一種用於乳桿菌發酵的複合培養基及其製備方法
2023-05-26 02:21:46
專利名稱：一種用於乳桿菌發酵的複合培養基及其製備方法
技術領域：
本發明涉及藥品、食品和食品添加劑以及獸藥、生物飼料、飼料添加劑生產技術領域，特別是涉及一種用於乳桿菌發酵的複合培養基及其製備方法。
背景技術：
乳桿菌(Lactobacillus)是重要的生理性細菌，亦是人類和其他哺乳動物腸道中正常菌群重要的成員。由於乳桿菌及其發酵產物的生理調節作用已被長期的應用實踐以及隨後的科學研究所證實，故乳桿菌及其製品在藥品、食品、獸藥和飼料生產領域的應用範圍正在不斷擴大，成為這些產業領域的重要生產菌株；近些年來，更由於其益生特性、結構特性和遺傳特性等特點，成為開發生物技術藥物的熱點研究對象，如正在研究將其用於生產SARS疫苗、禽流感疫苗和愛滋病疫苗的基因工程菌株。
而由於生產各類乳桿菌製品均有賴於乳桿菌的大規模發酵培養，因此，開發出乳桿菌的高效、廉價、易得、安全的生產型培養基，已成為提高乳桿菌製品生產能力和質量的關鍵環節之一。現有技術中，乳桿菌的大規模培養和發酵生產仍以經典的MRS培養基或改良MRS培養基為主。實踐證明，此類培養基培養乳桿菌效果較好，細胞繁殖快，生物量較大，菌體濃度的量級一般可達109cfu/ml。但目前存在的問題是該培養基配方複雜，質量和生產條件控制不易，原料種類多、價格高，不適宜大規模發酵培養時應用，而且需加入過多的無機鹽類，對人體和動物健康具有潛在的有害影響。因此，亟需尋找更為經濟、有效、易控和安全的乳桿菌發酵培養基，以適應乳桿菌的生產和相關產業的蓬勃發展。
發明內容
本發明的目的在於提供一種用於乳桿菌發酵的複合培養基及該複合培養基的製備方法。該培養基組成成分均為可食用成分，對人和動物無毒無害，可使乳桿菌在發酵過程中良好生長，菌體容易與發酵液進行分離，且發酵液、菌體、上清液均可直接用於生產相關製品，從而實現乳桿菌及其製品的高效、廉價和安全生產。
為實現本發明目的而提供的一種用於乳桿菌發酵的複合培養基，所述培養基包含8～70％甘草煎濾液。
所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基，所述培養基包含10％甘草煎濾液。
所述的培養基中，每1000毫升甘草煎濾液中可以加入7～25克多價蛋白腖。
所述培養基中，每1000毫升甘草煎濾液中也可以加入2.0～5.0克肝浸粉。
所述培養基中，可以或者還包括3％牛肉膏；或者還包括1％胰蛋白腖；或者還包括0.1％吐溫-80；或者還包括0.5％酵母膏；或者還包括1％大豆蛋白陳；或者還包括2％葡萄糖；或者還包括0.24％肝浸粉；或者還包括1％多價蛋白腖；或者還包括0.5％可溶性澱粉。
所述用於發酵乳桿菌的複合培養基，培養基的組成可以為10％甘草煎濾液 1000mL多價蛋白腖 10g所述用於發酵乳桿菌的複合培養基，培養基的組成可以為10％甘草煎濾液 1000mL多價蛋白腖 20g所述用於發酵乳桿菌的複合培養基，培養基的組成為10％甘草煎濾液 1000mL多價蛋白腖 10g肝浸粉 2.4g
為實現本發明目的還提供一種用於乳桿菌發酵的複合培養基的製備方法，包括以下步驟步驟A，製備8～70％甘草煎濾液；步驟B，在8～70％甘草煎濾液中根據發酵需要添加配比量的營養成分，製備用於乳桿菌發酵的複合培養基。
所述步驟A包括下列步驟步驟A1，選擇無黴變的乾燥甘草根莖或飲片，清水洗淨、除雜、烘乾；步驟A2，稱重後，用機械粉碎的方法將淨化後的甘草進行物理粉碎，直至得到平均粒徑為100-150μm的細粉體；步驟A3，將所述甘草細粉體進行低溫凍結至裂碎臨界點後，用氣流粉碎的方法進行能量粉碎，直至得到平均粒徑為5-25μm的超微粉體；步驟A4，將所得的所述甘草超微粉體，在40℃恆溫下分別用兩種微生物製備的粗酶液先後進行酶解反應，每一次酶解反應時間為24h。
步驟A5，酶解完畢的甘草超微粉體，根據所需濃度補加蒸餾水定容，升溫到100℃煎煮，同時滅菌滅酶，時間40分鐘；步驟A6，第一次煎煮完畢的甘草超微粉體，待煎液降溫至40℃時，分別用100目、200目、300目濾布分級過濾，壓榨取得濾液；濾渣再次煎煮，時間20分鐘，降溫後重複分級過濾和榨汁過程，合併濾液；步驟A7，取所述合併濾液，加蒸餾水定容至1000mL，即確定溶質/溶劑配比量為80～700g甘草生藥，按步驟A1～A7所述方法，製得1000mL的8～70％甘草煎濾液。
