分離和克隆有酪氨酸-磷酸酶活性的蛋白質的製作方法

2023-05-26 15:17:01

專利名稱：分離和克隆有酪氨酸-磷酸酶活性的蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及跨膜酪蛋白磷酸酶，其編碼DNA，生產和鑑定這些蛋白質的方法，以及篩選能夠結合和抑制或刺激磷酸酶酶促活性之化合物的方法。
蛋白質酪氨酸殘基的磷酸化狀態在細胞生長控制中起著重要作用。通過調整兩種相反作用的蛋白質-酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的相對活性來控制細胞磷酸酪氨酸水平。
幾種生長因子受體，以及胰島素受體都是酪氨酸特異性蛋白質激酶。
受體酪氨酸激酶的活化是通過與它們各自的生長因子或細胞激活素如FGF、EGF、PDGF、GM-CSF和IL-1的相互作用介導的，並通常誘導有絲分裂和生長(Yarden，Yand Ullrich，A，Annual Rev.Biochem.57443-478，1988)。發現許多致癌基因產物也可作為酪氨酸激酶並與已知的多肽生長因子受體分享廣泛的順序同源性，從而進一步支持酪氨酸磷酸化作用和細胞增殖之間關聯的觀點。這些觀察結果提示，蛋白質酪氨酸磷酸酶因其能夠選擇性地抵消酪氨酸激酶的作用，而可能在控制細胞生長和活化中起到重要作用。因此，已證明酪氨酸磷酸酶抑制劑能夠「可逆地轉化」細胞，並且已提出在惡性增殖過程中可能包括PTP酶(PTPase)活性的改變，而形成蛋白質酪氨酸磷酸酶可能作為腫瘤抑制物的概念(Klarlund，J.K.(1985)Cell41∶707-717)。
雖然關於酪氨酸激酶的許多工作已集中在生長調節作用上，但最近中樞神經系統的非增殖細胞中的發現證明了相對大量的酪氨酸激酶活性的存在。例如，胰島素的受體存在於腦的特定區域中，並在配體刺激後發生特異地自動磷酸化。目前已經證明，大鼠腦中胰島素受體的分布是與磷酸酪氨酸的分布密切相關的，此提示這種激酶具有體內活性並參予成年動物中樞神經系統的功能(Moss，A.M.，Unger，J.W.，Moxley，R.T.and Livingston，J.Proc.Natl.Acad.Sci.87∶4453-4457，1990)。
另一方面，最近已報導幾種酪氨酸磷酸酶在中樞神經系統中得以選擇性地表達，提示它們可能參予調節腦中的酪氨酸激酶活化作用。
如果這些酶參予控制酪氨酸磷酸化途徑，則它們的活性可能是酪氨酸激酶的活性應在對特異性細胞過程或配體相互作用的反應中受到調節。確定，迄今已分離出的某些磷酸酶顯示有假定的受體型結構，此提示它們的活性是受精細調節的級聯過程中的外在配體調節的。很顯然，酪氨酸磷酸化配體的分離可代表抑制不受控制的細胞生長(如在惡性增生情況下)的一個重要步驟。
基於它們的結構組織，可將蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)分為三類。Ⅰ類含有其中帶有單一催化區域的低分子量非受體分子，其中具有一個單一的催化區域並包括胎盤PTP酶1B(Charbonneau，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86∶5252-5256，1989;Chernoff，J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87∶2735-2789，1990)、T細胞TPT酶(Cool，D.E.et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.86∶5257-5261，1989)和大鼠腦PTP酶(Guan，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87∶1501-1505，1990)。Ⅱ和Ⅲ類PTP酶則是受體樣跨膜受體。雖然迄今已描述的Ⅱ類的單獨成員(HPTPβ和DPTP10D)具有單一的胞漿催化區(Kreuger，N.X.et al.∶EMBOJ.，9∶3241-3252，1990;Shin-Shay，T.et al.，∶Cell 67∶675-685，1991)，但Ⅲ類成員卻在分子的胞漿區域中具有兩個重複的假定催化區。Ⅲ類包括白細胞共同抗原(LCA)(Ralph，S.J.，EMBO J.，6∶1251-1257，1987;Charbonneau，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.85∶7182-7186，1988)、LCA相關蛋白質，LAR(Streuli，M.et al.，J.Exp.Med.，168∶1523-1530，1988)、LAR相關果蠅屬蛋白質DLAR和DPTP(Streuli，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86∶8698-8702，1989)和人(Krueger，N.X.，Streuli，M.and Saito，H.，EMBO J.9∶3241-3252，1990;Kaplan，R.et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.，87∶7000-7004，1990)及小鼠(Sap，J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87∶6112-6116，1990;Mathews，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87∶4444-4448，1990)蛋白質HPTPα、HPTPγ、HPTPδ、HPTPξ。
在不同的磷酸酶的催化區域之間和同一PTP酶內的重複的區域1和2之間有著顯著的胺基酸同源性和進化的保守性。具體地說，胺基酸順序VHCSXG(一字母代碼，X優先代表A或D)似乎是酶之活性位點的一個部分(Streuli，M.，Krueger，N.X.，Thai，T.，Tang，M.and Saito，H.，EMBOJ.，9∶2399-2407，1990)。
