無可見臨床反應，因此，選擇兩者最低值，即PMB與Gly終濃度分別為2g/ml及20mg/ml時，為最佳配合比例；當PMB濃度等於或高於4yg/ml，Gly濃度等於或高於40mg/ml時，個別小鼠出現顫抖的神經症狀。具體結果詳見表3。表3疫苗中聯合應用PMB+Gly對小鼠的作用效果6tableseeoriginaldocumentpage7提供。4、含有多粘菌素B與甘氨酸的仔豬水腫病多價滅活疫苗製備(1).—級菌種繁殖將凍幹菌種接種營養肉湯，3637C培養16-20小時後，用劃線接種於麥康凱瓊脂平板，置3637t:培養1620小時，在低倍鏡下，選取菌落5-10個混合接種於營養肉湯，然後分別接種於營養瓊脂斜面，置3637t:培養1620小時，用營養肉湯洗下加10%甘油，-20°〇保存，使用期不超過6個月或斜面培養物置2『C保存，不超過1個月，純粹檢驗合格，作為一級種子。在營養瓊脂培養基上每月繼代1次，不超過5代。(2).二級菌種繁殖取一級種子接種於營養肉湯，置3637t:震蕩培養1620小時，取樣作純粹檢查，應純粹，置28t:保存，使用期不超過3日。(3).菌液培養用玻瓶(或生物發酵罐)通氣培養，將二級菌種接種於營養肉湯，37t:培養1618h，經純粹檢查合格後作為制苗用菌液。(4).菌液濃縮與滅活取檢驗合格的豬大腸桿菌滅活菌液經4000rpm/min，離心30分鐘，棄去7/8上清液後，將菌體懸浮，活菌計數，將各菌株菌液按l:1:1比例混合後，以總量0.4%加入甲醛溶液，經37t:滅活48小時，其間每間隔24h攪拌1次，然後取滅活菌液接種營養瓊脂平板，每個樣品接種3個平板，每個平板接種0.2ml，置37t:培養48小時，檢查有無細菌生長。[OOSO](5)疫苗的製備在檢驗合格的滅活菌液中加入終濃度為的20%氫氧化鋁凝膠和0.005%的硫柳汞防腐，製備濃縮滅活疫苗含單株菌數均不低於100X108CFU/ml(按滅活前活菌數計算)。(6).多粘菌素B與甘氨酸的添加滅菌生理鹽水配製儲存濃度為200iig/ml的多粘菌素B和200mg/ml的甘氨酸，分別用0.22iim的濾膜過濾，置於fC保存。向仔豬水腫病多價滅活疫苗中加入多粘菌素B與甘氨酸，終濃度達到PMB2yg/ml禾PGly20mg/ml。二、PMB+Gly聯用對仔豬的安全性比對試驗選取14日齡健康仔豬15頭，隨機分成3組，5頭/組，測定每組仔豬的直腸體溫，並計算其平均值。然後分別接種仔豬水腫病多價滅活疫苗4ml、含有PMB(2yg/ml)和Gly(20mg/ml)的仔豬水腫病多價滅活疫苗4ml、以及生理鹽水4ml。分別於12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h測定各仔豬的直腸體溫，計算每組仔豬體溫的平均值，並觀察其臨床表現。試驗結果見表4和圖1。表4仔豬體溫平均變化情況仔豬體溫平均變化情況(°C)tableseeoriginaldocumentpage9試驗結果表明僅接種生理鹽水的仔豬體溫不高於39.0°C;只接種仔豬水腫病多價滅活疫苗組仔豬體溫逐漸升高，48h體溫升至最高40.rC，此後逐漸降低，至168h(7d)體溫仍較其它兩組高；接種仔豬水腫病多價滅活疫苗+PMB+Gly的仔豬體溫也逐漸升高，72h體溫升至最高39.4°C，7天後逐漸接近正常體溫，遠遠低於僅接種疫苗組，說明PMB+Gly可以協同拮抗疫苗內毒素引起的體溫升高。三、PMB+Gly聯用對仔豬的免疫原性比對試驗選取14日齡的健康易感仔豬15頭，隨機分成3組，5頭/組，其中一組頸部肌肉接種製備的仔豬水腫病多價滅活疫苗，2ml/只；另一組頸部肌肉接種製備的含有PMB(2iig/ml)禾PGly(20mg/ml)的仔豬水腫病多價滅活疫苗，2ml/只；另5頭設為對照組，接種等劑量的生理鹽水，2m1/只。至21天各耳靜脈注射一個致死量的混合毒素，觀察10天，記錄仔豬的發病和死亡情況。試驗結果見表5。表5對仔豬的免疫原性比較tableseeoriginaldocumentpage9試驗結果表明接種仔豬水腫病多價滅活疫苗+PMB+Gly組仔豬的攻毒保護率為4/5，與僅免疫仔豬水腫病多價滅活疫苗組的攻毒保護率相同，而對照組仔豬全部死亡，說明含有PMB+Gly不影響疫苗的免疫效力。權利要求一種能夠有效拮抗疫苗中的內毒素對畜禽的致熱性作用的組合物，該組合物由多粘菌素B和甘氨酸組成。2.按照權利要求1所述的組合物，其特徵在於該組合物中多粘菌素B的濃度為200iig/ml，甘氨酸的濃度為200mg/ml。3.按照權利要求1所述的組合物，其特徵在於所述的疫苗是革蘭氏陰性菌疫苗。4.按照權利要求3所述的組合物，其特徵在於所述的革蘭氏陰性菌疫苗是仔豬水腫病多價滅活疫苗。5.權利要求l-4任何一項所述的組合物在拮抗疫苗中的內毒素對畜禽的致熱性作用的應用，包括將所述組合物加入到疫苗中，混合均勻。6.按照權利要求5所述的應用，其特徵在於將所述組合物加入到疫苗中至每毫升疫苗中含有多粘菌素B2-4iig和甘氨酸20-40mg。7.按照權利要求6所述的應用，其特徵在於將所述組合物加入到疫苗中至每毫升疫苗中含有多粘菌素B2iig和甘氨酸20mg。8.按照權利要求5所述的應用，其特徵在於所述的疫苗是革蘭氏陰性菌疫苗。9.按照權利要求8所述的應用，其特徵在於所述的革蘭氏陰性菌疫苗是仔豬水腫病多價滅活疫苗。全文摘要本發明公開了一種拮抗疫苗中內毒素對畜禽的致熱性作用的組合物及其應用。該組合物由多粘菌素B和甘氨酸組成，其中，多粘菌素B的濃度為200μg/ml，甘氨酸的濃度為200mg/ml。本發明以小鼠為模型，觀察甘氨酸與多粘菌素B聯用於疫苗後小鼠的臨床表現和致死性影響，並確定了PMB和Gly聯合拮抗疫苗內毒素的最佳配合比例，即將該組合物加入到疫苗中至每毫升疫苗中含有多粘菌素B2-4μg和甘氨酸20-40mg時，具有良好的內毒素結合和中和能力，能夠有效拮抗疫苗中的內毒素，具有協同增效的拮抗效果；此外，兩種拮抗劑同時應用，還有效減少單一拮抗劑的用量，從而降低了藥物的毒副作用。文檔編號A61P29/00GK101732703SQ20101011388公開日2010年6月16日申請日期2010年2月25日優先權日2010年2月25日發明者丁國傑,付麗傑,吳金,姜力,曲海波,甘一迪,白同臣,馬世華申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司