所述步驟B中的營養成分可以為多價蛋白腖。
所述步驟B中的營養成分可以為多價蛋白腖和肝浸粉。
所述步驟B中的營養成分可以為3％牛肉膏；或者可以為1％胰蛋白腖；或者可以為0.1％吐溫-80；或者可以為0.5％酵母膏；或者可以為1％大豆蛋白陳；或者可以為2％葡萄糖；或者可以為0.24％肝浸粉；或者可以為1％多價蛋白腖；或者可以為0.5％可溶性澱粉。
所述的兩種微生物製備的粗酶液進行的酶解反應，是指用去除菌體後的一種白腐菌發酵濃縮液，以及去除菌體後的一種綠色木黴發酵濃縮液，分別加入裝有甘草超微粉體的有蓋不鏽鋼淺盤中，在40℃恆溫下對甘草超微粉體進行酶解反應。
本發明的有益效果是本發明的複合培養基，可使嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌3種常用的重要益生乳桿菌在其中生長良好，其發酵增菌效果優於目前使用的經典乳桿菌培養基MRS培養基或MRS改良培養基，表明本發明提供了一種效果優良的乳桿菌選擇培養基。
本發明所涉及的新型乳桿菌複合培養基配方簡單，主要原料甘草價廉易得，屬於可食用天然物質，對人體和環境都十分安全，其它輔加成分種類少，用量小，且亦屬於可食用物質，安全性好；培養基製備方法簡單，性能可靠，增菌效果穩定性、重複性好，在搖瓶和/或發酵罐培養條件下均可達到的高密度培養水平，表明本發明提供了一種安全性、適用性均好的乳桿菌發酵培養基。
本發明所涉及的複合培養基成分組成和生產工藝流程簡單，成本低廉，適宜於乳桿菌的工業化大規模培養；發酵後菌體與發酵液中其它成分比重不同，易於分離，節省能耗和設備成本；不經分離的發酵液以及分離後的菌體和上清液均可直接開發成乳桿菌發酵相關製品，有利於發酵產品的多元化開發，且沒有廢液和廢渣汙染環境，表明本發明提供了一種經濟效益和生態效益俱佳的乳桿菌生產培養基。
本發明所涉及複合培養基中主要原料的來源，除甘草生藥外，尚可以是甘草莖葉(新鮮或乾燥)、提取主要藥學成分甘草酸後的藥渣、或甘草用於提取其它成分後所剩的廢渣；次要原料來源，則選用價格低廉、主要採用禽、畜肉類和/或大豆、花生等高油作物加工後的邊角廢料製備的多價蛋白腖，起到既充分利用寶貴的藥材和食品資源從而降低生產成本、又防止廢渣排放引起環境汙染的有益效果。
圖1為嗜酸乳桿菌(Lanc1)、植物乳桿菌(Lanc2)和保加利亞乳桿菌(Lanc3)在8～70％甘草煎濾液中的搖瓶培養生長曲線示意圖。
圖2為嗜酸乳桿菌(Lanc1)、植物乳桿菌(Lanc2)和保加利亞乳桿菌(Lanc3)在8～70％甘草煎濾液中的發酵罐培養生長曲線示意圖。
圖3為嗜酸乳桿菌(Lanc1)正交試驗中在三因素不同水平與試驗指標的關係示意圖；圖4為植物乳桿菌(Lanc2)正交試驗中在三因素不同水平與試驗指標的關係示意圖；圖5為保加利亞乳桿菌(Lanc3)正交試驗中在三因素不同水平與試驗指標的關係示意圖。
具體實施例方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明的一種用於乳桿菌發酵的複合培養基及該複合培養基的製備方法進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
本發明的目的基於以下構思而實現首先，培養基新配方的設計必須符合乳桿菌的營養要求。大量科學實驗和生產實踐表明乳桿菌培養需要較高且相對複雜的營養條件，因此，營養成分的適合和全面，成為研究本培養基配方的首要考慮因素；其次，培養基原料應該價廉易得。只有低成本並容易大量獲得的原料，才適於乳桿菌的大規模工業化生產。再次，培養基配方及其製備方法應該儘量簡單。過於複雜的配方和製備工藝，無疑會增加生產成本和質量控制的難度；最後，新培養基必須做到高效和安全。所謂高效，是指新培養基的培養效率至少不應低於目前常規使用的MRS培養基或改良MRS培養基；所謂安全，即培養基成分不應對人體和/或動物健康構成明顯乃至潛在的威脅。
基於以上思路，經多年研究，本發明發現食藥兩用植物甘草可作為乳桿菌發酵培養基的基礎原料。甘草(Glycyrrhiza)為豆科屬多年生植物，分布甚廣，在我國西北、東北、華北地區以及雲貴高原均有生長，具有抗寒、抗鹽鹼、耐熱、耐旱等優良特性，生態適應性強，生命力旺盛，系乾旱、半乾旱地區重要的植物資源之一。近年來，甘草在部分宜生地區已實現人工栽培，使其來源更加充分。甘草在醫藥方面的用途已廣為人知，為重要藥學成分甘草酸的主要藥源植物，其提取物還作為輔助劑、調味劑、添加劑、增稠劑、防腐劑等被廣泛用於醫藥、食品、飼料、日用化工等產業。儘管甘草的應用領域十分廣泛，但尚未見有人將其用於微生物的培養基成分。