n個PTP酶具有由粘連蛋白型(FN)單獨重複順序(HPTPβ)或由免疫球蛋白區域和FN共同重複順序(LAR、DLAR和DPTP)組成的粘附分子樣細胞外區域，此提示它們可能將細胞-細胞識別與酪氨酸磷酸化作用相偶聯。確實已顯示細胞生長的密度依賴性抑制作用包括了受調節的酪氨酸磷酸酶活性升高，從而支持了這種活性可能在控制細胞生長、分化和腫瘤生成中起作用的概念。
從酪氨酸磷酸酶在細胞控制機制中的作用即作為在新發現的跨膜信號傳遞機制中作為潛在抗致癌基因劑和效應物來看，我們已對可能參予這些過程中的其他磷酸酶進行了研究。
因此，本發明提供了哺乳動物受體型蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)，其細胞外區域包括Arg-Gly-Asp順序及其功能衍生物。
這樣的PTP酶的例子是Ⅱ類PTP酶。Ⅱ類PTP酶可能是具有跨膜拓撲結構的新的PTP酶PTP35。已分離了兩種不同形式的PTP35，它們具有共同的結構特徵並且只是在其N末端順序上有所差異。重要的是，PTP35的細胞外區域與迄今描述的任何其他受體型磷酸酶無關，並且含有Arg-Gly-Asp(RGD)順序。PTP35的表達似乎在腦內特別有意義，提示它可能在控制中樞神經系統代謝和分化中具有重要作用。此外，當在培養成纖維細胞中研究PTP35時，它似乎參予了控制細胞增殖。還有，磷酸酶PTP35之mRNA的水平似乎可因在加有鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)或其他細胞分裂素的培養物中刺激3T3細胞而特異性地增加。
通過使用重組DNA方法，本發明已鑑定了新的受體型蛋白質酪氨酸磷酸酶。在DNA水平上並基於推測的蛋白質之胺基酸結構進行分析，表明此蛋白質缺少重複催化區，屬於Ⅱ類蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)，故代表了這一特殊類別之磷酸酶的新的例子。
本文描述的不同形式的PTP35分享共同的特徵。基於推測的胺基酸順序，可以識別出各種不同的功能性區域。基於疏水段(見

圖1a和1b)的存在，將PTP35分類為包含細胞外區域N末端至疏水段，和細胞內區域C末端至疏水段的跨膜蛋白質。迄今已分離的不同形式的PTP35中推測的蛋白質的細胞內部是完全相同的，其由表現出與先前描述的跨膜磷酸酶的細胞內催化區有顯著同源性的獨特區域組成。已有人提出，保守的胺基酸順序IIVHCSDGAGRTG(單字母代碼)是磷酸酶催化區的一部分，並且也存在於PTP35中(見圖1a和1b)。最大程序的同源性見於小鼠LRPA(Matthews，R.J.，Cahir，E.D.and Thomas，M，L.，Proc，Natl，Acad.Sci.，87∶4444-4448，1990;Sap。J.et al，Proc，Natl.Acad.Sci.，87∶6112-6116，1990)和小鼠CD45(Charbonneau，H.，Tonks，N.，Walsh，K.and Fischer，E.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85∶7182-7186，1988)酪氨酸磷酸酶中。
相反，如Swissprot資料庫顯示的，已知的細胞外區域順序則沒有顯著的同源性。也許細胞外區域的最令人感興趣的特徵是存在Arg-Gly-Asp(RGD)順序，該順序是參予細胞識別和粘附機制的許多蛋白質，包括粘連蛋白、胞外粘連蛋白(Vitrone-ctin)、血纖維蛋白原、Von Willebrand因子和蛋白質GPIIⅢa所共有的。上述各蛋白質的RGD順序是由負責細胞固著相關過程的，稱為整合蛋白(integrin)的結構上相關受體之家族中的至少1個成員識別的。PTP35是發現有RGD順序的第一個酪氨酸磷酸酶蛋白質，所說的順序可能具有重要的生物學作用。PTP35之細胞外區域的其他相關特徵包括存在2個潛在的N連接的糖基化位點。
因此本發明包括稱為PTP35的新的哺乳動物受體型蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)，其細胞外區域包括一個Arg-Gly-Asp順序，或其任何功能衍生物。就其細胞外區域來說，PTP35與其他已知的PTP酶間沒有明顯的同源性。圖1a和1b中顯示了兩種形式的PTP35的順序。
本發明的蛋白質可以是天然來源的，或者也可能是以化學或重組方法製備的。如果分子是天然來源的，可用標準蛋白質純化技術以含有PTP酶的細胞、組織或液體中製得基本上沒有其他與PTP酶存在天然聯繫之蛋白質的製劑。
純化技術中有代表性的例子是親和純化技術，其中使用能與PTP酶的酶促區域或各自受體區域結合的固相底物或配體。另外，亦可結合使用硫酸銨沉澱、分子篩層析及離子交換層析等幾種標準方法完成純化步驟。
可用生物化學方法從各種組織和細胞系中純化本發明的PTP酶。其中優選的材料是小鼠腦和NIH-3T3細胞系。
本發明包括含有與載體多肽融合之本發明PTP酶或其衍生物的融合蛋白質。
如前所述，按上述方法產生的蛋白質基本上沒有其他蛋白質。「基本上沒有其他蛋白質」是指該蛋白質中至少90%，甚至至少95%不含其他蛋白質。該蛋白質純度最好在98%或98%以上。所說的「其他蛋白質」包括在細胞中與PTP酶有天然聯繫的蛋白質及存在於重組宿主細胞內的蛋白質。
「功能衍生物」是指保留PTP酶之至少一部分功能如磷酸酶酶促活性或使細胞外區域結合配體之功能的PTP酶如PTP35的任何片段、變體、類似物或化學衍生物。功能性衍生物基本上是由細胞內或細胞外區域，或圖1中核苷酸279至2874編碼的胺基酸順序組成的。
「片段」是指分子的任何小部分，即較短的肽。
「變體」是指基本上相似於完整肽或其片段的分子。天然變體包括除小鼠以外的不同種哺乳動物(即已分離出PTP35的其他動物源)中的PTP35的同系物。可使用本領域已知的方法直接化學合成或在編碼PTP酶的DNA中插入適當的突變以得到PTP酶的合成變體如PTP35。例如，如此得到的變體包括殘基的缺失、插入或取代，以及延伸產物。
變體可至少50%，至少70%，至少90%，至少95%，或至少98%同源於PTP酶如PTP35或其片段。缺失、插入、延伸或取代可以是N末端、C末端或內部順序且包括1個或多個胺基酸，如1個、2個、3個、5個、10個、20個、30個或40個胺基酸。延伸可以是較長的並可構成載體蛋白質。取代通常是保守取代，其中各被取代胺基酸是由生物學上相似的胺基酸取代的。例如，各胺基酸可被有相似大小、疏水性、電荷和/或化學官能團的胺基酸取代。侯選取代是A取代G或反之;
V被A、L或G取代;
K被R取代;
S被T取代或反之;
E取代D或反之;以及Q被N取代或反之。
「類似物」是指基本上相似於完整分子或其片段的非天然分子。
PTP酶的「化學衍生物」如PTP35含有附加的不是肽之正常部分的化學部分。化學修飾的例子包括肽的共價修飾，用雙官能試劑衍生及C末端羧基基團的醯胺化。如此洗生的部分可改善PTP酶的物理-化學特性或生物學活性。
本發明的特別優選的實施方案是基本上具有如圖1a或1b中所示胺基酸順序的蛋白質。
本發明的另一個實施方案是基本上由編碼PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子。DNA順序可以是CDNA或基因組DNA形式的。適宜的順序是PTP35或其衍生物的順序。
可通過各種本領域中專家熟知的方法和Maniatis et al.，Molecular Cloning∶A Laboratory Manual Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbour NY(1989)中描述的方法生產本發明的重組DNA分子。
可用互補於PTP酶家族之保守區域的單鏈全簡併寡核苷酸探針來篩選由能夠表達PTP酶基因的細胞系衍生的DNA、cDNA或RNA製劑。優選的探針應是針對編碼本發明PTP酶之至少5個胺基酸殘基的核苷酸順序的。已按照這一技術或相似技術克隆了各種基因，例如人醛脫氫酶(Hm，L.C.，et al.，Proc。Natl.Acad.Sci.USA 823771-3775，1985)，纖維粘連蛋白(fibronectin)(Suzuki，S.et al.，EMBO J.4∶2519-2524，1985)、組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑(Pennico，D.et al.，Nature 301∶214-221，1983)。
在使用選擇性擴增技術後，即使是很小量的得自某個體的DNA也能用這些方法進行克隆。長時間以來便已了解了能夠擴增純化之核酸片段的重組DNA方法學。
這些方法學一般包括將核酸片段引入DNA或RNA載體中，克隆擴增該載體，並回收已擴增的核酸片段。這些方法學的例子可參見Cohen等人的美國專利No.4，237，224和Maniatis等人的上述文獻(已列為本文參考文獻)。
最近已描述了能夠增加上述所需核酸分子之濃度的體外酶學方法。該方法被稱為「聚合酶鏈反應」或「PCR」(Mullis，K.et al，Cold Spring Harbor Symp，Ouant.Biol.51∶263-273，1986;Erlich，H.et al，歐州專利EP50，424;EP84，796，EP258，017，EP237，362;Mullis，K.，EP201，184;Mullis，K.et al.，美國專利US4，683，202;Erlich，H.美國專利US4，582，788和Saiki，R.et al，US4，683，194)。
聚合酶鏈反應提供了即使以前特定核酸順序未被純化並且只以單一拷貝存在於特定樣品中時亦可選擇性地增加該順序之濃度的方法。該方法可用於擴增單股或雙股DNA。該方法實質包括使用兩個寡核苷酸探針作為引物，以對所需核酸分子進行模板依賴性聚合酶介導的複製。
在另一實施方案中，本發明提供了基本上由編碼如上限定之PTP35的功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子。DNA分子可編碼本發明PTP酶的變體。這樣的DNA分子是可至少40%，至少60%，至少80%，至少90%，至少95%或至少98%同源於圖1中所示順序的分子或其片段。DNA分子可編碼具有上述缺失、插入、延伸或取代的本發明的PTP酶。
可用針對編碼多肽分子之DNA中核苷酸的位點針對性誘變方法(如參見Adelman et al.，DNA2∶183，1983)製備這樣的DNA分子，從而產生編碼衍生物的DNA，然後在重組細胞培養物中表達該DNA。
為了表達本發明的天然PTP酶或其功能衍生物，必須在適當的表達載體中克隆編碼不同順序的各DNA。表達載體是由於其中存在轉錄和轉譯控制順序而能夠表達已克隆到其中的DNA分子並因而能產生多肽的載體。載體可以是質粒或病毒載體。
將表達載體引入適當宿主細胞後即可表達已克隆的順序。如果使用原核表達載體，則適宜的宿主細胞應是任何能表達已克隆之順序的原核細胞，如大腸桿菌細胞。同樣，如果使用真核表達載體，則適宜的宿主細胞應是任何能表達已克隆之順序的真核細胞。可使用酵母宿主如釀酒酵母細胞。另外，可使用昆蟲細胞，在這種情況下，杆狀病毒表達系統是適用的。另一個可選用的宿主是哺乳動物細胞系，如中國倉鼠卵細胞。
可按常規技術使編碼本發明PTP酶或其功能衍生物的DNA順序與載體DNA重組，包括造成適於連接的平頭末端或交錯終止的末端、進行限制性酶消化以提供適當的末端、必要時充填粘性末端、用鹼性磷酸酶處理以避免不期望的連接，並用適當的連接酶進行連接。可用Maniatis等人(文獻同上)公開的或本領域已知的技術進行這些操作。
如上所述，適當的表達載體含有能指導和控制基因在適當宿主中表達的轉錄和轉譯調節信息。這些順序被可操作地連接到待表達的基因上，並包括啟動子(指導RNA轉錄開始)、Shine-Dalgarno順序、加帽順序、CAAT順序等(均參予轉錄和轉譯的起始過程)。
本發明的啟動子順序可以是原核、真核或病毒的。適當的原核順序的例子包括λ噬菌體的PR和PL啟動子(The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1973;Lambcda Ⅱ，Hendrix，R.W。，Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1980)、大腸桿菌的trp、recA、熱休克和1acZ啟動子以及SV40早期啟動子(Benoist，C。et al。，Nature 290∶304-310，1981)。