本發明是在長期的益生菌培養研究過程中發現的，即8～70％甘草煎濾液對重要益生菌乳桿菌的生長具有明顯的選擇性促進作用，可視為該菌的益生元物質。甘草營養成分的分析研究表明，甘草除含有較高的甘草酸外，還含有非常豐富的營養成分及多種微量生長因子。各種營養成分中，粗蛋白質達22.62％，總糖18.32％，粗脂肪5.73％，果膠酸1.50％，維生素C 3.49％，表明甘草具有豐富全面、比例均衡的營養成分結構；各類胺基酸種類齊全，配比均衡，必需胺基酸含量高，佔總胺基酸的36.3％，非必需胺基酸中天冬氨酸、穀氨酸、精氨酸、脯氨酸含量較高；常量元素和微量元素均十分豐富，常量元素含量依次為Ca＞K＞Mg＞P＞Na，其中Ca和K含量最高，在甘草可測定的11種微量元素中，有九種為必需微量元素，即Fe、Zn、Cu、Cr、Mn、Co、Ni、Si、Mo。由上可知，甘草具有營養成分種類齊全、豐富全面的特點，很適合用做培養基的基礎成分。本發明在大量的乳桿菌培養相關研究的基礎上，通過系統研究，取得了突破性成果，充分證明8～70％甘草煎濾液能選擇性促進乳桿菌的生長，是本發明所述複合培養基的基礎性和關鍵性成分。這一成果不僅為乳桿菌製劑及其相關產品的生產研製出一種高效、廉價、安全的生產型培養基，而且也為甘草資源的進一步開發利用提供了一個新的方向。
為了確定甘草複合培養基的組成，本發明進行了如下工作研究確定甘草做為培養基基礎成分的適合狀態。
本發明中所用的植物藥材甘草為其地下部分-即根莖部分。研究表明，甘草的根莖富含木質纖維素(＞30％)。木質纖維素的大量存在，使植物細胞的各種組織結構和亞結構受到頑強保護，對各種營養成分和生物活性成分的溶出具有明顯的結構阻隔作用，使甘草豐富的營養作用難以體現；另外，鑑於乳桿菌的生長和發酵特點，只有溶解於溶劑中的可溶性成分和粒度極小的小分子物質才能被乳桿菌直接利用或分解利用，故必需將甘草進行充分的前處理，使其轉變為乳桿菌培養基基礎成分的合適狀態。本發明根據甘草的結構特點，通過反覆試驗，確定選用8～70％甘草煎濾液，較佳地，為10％甘草煎濾液(GJY，其中，GJY為「甘浸液」的漢語拼音字頭)為培養基複方配方研究中甘草成分的基本濃度。其前處理工藝流程如下a、選擇無黴變的乾燥甘草根莖或飲片，清水洗淨、除雜、烘乾。
b、稱重後，用機械粉碎(包括使用球磨機、棒磨機、管磨機，以及廣義球磨機振動磨、離心球磨和行星磨等)的方法將所述甘草進行物理粉碎，直至得到平均粒徑為100-150μm的細粉體。
c、將上述甘草細粉體低溫凍結至裂碎臨界點(玻璃點)後，用氣流粉碎(包括使用圓盤式氣流磨、循環管式氣流磨、對噴式氣流磨、流化床對噴式氣流磨和靶式氣流磨等)的方法進行能量粉碎，直至得到平均粒徑為5-25μm的超微粉體。
d、將上述所得甘草超微粉體，在40℃恆溫條件下分別用兩種微生物酶粗酶液(本發明應用去除菌體後的白腐菌GIM5.178-XW發酵濃縮液以及去除菌體後的綠色木黴CGMCC3.3711-XW發酵濃縮液)先後進行酶解反應，每一次酶解反應時間為24h。
e、酶解完畢的甘草超微粉體，根據所需濃度補加蒸餾水定容，升溫到100℃煎煮，同時滅菌滅酶，時間40分鐘。
f、第一次煎煮完畢的甘草超微粉體，待煎液降溫至40℃時，分別用100目、200目、300目濾布分級過濾，壓榨取得濾液；濾渣再次煎煮，時間20分鐘，降溫後重複分級過濾和榨汁過程，合併濾液。
g、取上述合併濾液，加蒸餾水定容至1000mL，即確定溶質/溶劑配比量為80～700g甘草生藥，按以上a～f步驟所述方法製得1000mL的8～70％甘草煎濾液。
較佳地，確定溶質/溶劑配比量為100g甘草生藥，按以上a～f步驟所述方法製得1000mL的10％甘草煎濾液。
觀察3種乳桿菌在單純的8～70％甘草煎濾液(本實驗中以10％甘草煎濾液為例)中的生長狀況。