就Shine-Dalgarno順序來說，優選的適用調節順序的例子是以噬菌體MS-2之複製酶基因和噬菌體λ之基因cⅡ的Shine-Dalgarno為代表的。Shine-Dalgarno順序可直接接在編碼PTP35的DNA之後並導致成熟PTP35蛋白質的表達。
另外，編碼PTP35或其遺傳變體的DNA可以以編碼載體肽順序的DNA順序為先導。在這種情況下，可產生其中PTP35的N末端與載體肽相融合的融合蛋白質，所說的載體肽可幫助提高蛋白質表達水平和細胞內穩定性，並提供簡單的純化手段。優選的載體肽包括葡萄球菌蛋白A的一個或多個IgG結合區。包含蛋白A之IgG結合區的融合蛋白質很容易用親和層析法(如在IgG偶聯的Sepharose上)純化成均質物。編碼原核生物酶如腸激酶、因子X或溶膠原酶(Procollagenase)之識別位點的DNA順序可直接接在編碼PTP35或其變體之DNA順序的前面，以允許裂解融合蛋白質而得到成熟的PTP35蛋白質。
另外，適用的表達載體還包含適當的允許篩選被轉化之宿主細胞的標誌。這樣的標誌一般是抗生素抗性基因，其可賦予被轉化宿主以在含有基因賦予抗性之抗生素的選擇性培養基上生長的能力。
使用Maniatis等人(文獻同上)所述的本領域專家熟知的技術來轉化所選擇的宿主。
因此本發明的再一個實施方案是涉及含有編碼本發明PTP酶或其功能衍生物之DNA順序的適當表達載體。編碼PTP35或其變體的DNA順序可以以編碼載體肽的順序為先導，以得到融合蛋白質。
本發明的再一個實施方案是涉及用所說的表達載體轉化的，並能在適當的培養條件下產生本發明之PTP酶或其功能衍生物的原核或真核宿主細胞。
本發明還涉及製備本發明PTP酶蛋白質或其功能衍生物的方法，包括(ⅰ)提供處於使PTP酶或其功能衍生物得以表達之條件下的適當的宿主，和(ⅱ)純化如此得到的PTP酶或其功能衍生物。
按下述方法適當地製備宿主(a)分離基本上由編碼PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子;
(b)將所說的DNA分子插入適當的表達載體中;和(c)用所說的表達載體轉化適當的宿主。
本發明的PTP酶和其功能衍生物可用於試驗能提高或抑制磷酸酶活性的化合物的方法中。本發明還可用於診斷涉及本發明PTP酶的疾病。
可在體外系統中試驗某被試化合物修飾磷酸酶活性的能力，其中將試驗化合物加到純化的PTP酶蛋白質或其酶促活性衍生物中，使用本領域技術人員已知的標準酶學方法檢測對酶活性的影響。
另外，可使用活的或固定的細胞，或者使用得自活的或固定的細胞的膜部分，在全細胞製劑中檢測化合物對PTP酶活性的作用。該方法可用於篩選通過蛋白質的細胞外受體部分起作用的化合物，以及直接作用於蛋白質之酶促部分的化合物。將試驗化合物與大量表達本發明PTP酶的細胞如NIH-3T3細胞，或與由之得到的膜製劑一起保溫。
然後使用本領域已知的方法(Honegger，A.M.et al.，Cell 50∶199-209，1987;Margolis，B.et al.，Cell 57∶1101-1107，1989)檢測細胞磷酸酪氨酸的量。將結果與在沒有試驗化合物，或有或沒有已知的R-PTP酶活化劑條件下獲得的結果相比較。在這些研究中，也可在酪氨酸激酶活化劑存在下檢測試驗化合物的作用。
刺激PTP酶活性的化合物將會淨減少磷酸酪氨酸的量，而抑制PTP酶活性的化合物則導致磷酸酪氨酸量的淨增加。
就作為酪氨酸激酶的生長因子受體如表皮生長因子(EGF)和血小板衍生的生長因子(PDGF)的受體來說，酪氨酸磷酸化作用是與細胞生長和致癌基因轉化相聯繫的。活化PTP酶以導致其去磷酸化，將作為反向調節機制以阻止或抑制細胞生長，並可作為內源性調節機制對抗腫瘤。因此，該受體/酶系統的突變或失調可增進對腫瘤的易感性。
胰島素受體也是一種酪氨酸激酶，並且酪氨酸在攜帶胰島素受體之細胞內的磷酸化作用是與正常生理功能聯繫在一起的。與細胞生長和腫瘤生長的情況相反，活化PTP酶將抵消胰島素的作用。亞正常PTP酶水平或酶促活性可消除正常的反向調節機制。
雖然如此，但也許更為重要的是，可預料如果PTP酶活性過高或受到不適當的活化，則將會抑制或完全阻止胰島素對細胞的作用，而導致糖尿病(或胰島素抗性改變)。
因此，對糖尿病的易感性可能與PTP酶失調有關聯。另外，將胰島細胞中表達的酪氨酸磷酸酶識別為自家抗原，可作為由自家免疫機制引起之細胞破壞的後果，導致糖尿病。在這種情況下，可使用這些磷酸酶的重組細胞外區域阻斷自家抗體與胰島細胞表面上表達之磷酸酶的結合，從而提供直接的治療效果。
因此，本發明的檢測與細胞或組織相關聯之PTP酶活性量的方法，可以作為鑑定機體對於與細胞磷酸酪氨酸代謝改變相關聯之腫瘤、糖尿病、或其他疾病的易感性的方法。從在腦中特別是在分化中樞神經系統細胞中特異性表達PTP35的角度來看，PTP35活性的調節作用可能在神經元細胞分化和存活中是很重要的。因為已報導腦中的胰島素受體分布與酪氨酸殘基磷酸化的蛋白質的定位相對應，所以在腦中特異性表達的酪氨酸磷酸酶如PTP35的作用，可能在調節該組織內胰島素受體酪氨酸激酶中有著重要意義。
基於上述考慮，本發明一個實施方案是關於鑑定能夠刺激或抑制本發明蛋白質之酶促活性之化合物的方法，其包括(a)化合物與純形式的，或膜製劑形式的，或呈活的或固定化全細胞形式的蛋白質接觸;
(b)將步驟(a)中的混合物保溫足夠時間;
(c)檢測蛋白質的酶促活性;
(d)將此酶促活性與在不加化合物保溫時測得的蛋白質的酶促活性相比較，從而確定化合物是否可刺激或抑制該活性。
本發明包括能夠與本發明的PTP酶或其衍生物結合的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。該抗體可用於診斷涉及本發明PTP酶的疾病。