為了觀察以甘草為基礎原料的複合培養基的發酵作用，首先對3種乳桿菌在10％甘草煎濾液中的生長狀況進行了系統研究。方法為a、將3株乳桿菌(分別為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌)復甦活化後，分別以0.2％的接種量，接種到裝有500ml的10％甘草煎濾液的無菌瓶中，在厭氧條件下，置37℃恆溫振蕩培養箱，以110r/min的速率振搖培養，以每3h為一時段，定時取樣進行活菌計數。如圖1所示，所得結果表明3株乳桿菌均可在10％甘草煎濾液中良好生長。嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌大約在培養18h時進入對數生長期，在培養48h時達到生長高峰，此時嗜酸乳桿菌的最大生長量為3.03×109cfu/ml，植物乳桿菌的最大生長量為2.43×109cfu/ml；保加利亞乳桿菌大約在培養15h進入對數生長期，在培養42h時達到生長高峰，此時保加利亞乳桿菌的最大生長量為2.11×109cfu/ml。
b、將3株乳桿菌(分別為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌)復甦活化後，分別以0.2％的接種量，接種到裝有8L的10％甘草煎濾液之10L厭氧培養罐中進行培養。培養條件初始pH5.8，溫度36.5℃，110r/min間歇攪拌，以每4h為一時段，定時取樣進行活菌計數。如圖2所示，所得結果表明3株乳桿菌均可在10％甘草煎濾液中良好生長。嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌大約在培養20h時進入對數生長期，在培養48h時達到生長高峰，此時嗜酸乳桿菌的最大生長量為2.86×109cfu/ml，植物乳桿菌的最大生長量為2.48×109cfu/ml；保加利亞乳桿菌大約在培養16h進入對數生長期，在培養40h時達到生長高峰，此時保加利亞乳桿菌的最大生長量為2.45×109cfu/ml。
上述結果證實，本發明所述方法製備的8～70％甘草煎濾液的營養組分構成，無論在實驗室水平的搖瓶培養條件，還是在中試水平的發酵罐培養條件，均適合上述3種重要益生乳桿菌的繁殖生長，可作為篩選優化大規模培養乳桿菌之生產培養基的初始培養基。
觀察在8～70％甘草煎濾液(本實驗中以10％甘草煎濾液為例)中添加不同輔助營養成分對乳桿菌生長狀態的影響。
在本發明中，參考經典乳桿菌培養基配方，在10％甘草煎濾液(GJY)中分別添加相關營養成分，考察其對10％甘草煎濾液(GJY)的營養補充效果，為研製效果更佳的複方培養基提供科學依據。方法為將3種乳桿菌(分別為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌)復甦活化後，分別以0.2％的接種量，接種到8L的10％甘草煎濾液(GJY)中，同時分別按常規比例加入受試物質成分，於10L厭氧培養罐中按前述條件進行培養，通過活菌數的測定，評價各受試物質成分對3株乳桿菌生長狀態的影響。結果為在10％甘草煎濾液(GJY)中分別添加牛肉膏、胰蛋白腖、大豆蛋白腖、多價蛋白腖、葡萄糖時，對3種乳桿菌的促進生長作用極為顯著；在10％甘草浸濾液(GJY)中分別添加肝浸粉、酵母膏、可溶性澱粉時，對3種乳桿菌的也有明顯促進生長作用。結果見表1、表2和表3。
表1 甘草煎濾液添加不同受試物質成分後嗜酸乳桿菌的生長狀況
注「+」表示添加後有促進作用；「-」表示添加後有抑制作用。
表2 甘草煎濾液添加不同受試物質成分後植物乳桿菌的生長狀況
表3 甘草煎濾液添加不同受試物質成分後保加利亞乳桿菌的生長狀況
從以上3個表的結果可以得出如下初步結論添加不同的輔加營養物質對3種乳桿菌生長的影響效果基本一致，表明乳桿菌屬對營養環境的要求具有共性特點。
與8～70％甘草煎濾液相組合，牛肉膏、胰蛋白腖、大豆蛋白腖、多價蛋白腖、葡萄糖均分別對3種乳桿菌有極為顯著的促進生長作用，但葡萄糖、牛肉膏濃度偏高，影響成本，而且牛肉膏不易保存和使用，葡萄糖則易造成菌株對8～70％甘草煎濾液利用的幹擾；所選3種蛋白腖的添加濃度相同，但其中多價蛋白腖成本最低、營養更全面，效果也最好。
與8～70％甘草煎濾液相組合，酵母膏、肝浸粉、可溶性澱粉亦分別對3種乳桿菌有明顯促進生長作用，但酵母膏和可溶性澱粉所需濃度遠遠大於肝浸粉，體積大，成本偏高，不適合用於生產培養基。
篩選優化了甘草培養基的配方，採用正交試驗法確定了甘草複合培養基的最佳配方組成。
綜合前述結果，並充分考慮成本因素，通過多次篩選試驗，較佳地，本發明實施例選用多價蛋白腖和肝浸粉為輔助營養添加物質，與10％甘草煎濾液(GJY)分別構成3種乳桿菌的專用複合培養基。進一步地，在三因素的單因子試驗基礎上，設計正交試驗對每種複合培養基中各種物質的最適配比組合進行了篩選優化。本發明採用了L9(34)正交表。
首先選擇嗜酸乳桿菌的一個菌株(Lanc1)作為試驗菌株實施正交試驗。具體過程將Lanc1復甦活化後，以0.2％的接種量接種於所選物質成分以不同配比濃度組合的各個液態培養基中(每瓶500mL)，在厭氧條件下，置37℃恆溫振蕩培養箱，以110r/min的速率振搖培養48h，以每4h為一時段，定時取樣進行活菌計數。所得正交試驗結果如表4、表5和表6所示，結果表明參加試驗的9個培養基組合中，第5號組合為最優組合，即A2 B2(見表5)。為尋找理論上的最優培養基組合，作所選兩個因素不同水平與試驗指標的關係圖，如圖3所示，結果為A2、B2分別顯示為兩個因素的最佳水平。
在得到上述較理想的培養基組合配方後，選擇植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌各一個菌株(分別為Lanc2和Lanc3)，進行培養效果的擴展驗證試驗。具體過程將Lanc2和Lanc3復甦活化後，分別以0.2％的接種量接種於甘草浸濾液、多價蛋白腖、肝浸粉三種物質以不同濃度配比組合的各個液態培養基中(每瓶500mL)，在厭氧條件下，置37℃恆溫振蕩培養箱，以110r/min的速率振搖培養48h，以每4h為一時段，定時取樣進行活菌計數。所得正交試驗結果如表7～12所示，結果表明與Lanc1相同，Lanc2在添加多價蛋白腖的10％甘草煎濾液中培養，活菌數可達1010cfu/ml以上，如圖4所示，最優組合亦為A2B2，即在僅有10％甘草和2％蛋白腖的複合培養基中便可旺盛生長(見表8)；而Lanc3則在同時添加多價蛋白腖和肝浸粉的10％甘草煎濾液中培養，活菌數可達1010cfu/ml以上，如圖5所示，最優組合為A2B2C2，即在有10％的甘草、1％蛋白腖和0.24％肝浸粉的複合培養基中Lanc3生長最好(見表11)。
經試驗得出以下結果1、嗜酸乳桿菌發酵用複合培養基的適宜配方可以是8～70％甘草煎濾液1000ml多價蛋白腖 7-25g更適合的配方組成是10％甘草煎濾液 1000ml多價蛋白腖 10g2、植物乳桿菌發酵用複合培養基的適宜配方可以是8～70％甘草煎濾液1000ml多價蛋白腖 7-25g更適合的配方組成是10％甘草煎濾液 1000ml多價蛋白腖 20g3、保加利亞乳桿菌發酵用複合培養基的適宜配方可以是8～70％甘草煎濾液1000ml多價蛋白腖 7-25g肝浸粉 2.0g-5.0g更適合的配方組成是10％甘草煎濾液 1000ml多價蛋白腖 10g肝浸粉 2.4g正交試驗結果列表如下
表4 Lanc1正交試驗水平和因素列表
表5 Lanc1正交試驗方案和結果分析表
表6 Lanc1在A2B2組合配方培養基中驗證實驗
表7 Lanc2正交試驗水平和因素列表
表8 Lanc2正交試驗方案和結果分析表
表9 Lanc2在A2B2組合配方培養基中驗證實驗
表10 Lanc3正交試驗水平和因素列表
表11 Lanc3正交試驗方案和結果分析表
表12 Lanc3在A2B2C2組合配方培養基中驗證實驗
本發明所述乳桿菌發酵用複合培養基的製備方法如下(1)製備8～70％甘草煎濾液
a、選擇無黴變的乾燥甘草根莖或飲片，清水洗淨、除雜、烘乾。
b、稱重後，用機械粉碎(包括使用球磨機、棒磨機、管磨機，以及廣義球磨機振動磨、離心球磨和行星磨等)的方法將所述甘草進行物理粉碎，直至得到平均粒徑為100-150μm的細粉體。
c、將上述甘草細粉體低溫凍結至裂碎臨界點(玻璃點)後，用氣流粉碎(包括使用圓盤式氣流磨、循環管式氣流磨、對噴式氣流磨、流化床對噴式氣流磨和靶式氣流磨等)的方法進行能量粉碎，直至得到平均粒徑為5-25μm的超微粉體。
d、將所得上述甘草超微粉體，在40℃恆溫條件下分別用兩種微生物酶粗酶液(本發明用去除菌體後的白腐菌GIM5.178-XW發酵濃縮液以及去除菌體後的綠色木黴CGMCC3.3711-XW發酵濃縮液)先後進行酶解反應，每一次酶解反應時間為24h。
所述的兩種微生物製備的粗酶液進行的酶解反應，是指用去除菌體後的一種白腐菌發酵濃縮液，以及去除菌體後的一種綠色木黴發酵濃縮液，分別加入裝有甘草超微粉體的有蓋不鏽鋼淺盤中，在40℃恆溫下對甘草超微粉體進行酶解反應。