生產單克隆和多克隆抗體的方法是已知的。生產多克隆抗體的方法包括用本發明的PTP酶或其衍生物免疫適當的宿主動物如實驗動物，並從免疫血清中分離免疫球蛋白。因此，可用PTP酶或衍生物接種動物，然後從動物體內採血並純化IgG部分。生產單克隆抗體的方法包括使產生所需抗體的細胞永久存活。可使被接種之實驗動物的脾細胞與腫瘤細胞融合以產生雜交瘤細胞(Kohler andMilstein，Nature 256∶495-497，1975)。
可用常規方法選擇能產生所需抗體的永久存活的細胞。可使雜交瘤生長於培養物中或經腹腔注射到宿主體內以形成腹水或注入同種異型宿主或免疫感受宿主的血流中。可在體外免疫人淋巴細胞，然後用Epstein-Barr病毒轉化淋巴細胞以製備人抗體。
為生產單克隆和多克隆抗體，所用實驗動物可以是羊、兔、大鼠或小鼠。如必要時，可將本發明的PTP酶或其衍生物作為結合物給藥，其中將PTP酶或衍生物例如通過其胺基酸殘基之一的側鏈偶聯到適當的載體多肽上。載體分子一般是生理學上可接受的載體。可分離並根據需要純化所得到的抗體。
本發明包括檢測試驗樣品中本發明PTP酶或衍生物的方法，該方法包括使試驗樣品與本發明的抗體接觸，並檢測與PTP酶或其衍生物結合之抗體的量。該方法可用於診斷與本發明的PTP酶有關的疾病。
可使用ELISA(酶聯免疫檢測法)方法，如非競爭性ELISA進行檢測。一般說來，ELISA方法包括下述步驟(ⅰ)將根據本發明的未標記的抗體固定於固相載體上，(ⅱ)加入含有待檢PTP酶或其衍生物的試驗樣品，以使PTP酶或其衍生物被未標記的抗體俘獲，(ⅲ)加入已標記的根據本發明的抗體，和(ⅳ)檢測已結合的被標記抗體的量。
適當的抗體標記物的例子包括生物素(其可用與過氧化物酶結合的抗生物素蛋白檢測)和鹼性磷酸酶。
可用Western吸印法檢測本發明的PTP酶或衍生物。此方法可包括下列步驟(ⅰ)對含有PTP酶或其衍生物的試驗樣品進行凝膠電泳分離，(ⅱ)以吸印法將在凝膠中分離的RNA分子轉移到固相載體(如硝化纖維素載體)上，和(ⅲ)使已被標記的根據本發明的抗體與PTP酶或其衍生物結合。
本發明包括檢測試驗樣品中編碼本發明之PTP酶或其衍生物的mRNA的方法，該方法包括使存在於試驗樣品中的mRNA與基本上由圖1中所示順序組成的DNA探針雜交，並檢測所得DNA∶mRNA雜交體的量。
亦可用Northern吸印法檢測mRNA，該方法包括下列步驟(ⅰ)對含有編碼本發明PTP酶或其衍生物之mRNA的試驗樣品進行凝膠電泳分離，(ⅱ)將在凝膠中分離的RNA分子吸印轉移到固相載體(如硝化纖維素載體)上，(ⅲ)使DNA探針與mRNA雜交，和(ⅳ)檢測已雜交之DNA探針的量。
在了解了本發明的總的特徵後，可通過參考下列實施例更容易地理解本發明。下述實施例只是舉例說明而不是限制本發明。
圖1PTP35的順序。其中顯示了cDNA克隆PTP35，11(圖1a)和PTPT35，12(圖1b)的順序，連同主要開放讀碼的翻譯。DNA順序方框內是假定的ATG(克隆11)和CTG(克隆12)起始密碼子，以及TGA終止密碼子。蛋白質順序RGD特徵，方框內是假定的跨膜肽和酪氨酸磷酸酶相符主順序。
圖2，A框對不同小鼠組織中PTP35的Northern印跡分析。使用質粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探針，對20μg小鼠組織的總RNA進行Northern印跡分析。泳道1，肝;泳道2，脾;泳道3，心;泳道4，腦。標出了28S和18S核糖體RNA的位置。示出RNA轉移印跡前凝膠的照片，證明各泳道有相等的上樣量。B框在大鼠腦中表達PTP35。使用質粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探針，對10μg從培養2天(泳道1)和8天(泳道2)的大鼠小腦顆粒神經元(cerebellum granules neurons)得到總RNA進行Northern印跡分析。標出了28S和18S核糖體RNA的位置。經使同一濾膜再次與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)探針雜交，證實各泳道有相等的上樣品。
圖3，A框Swiss NIH 3T3細胞的生長曲線。在添加10%FCS的DMEM培養基中以103細胞/Cm2的密度接種3T3細胞並培養之。每天用胰酶消化細胞單層並計數。B框細胞生長期間PTP35 mRNA水平的時間過程。使用質粒PTZ-PTP35中的SalI-EcoRI片段作探針，以Northern印跡雜交法分析20μg從每天收穫的細胞中製得的總RNA。標出了28S和18S核糖體RNA的位置。經再次與肌動蛋白探針雜交進一步證實所有泳道均有同樣的上樣量。
圖4，A框bFGF對3T3細胞中PTP35mRNA之誘導作用的動力學。不用或用30ng/mlbFGF(+)處理細胞，在用bFGF處理後不同時間從細胞中製備總RNA並進行Northern印跡雜交分析。在加入bFGF後24小時最大程度地誘導了PTP35mRNA。經再次與肌動蛋白探針雜交，進一步證實所有泳道均有相同的上樣量。示出了28S和18S核糖體RNA的位置。B框PTP35 mRNA誘導的特異性。處理後24小時對總RNA進行Northern印跡分析。泳道1，對照;泳道2，加30ng/mlbFGF;泳道3，加30ng/ml bFGF和10μg/ml放線菌酮;泳道4，加10μg/ml放線菌酮;泳道5，加10ng/ml PDGF;泳道6，加10ng/ml PDGF和10μg/ml放線菌酮。經再次與肌動蛋白探針雜交，進一步證明所有泳道有相等的上樣量。
圖5，PTP35細胞外區域的表達。顯示用pRI T33(泳道1)和pRIT33-PTP35XC轉化的(泳道2)或未轉化的(泳道3)HB101細胞之總細胞提取物的10%SDS-PAGE分析結果。標出了相當於蛋白A(約33KDa)和蛋白A-PTP35XC(約75KDa)之帶的位置。
圖6，PTP35細胞內區域的表達。顯示PTP35細胞內區域之表達和純化的10%SDS-PAGE。將超聲處理後的可溶性細胞提取物與穀胱甘肽瓊脂糖樹脂一起保溫，徹底清洗後與凝血酶一起保溫。在從樹脂上釋放後，收集培養基中的基本上純的可溶性PTP35細胞內區域。泳道1，分子量標誌物;泳道2，可溶性細胞提取物，泳道3，洗滌培養基;泳道4，加入凝血酶後的等分樹脂樣品;泳道5，純的可溶性PTP35細胞內區域。箭頭指示GST-PTP35融合體(泳道2)或成熟的PTP35細胞內區域(泳道5)。