e、酶解完畢的甘草超微粉體，根據所需濃度補加蒸餾水定容，升溫到100℃煎煮，同時滅菌滅酶，時間40分鐘。
f、第一次煎煮完畢的甘草超微粉體，待煎液降溫至40℃時，分別用100目、200目、300目濾布分級過濾，壓榨取得濾液；濾渣再次煎煮，時間20分鐘，降溫後重複分級過濾和榨汁過程，合併濾液。
g、取上述合併濾液，加蒸餾水定容至1000mL，即溶質/溶劑配比量為80～700g甘草生藥，按a～f所述步驟製得1000mL的8～70％甘草煎濾液。
(2)製備複合培養基在8～70％甘草煎濾液中根據發酵需要添加配比量的多價蛋白腖，即製得嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌發酵用複合培養基；添加配比量的多價蛋白腖和肝浸粉，即製得保加利亞乳桿菌發酵用複合培養基。
下面通過更具體的較佳實施例進一步說明本發明的一種用於乳桿菌發酵的複合培養基及該複合培養基的製備方法實施例1嗜酸乳桿菌發酵用複合培養基的組成為10％甘草煎濾液 10000ml多價蛋白腖 100g嗜酸乳桿菌發酵用複合培養基的製備(1)製備10％甘草煎濾液(GJY)a、選擇無黴變的乾燥甘草根莖或飲片，清水洗淨、除雜、烘乾。
b、稱取甘草1000g，用機械粉碎的方法將所述甘草進行物理粉碎，直至得到平均粒徑為100-150μm的細粉體。
c、將上述甘草細粉體低溫凍結至裂碎臨界點後，用氣流粉碎的方法進行能量粉碎，直至得到平均粒徑為5-25μm的超微粉體。
d、將所得上述甘草超微粉體，在40℃恆溫下分別用去除菌體後的白腐菌GIM5.178-XW發酵濃縮液以及去除菌體後的綠色木黴CGMCC3.3711-XW發酵濃縮液先後進行酶解反應，每一次酶解反應時間為24h。
e、酶解完畢的甘草超微粉體，加蒸餾水至10000ml，升溫到100℃煎煮，同時滅菌滅酶，時間40分鐘。
f、第一次煎煮完畢的甘草超微粉體，待煎液降溫至40℃時，分別用100目、200目、300目濾布分級過濾，壓榨取得濾液；濾渣再次煎煮，時間20分鐘，降溫後重複分級過濾和榨汁過程，合併濾液。
g、取上述合併濾液，補加蒸餾水定容至10000ml，即確定溶質/溶劑配比量為1000g生甘草藥，按a～f所述步驟製得10000mL的10％甘草煎濾液(GJY)。
(2)製備乳桿菌複合培養基在製得的10％甘草煎濾液(GJY)中添加100g多價蛋白腖，即製得嗜酸乳桿菌發酵用複合培養基。
實施例2植物乳桿菌發酵用複合培養基的組成為10％甘草煎濾液 10000ml多價蛋白腖 200g植物乳桿菌發酵用複合培養基的製備(1)製備10％甘草煎濾液(GJY)a、選擇無黴變的乾燥甘草根莖或飲片，清水洗淨、除雜、烘乾。
b、稱取甘草1000g，用機械粉碎的方法將所述甘草進行物理粉碎，直至得到平均粒徑為100-150μm的細粉體。
c、將上述甘草細粉體低溫凍結至裂碎臨界點後，用氣流粉碎的方法進行能量粉碎，直至得到平均粒徑為5-25μm的超微粉體。
d、將所得上述甘草超微粉體，在40℃恆溫下分別用去除菌體後的白腐菌GIM5.178-XW發酵濃縮液以及去除菌體後的綠色木黴CGMCC3.3711-XW發酵濃縮液先後進行酶解反應，每一次酶解反應時間為24h。
e、酶解完畢的甘草超微粉體，加蒸餾水至10000ml，升溫到100℃煎煮，同時滅菌滅酶，時間40分鐘。
f、第一次煎煮完畢的甘草超微粉體，待煎液降溫至40℃時，分別用100目、200目、300目濾布分級過濾，壓榨取得濾液；濾渣再次煎煮，時間20分鐘，降溫後重複分級過濾和榨汁過程，合併濾液。
g、取上述合併濾液，補加蒸餾水定容至10000ml，即確定溶質/溶劑配比量為1000g生甘草藥，按a～f所述步驟製得10000mL的10％甘草煎濾液(GJY)。
(2)製備乳桿菌複合培養基在製得的10％甘草煎濾液(GJY)中添加200g多價蛋白腖，即製得植物乳桿菌發酵用複合培養基。
實施例3保加利亞乳桿菌發酵用複合培養基的組成為10％甘草煎濾液 10000ml多價蛋白腖 100g肝浸粉 24g保加利亞乳桿菌發酵用複合培養基的製備(1)製備10％甘草煎濾液(GJY)a、選擇無黴變的乾燥甘草根莖或飲片，清水洗淨、除雜、烘乾。
b、稱取甘草1500g，用機械粉碎的方法將所述甘草進行物理粉碎，直至得到平均粒徑為100-150μm的細粉體。
c、將上述甘草細粉體低溫凍結至裂碎臨界點後，用氣流粉碎的方法進行能量粉碎，直至得到平均粒徑為5-25μm的超微粉體。
d、將所得上述甘草超微粉體，在40℃恆溫下分別用去除菌體後的白腐菌GIM5.178-XW發酵濃縮液以及去除菌體後的綠色木黴CGMCC3.3711-XW發酵濃縮液先後進行酶解反應，每一次酶解反應時間為24h。
e、酶解完畢的甘草超微粉體，加蒸餾水至10000ml，升溫到100℃煎煮，同時滅菌滅酶，時間40分鐘。
f、第一次煎煮完畢的甘草超微粉體，待煎液降溫至40℃時，分別用100目、200目、300目濾布分級過濾，壓榨取得濾液；濾渣再次煎煮，時間20分鐘，降溫後重複分級過濾和榨汁過程，合併濾液。
g、取上述合併濾液，補加蒸餾水定容至10000ml，即確定溶質/溶劑配比量為1000g生甘草藥，按a～f所述步驟製得10000mL的10％甘草煎濾液(GJY)。
(2)製備乳桿菌複合培養基在製得的10％甘草煎濾液(GJY)中添加100g多價蛋白腖、24g肝浸粉，即製得保加利亞乳桿菌發酵用複合培養基。
本發明的複合培養基均在嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和保加利亞乳桿菌等3種重要益生乳桿菌中生長良好，最大生長量級均可達到1010cfu/ml，發酵增菌效果優於目前使用的經典乳桿菌培養基MRS培養基或MRS改良培養基，表明本發明提供了一種效果優良的乳桿菌選擇培養基。
本發明所涉及的新型乳桿菌複合培養基配方簡單，主要原料甘草價廉易得，屬於可食用的天然物質，對人體和環境都十分安全，其它輔加成分種類少，用量小，且亦屬於可食用物質，安全性好；培養基製備方法簡單，性能可靠，增菌效果穩定性、重複性好，在搖瓶和/或發酵罐培養條件下均可達到活菌數1010cfu/ml的高密度培養水平，表明本發明提供了一種安全性、適用性均好的乳桿菌發酵培養基。
本發明所涉及的複合培養基成分組成和生產工藝流程簡單，成本低廉，適宜於乳桿菌的工業化大規模培養；發酵後菌體與發酵液中其它成分比重不同，易於分離，節省能耗和設備成本；不經分離的發酵液以及分離後的菌體和上清液均可直接開發成乳桿菌相關製品，有利於發酵產品的多元化開發，且沒有廢液和廢渣汙染環境，表明本發明提供了一種經濟效益和生態效益俱佳的乳桿菌生產培養基。
本發明所涉及複合培養基中主要原料的來源，除甘草生藥外，尚可以是甘草莖葉(新鮮或乾燥)、提取主要藥學成分甘草酸後的藥渣、或甘草用於提取其它成分後所剩的廢渣；次要原料來源，則選用價格低廉、主要採用禽、畜肉類和/或大豆、花生等高油作物加工後的邊角廢料製備的多價蛋白腖，起到既充分利用寶貴的藥材和食品資源從而降低生產成本、又防止廢渣排放引起環境汙染的有益效果。
本發明的實施例是為了更好地理解本發明進行的詳細的描述，並不是對本發明所保護的範圍的限定，本發明的保護範圍以本發明權利要求限定為準。因此，本領域普通技術人員不脫離本發明的主旨未經創造性勞動而對本明所做的改變在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，所述培養基包含8～70％甘草煎濾液。
2.根據權利要求1所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，所述培養基包含10％甘草煎濾液。
3.根據權利要求1或2所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，所述的培養基中，每1000毫升甘草煎濾液中加入7～25克多價蛋白腖。
4.根據權利要求1或2所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，所述培養基中，每1000毫升甘草煎濾液中加入2.0～5.0克肝浸粉。
5.根據權利要求3所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，所述培養基中，每1000毫升甘草煎濾液中加2.0～5.0克肝浸粉。
6.根據權利要求1或2所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，所述培養基中，或者還包括3％牛肉膏；或者還包括1％胰蛋白腖；或者還包括0.1％吐溫-80；或者還包括0.5％酵母膏；或者還包括1％大豆蛋白陳；或者還包括2％葡萄糖；或者還包括0.24％肝浸粉；或者還包括1％多價蛋白腖；或者還包括0.5％可溶性澱粉。