實施例1分離和分析小鼠PTP35cDNA克隆聚合酶鏈反應擴增並鑑定PTP35克隆按常規方法(Maniatis，T.，Frisch，E.F.and Sambrook，J.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989)從活躍生長的Swiss3T3成纖維細胞(ATCCCCL92)中製備總RNA。使用AMV逆轉錄酶(Boehringer Mannheim)以10μg總RNA合成第一股cDNA，並使用2個編碼保守磷酸酶順序的簡併的引物，以聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增之。包含SalI限制性位點的有意義引物1(5′AAG CTT CTG CAG GTC GAC TTT/CTGG GAA/G ATG GT/A/C/T/G TGG CA 3′)之後是編碼保守的胺基酸FWEMVWE的簡併序列。包含互補於保守之胺基酸VHCSAGA的互補引物4(5′CGA ATT CGG TAC CGG ATC CTG CCC CGG CAC TGC AGT GCA C 3′)之後是EcoRI限制性位點。使用Taq聚合酶(Perkin-Elmer)，以兩個引物擴增來自生長之3T3細胞的第一股cDNA鏈。退火溫度為55℃，且聚合反應於72℃下進行。使用Perkin-Elmer熱循環器進行40次擴增反應。
用SalI/EcoRI切割有預定的約360bp大小的擴增片段，並再克隆利用同樣酶切割的質粒PTZ19R(購自Pharmacia;參見Protein Engineering 1∶67，1986和Proc.Natl.Acad.Sci.854832，1988)中。使用序列酶(Sequenase)(United States Biochemicals)直接對雙股DNA分析不同重組質粒的序列。按標準序列製備質粒PTZ-PTP35的DNA並用SalI和EloRI酶切割之。用已描述的凝膠電泳和電洗脫法(Maniatis，T.，Frisch，E.F.and Sambrook，J.Molecular Cloning.A laboratory manual.Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，1989)純化相當於磷酸酶DNA插入段的360bp片段。
文庫篩選為了得到PTP35的完整DNA順序，在5×SSC、5×Denhardts、0.1%SDS、250mg/ml鮭精子DNA中於65℃雜交過夜，以高嚴緊度篩選NIHSwiss 3T3成纖維細胞cDNAλZapⅡ文庫(Stratagene，LaJolla，USA)。用已按隨機引導方法進行32P標記的得自質粒pTZ-PTP35的360bp SalI/EcoRI片段作為探針(2×106cpm/ml)。於65℃在1×SSC、0.1%SDS中洗滌。從2×105個克隆中選出7個陽性克隆並進一步分析其特性。按製造商(Stratagene，La Jolla，USA)所述方法，從選擇的克隆上切掉重組pBluescript SK-質粒的DNA並進行EcoRI消化，以證實其中的插入段的存在和大小。使用二脫氧核苷酸鏈終止法(Sequenase，United States Biochemical;Proc.Natl.Acad.Sci.74∶5463-5476，1977)和通用的正向和反向引物直接測定不同克隆之雙股DNA的順序。根據限制性酶切圖及順序交迭分析結果，確定重組質粒中EcoRI片段的相對次序及定向。使用內部順序分析引物以兩個方向測定所有區域的順序。發現所有已定出順序的克隆均含有同樣順序的部分。還進一步證實了用PCR所獲得之片段的順序。圖1a和1b中示出了兩個最長的克隆PTP35，11和PTP35，12的順序。
分析克隆PTP35，11的順序使用Geneworks程序(Intelligenetics，CA)進行核苷酸順序分析。轉譯cDNA克隆PTP35，11中所含有的順序後，發現存在有推測在核苷酸505處轉譯起始的編碼790個胺基酸的主要開放讀碼(在核苷酸124處，381核苷酸上遊存在有碼內終止密碼子)。基於在胺基酸388和408之間存在有疏水段，而將此蛋白質分類為跨膜蛋白質。推測的蛋白質細胞內部分由表現與先前描述的跨膜磷酸酶的細胞內催化區有顯著同源性的獨特區域組成。已提示作為磷酸酶催化位點之一部分的保守序列VHCSDG存在於PTP35中。因為沒有催化區的重複出現，所以蛋白質PTP35屬於Ⅱ類酪氨酸磷酸酶。
分析克隆PTP35，12的順序使用Geneworks程序(Intelligenetics，CA)分析克隆PTP35，12的順序。發現該順序相當於PTP35之克隆11從核苷酸279至末端的順序，但可能由於可替代的拼接而使兩順序在其5′末端有所不同。
轉譯包含於cDNA克隆PTP35，12中的順序後，發現存在一個編碼961個胺基酸的主要開放讀碼，推測轉譯起始於核苷酸157處的CTG密碼子(在核苷酸99處，58核苷酸上遊存在一個碼內終止密碼子)。基於在胺基酸559和579之間存在有疏水段，而將此蛋白質分類為跨膜蛋白質。推測的細胞外區域編碼558個胺基酸並包含作為真核細胞分泌信號順序的短的17胺基酸疏水順序，且後者可由計算機識別出來。其後將在胺基酸18處開始克隆PTP35，12中編碼的成熟PTP35分子。相當於克隆PTP35，11中編碼之分子的推測的細胞內部分由表現出與先前描述的跨膜磷酸酶之細胞內催化區有顯著同源性的獨特區域組成。胺基酸886至899間的順序IIVHCSDGAGRTG與PTP酶活性的同感順序相匹配。
實施例Ⅱ分析PTP35 mRNA的表達組織中的PTP35 mRNA分布每泳道使用20μgRNA，按照標準程序(Maniatis，T.et al.，文獻同上)對得自小鼠脾、心、腦和肝細胞的總RNA(購自Clonetech，CA)進行Northern印跡分析。使用文庫篩選中所用的SalI/EcoRI片段作探針(2×106cpm/ml)在50%甲醯胺、5×SSC、1×Denhardt′s，0.1%SDS和250mg/ml鮭精子DNA中於42℃雜交過夜。42℃下，在1×SSC、0.1%SDS中洗滌。高嚴緊度洗滌並沒有顯著地影響雜交結果。
Northern分析(圖2，A框)揭示了小鼠組織內，特別是腦組織內PTP35表達的高特異性特徵。在該組織中，除了以高水平表達約3200bp的mRNA外，還以較低水平表達約1400bp的較小的第二種mRNA。
分析PTP35mRNA調節作用基於PTP35在小鼠腦內的特異性表達，研究大鼠小腦顆粒神經元中PTP35mRNA的表達。按已述方法(A.Frandsenand A.SchousboeInt.J.of Dev.Neurosci，8(2)209-216，1990)從大鼠腦組織中分離初級細胞。在35mm平皿中以3×106個細胞/平皿接種細胞並培養8天。在第2天(分化差)和第8天(分化狀態好)收穫細胞，分離總RNA並按上述方法(Maniatis，T.et al.，文獻同上)進行Northern印跡雜交。使用通常的雜交和洗滌條件(參見上文)。用SalI/EcoRI PTP35片段作為探針(2×106cpm/ml)。如圖2B所示，大鼠小腦顆粒神經元可以高水平表達如小鼠腦組織中表達的同樣大小(約3200bp)的PTP35mRNA。在分化狀態良好、長出伸展的軸突並且在細胞與細胞有相互連接的細胞中表達水平較高，此提示PTP35與大鼠小腦顆粒神經元分化和存活有關。分析了生長的NIH3T3細胞中對PTP35mRNA表達的調節作用。在添加10%胎牛血清(FCS)(Gibco)的DMEM培養基(Gibco)中以低密度(103個細胞/cm2)接種NIH3T3細胞並培養7天。每隔一天換一次培養基。每天從兩個平皿中胰酶處理後收穫細胞樣品並計數。圖3，A框顯示了3T3細胞的生長曲線。同時每天收穫細胞並製備總RNA，然後按已述方法(Maniatis，T.et al.，文獻同上)使用每泳道20μgRNA進行Northern印跡分析。使用SalI/EcoRI PTP35片段作探針(2×106cpm/ml)，在標準條件(見上文所述)下進行雜交。圖3，B框內顯示了Northern印跡雜交的結果。其中可看到在小鼠和大鼠腦中觀察到的同樣大小(約3200bp)有優勢信號的mRNA。
分析從不同培養天數之細胞製得的mRNA的穩定態水平，表明PTP35mRNA表達與細胞生長有著直接的關聯。在生長活躍的細胞中觀察到最大mRNA水平，而在合會的、靜止期3T3細胞上則可見表達水平降低以至很少或不表達，這表明PTP35參予對細胞生長的調節。
檢查鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)刺激對NIH3T3細胞中PTP35mRNA水平的影響。將細胞以半會合濃度(3×104個細胞/cm2)接種在DMEM+10%FCS中，並在DMEM培養基+0.4%FCS中保溫24小時。然後加入30ng/mlbFGF並定時收穫經如此處理的細胞和未處理的對照組細胞。製備總RNA並按已述方法(Maniatis，T.et al.，文獻同上)使用PTP35 SalI/EcoRI片段作探針進行Northern印跡分析。雜交條件同樣是一般常用的。如圖4所示，bFGF刺激後PTP35mRNA穩定態水平提高，並在24小時後達到峰值。當於10μg/ml放線菌酮存在下進行bFGF刺激時，這一作用沒有受到抑制。在用血小板衍生的生長因子(PDGF)和血清刺激後，也觀察到同樣的作用。
實施Ⅲ在原核細胞中表達PTP35載體pRIT33(可得自Pharmacia;參見Methods in Enzy mology 185∶144-161，1990)是質粒pRIT2的衍生物，並且是為了在誘導λPr啟動子後在大腸桿菌中溫度可誘導性表達細胞內雜交蛋白質而設計的。另外，可用1mMIPTG誘導已插入到λPr啟動子上遊lacUV5啟動子而獲得表達。該構建體含有處於λPr啟動子控制下的葡萄球菌蛋白A的IgG結合區。多克隆位點有利於在蛋白A的3′側插入外來基因。在蛋白A編碼順序的末端存在有編碼因子X之識別位點的順序。蛋白A轉錄終止順序被插入到緊接多克隆位點的下遊處。為了得到蛋白A-PTP35融合體蛋白質，將編碼PTP35蛋白質的順序插入到質粒pRIT33中。從質粒PTP35，4(其為篩選實施例1中所述文庫後分離的一個克隆)中重新得到PTP35順序。PTP35，4相當於含有以下述方式定向之PTP35編碼順序的質粒pB luescript SK-其5′末端的前面是多聚接頭的BamHI位點，且其3′末端之後是多聚接頭的SalI位點。從質粒PTP35，4中分離一個包含PTP35編碼順序的均3000bp的StuI-SalI片段(圖1b，克隆12的核苷酸590至3561)，並再克隆到已用SmaI和SalI切割的質粒pRIT33中。將SmaI和StuI平頭連接在一起，從而使PTP35順序直接接在pRIT33中的因子X識別順序之後，而得以在碼內有適當的定位。所得質粒pRIT33-PTP35攜帶一個編碼120KDa融合體蛋白質的開放讀碼，所說的融合體蛋白質包含N末端的蛋白A，其後是由原核細胞裂解所需之特定順序分隔開的PTP35蛋白質。
此外，亦可在大腸桿菌中作為蛋白A融合蛋白質分別表達包含397個胺基酸的PTP35的細胞外區域部分。為了分離編碼該區域的順序，用NcoI切割質粒PTP35，4並用Klenow DNA聚合酶充填突出的末端以得到平頭末端。然後用StuI切割該質粒並將帶有平頭末端的1200bp片段(相當於克隆PTP35，12的核苷酸590至1804)再克隆到用SmaI切割並去磷酸化的質粒pRIT33中。所得質粒pRIT33-PTP35XC攜帶一個編碼約75KD蛋白質的開放讀碼，所說的蛋白質包括蛋白A和其後的由原核裂解特異性順序分開的PTP35細胞外區域胺基酸。
在用包含λPR啟動子之熱敏感性阻遏物(Nilsson，B.and Abrahmsen，L.，Methods in Enzymology 185∶144-161，1990)的稱為pRITc1857的相容性質粒共轉化的HB101大腸桿菌細胞(J.Mol.Biol.41∶454，1969)中分析蛋白A-PTP35XC融合體蛋白質的表達情況。