7.根據權利要求2所述用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，培養基的組成為10％甘草煎濾液1000mL多價蛋白腖10g
8.根據權利要求2所述用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，培養基的組成為10％甘草煎濾液1000mL多價蛋白腖20g
9.根據權利要求2所述用於乳桿菌發酵的複合培養基，其特徵在於，培養基的組成為10％甘草煎濾液1000mL多價蛋白腖10g肝浸粉 2.4g
10.一種用於乳桿菌發酵的複合培養基的製備方法，其特徵在於包括以下步驟步驟A，製備8～70％甘草煎濾液；步驟B，在8～70％甘草煎濾液中根據發酵需要添加配比量的營養成分，製備用於乳桿菌發酵的複合培養基。
11.根據權利要求9所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基的製備方法，其特徵在於，所述步驟A包括下列步驟步驟A1，選擇無黴變的乾燥甘草根莖或飲片，清水洗淨、除雜、烘乾；步驟A2，稱重後，用機械粉碎的方法將淨化後的甘草進行物理粉碎，直至得到平均粒徑為100-150μm的細粉體；步驟A3，將所述甘草細粉體進行低溫凍結至裂碎臨界點後，用氣流粉碎的方法進行能量粉碎，直至得到平均粒徑為5-25μm的超微粉體；步驟A4，將所得的所述甘草超微粉體，在40℃恆溫下分別用兩種微生物製備的粗酶液先後進行酶解反應，每一次酶解反應時間為24小時；步驟A5，酶解完畢的甘草超微粉體，根據所需濃度補加蒸餾水定容，升溫到100℃煎煮，同時滅菌滅酶，時間40分鐘；步驟A6，第一次煎煮完畢的甘草超微粉體，待煎液降溫40℃時，分別用100目、200目、300目濾布分級過濾，壓榨取得濾液；濾渣再次煎煮，時間20分鐘，降溫後重複分級過濾和榨汁過程，合併濾液；步驟A7，取所述合併濾液，加蒸餾水定容至1000mL，即確定溶質/溶劑配比量為80～700g甘草生藥，按步驟A1～A7所述方法，製得1000mL的8～70％甘草煎濾液。
12.根據權利要求10或11所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基的製備方法，其特徵在於，所述步驟B中的營養成分為多價蛋白腖。
13.根據權利要求10或11所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基的製備方法，其特徵在於，所述步驟B中的營養成分為多價蛋白腖和肝浸粉。
14.根據權利要求10或11所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基的製備方法，其特徵在於，所述步驟B中的營養成分為3％牛肉膏；或者為1％胰蛋白腖；或者為0.1％吐溫-80；或者為0.5％酵母膏；或者為1％大豆蛋白陳；或者為2％葡萄糖；或者為0.24％肝浸粉；或者為1％多價蛋白腖；或者為0.5％可溶性澱粉。
15.根據權利要求11所述的用於乳桿菌發酵的複合培養基的製備方法，其特徵在於，所述的兩種微生物製備的粗酶液進行的酶解反應，是指用去除菌體後的一種白腐菌發酵濃縮液，以及去除菌體後的一種綠色木黴發酵濃縮液，分別加入裝有甘草超微粉體的有蓋不鏽鋼淺盤中，在40℃恆溫下對甘草超微粉體進行酶解反應。
全文摘要
本發明公開了一種用於乳桿菌發酵的複合培養基及其製備方法。所述培養基包含8～70％甘草煎濾液。所述的培養基中，每1000毫升甘草煎濾液中可以加入7～25克多價蛋白腖。所述培養基中，每1000毫升甘草煎濾液中也可以加入2.0～5.0克肝浸粉。所選3種乳桿菌均在該培養基中生長良好，優於經典的乳桿菌選擇性培養基－MRS培養基的液體深層培養效果。該培養基配方非常簡單，製作方法簡便，培養條件易控，成本低廉，安全無害，可廣泛用於作為最重要益生菌之一的乳桿菌的研究、開發和生產等。
文檔編號C12R1/225GK101037662SQ20071007823
公開日2007年9月19日 申請日期2007年2月14日 優先權日2007年2月14日
發明者吳力克, 胡錦華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院