將溫度從30℃改變到42℃(熱休克)以使阻遏物失活並從而誘導啟動子開始轉錄。另外亦可在用1mM IPTG誘導lacUV5啟動子後獲得表達。因為該啟動子從不會完全靜止，所以在30℃下長時間培養被轉化的克隆也可高水平地表達蛋白質。圖5顯示了在30℃下生長3天後所達到的融合蛋白質表達水平。當在這些條件下生長時，蛋白A-PTP35XC融合體蛋白質的量約佔總細胞蛋白質的20%。如所期望的，雜交蛋白質在SDS-PAGE上的表觀分子量為75KD。
實施例Ⅳ在原核細胞中表達PTP35磷酸酶區域為了在大腸桿菌中表達重組蛋白質，已設計了pGEX系列的質粒(可購自Pharmacia;參見Smith，D.and Kevin，J.(1988)Gene 67∶31-40)，其中所說的重組蛋白質是作為與Sj26即由寄生蠕蟲日本血吸蟲編碼的26KD穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)的C末端形成的融合體表達的。可在非變性條件下，在固相化穀胱甘肽柱上的親和層析法從粗製細菌溶胞產物中純化這些融合體蛋白質。此外，已對載體進行了基因工程操作，從而可在用位點特異性蛋白酶如凝血酶消化後從融合體蛋白質上裂解掉GST載體，以得到實際上純的有用的成熟重組多肽。
為了得到GST-PTP35PTP酶區域，分別用含有BamHI和Eco RI位點的5′和3′引物，以PCR擴增編碼假定之細胞內區域(克隆PTP35，12中編碼的蛋白質的胺基酸583-961)的順序。然後將此順序插入已用同樣的酶切割的質粒pGKX-2T中。所得到的稱為pFC221的質粒編碼一個約70KD的融合蛋白質，該蛋白質由氨基末端的GST和其後PTP35的穩定的PTP酶區域組成。可按已述方法(Smith，D.and Kevin，J.(1988)Gene67∶31-40)在用IPTG誘導後在DH52菌株中高水平表達此融合蛋白質。為了純化PTP35的PTP酶區域可將超聲處理細胞後得到的可溶性溶胞產物與瓊脂糖-穀胱甘肽樹脂(Pharmacia，Sweden)一起保溫。保溫後，徹底洗滌樹脂以除去非特異性結合，再與催化活性量的凝血酶一起保溫以從結合於樹脂上的GST部分中釋放掉PTP酶區域。然後收集有可溶性PTP酶區域的保溫培養基，加入40%甘油後將酶等分並於-80℃下冷凍保存。圖6中顯示了一個表達並在瓊脂糖-穀胱甘肽樹脂柱上純化GST-PTP35PTP酶區域的實例。
權利要求
1.其細胞外區域包括Arg-Gly-Asp順序的哺乳動物受體型蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)或其功能衍生物。
2.根據權利要求1的PTP酶，其為天然來源的，並且基本上沒有與之天然有關聯的其他蛋白質。
3.根據權利要求1或2的PTP酶，其基本上具有圖1a或1b中所示的胺基酸順序或其功能衍生物。
4.包含與載體多肽融合的根據權利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物的融合蛋白質。
5.基本上由編碼根據權利要求1之PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子。
6.根據權利要求5的DNA分子，其為cDNA分子。
7.根據權利要求5的DNA分子，其為基因組DNA分子。
8.根據權利要求5至7中任一項的DNA分子，其中編碼載體多肽的核苷酸順序連接到所說的編碼PTP酶或其功能衍生物的順序上。
9.根據權利要求4的融合蛋白質或根據權利要求8的DNA分子，其中載體多肽包括一個或多個葡萄球菌蛋白A的IgG結合區。
10.含有根據權利要求5至9中任一項的DNA分子的表達載體。
11.根據權利要求10的表達載體轉化的宿主。
12.根據權利要求11的宿主，其為真核宿主。
13.根據權利要求11的宿主，其為原核宿主。
14.根據權利要求13的宿主，其為大腸桿菌。
15.製備根據權利要求1的PTP酶或其功能衍生物的方法，該方法包括(ⅰ)提供處於能使PTP酶或其功能衍生物得以表達之條件下的根據權利要求11至14中之任一項的宿主;和(ⅱ)純化如此得到的PTP酶或其功能衍生物。
16.根據權利要求15的方法，其中所說的宿主是按下述步驟製備的(a)分離基本上由編碼所說的PTP酶或其功能衍生物的核苷酸順序組成的DNA分子;(b)將所說的DNA分子插入到適當的表達載體中;和(c)用所說的表達載體轉化適當的宿主。
17.鑑定能刺激或抑制根據權利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物之酶促活性的化合物的方法，該方法包括(a)使化合物與純的膜製劑或完整的活的或固定的細胞形式的PTP酶或其功能衍生物接觸;(b)將步驟(a)的混合物保溫足夠長時間;和(c)將步驟(a)之混合物的酶促活性與不加化合物保溫的PTP酶或其功能衍生物的酶促活性相比較，從而確定該化合物是否刺激或抑制上述活性。
18.能夠與根據權利要求1，2或3的PTP酶或其功能衍生物結合的多克隆或單克隆抗體。
19.檢測試驗樣品中的根據權利要求1的PTP酶或其功能衍生物的方法，該方法包括使試驗樣品與根據權利要求18的抗體接觸，並檢測結合到PTP酶或其功能衍生物上的抗體的量。
20.檢測試驗樣品中的編碼根據權利要求1的PTP酶或其功能衍生物之mRNA的方法，該方法包括使存在於試驗樣品中的mRNA與基本上由圖1所示順序組成的DNA探針雜交，並檢測所得DNA∶mRNA雜交體的量。
全文摘要
其細胞外區域包含Arg-Gly-Asp順序的哺乳動物受體型蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP酶)或其功能衍生物。這類PTP酶的例子是II類PTP酶的新成員。
文檔編號C12N9/16GK1082110SQ9310907
公開日1994年2月16日 申請日期1993年7月27日 優先權日1992年7月31日
發明者L·莫那科, A·艾薩奇 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責任公司