動物弓形蟲病pcr檢測試劑盒的製作方法

2023-05-26 02:14:21 1

專利名稱：：動物弓形蟲病pcr檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及動物弓形蟲病的診斷和檢測
技術領域：
，尤其涉及動物弓形蟲病PCR檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術：
：弓形蟲病是由弓形蟲感染人和各種動物所引起的人獸共患寄生蟲病，廣泛分布於我國及世界各地，西方國家人體平均感染率高達30%左右(Tenteretal，2000;謝明權和李國清，2003)，我國人體平均感染率達7.88%，全國約有1億人感染(呂元聰和崔君兆，1994;陳兆義等，2005;馮月菊等，2005;許隆祺等，2005;徐祥珍等，2005;張靜等，2006)，動物感染率更高(謝德華等，2004)。弓形蟲病不僅是人類最常見的感染性疾病之一，而且亦是免疫抑制及免疫缺陷人群的主要致死病因之一(Luftetal.1984;Zangerleetal，1991;Luft&Remington,1992;Crigg等，2001;劉德純和林清森，2001)，它與優生優育也有著密切關係，孕婦感染後可能直接影響胎兒的發育，嚴重時可致胎兒畸型甚至死亡。因此，弓形蟲病不僅嚴重危害我國人民的生命和健康，而且嚴重影響中華民族的素質。我國能自然感染弓形蟲病的動物種類有豬、黃牛、水牛、馬、山羊、綿羊、鹿、貓、犬、雞、兔等近200種(殷國榮等，1996;葉玉美等，2002;於永蘭等，2006，張翰等，2007)，其中以豬的感染率較高，危害最為嚴重，是人體弓形蟲病的主要傳染源(張德才等，1994。朱繼斌，2006)。在我國人民的飲食結構中，豬是最主要的肉食品來源，其健康與否影響千家萬戶。目前在我國豬弓形蟲病的地方性暴發流行還時常發生，尤其是在集約化豬場還較嚴重，豬群發病率高，死亡率也高，而且弓形蟲病所引起的母豬流產和死胎也普遍存在(傅斌等，1995;劉九生和陳思輝，1996;由軒等，1998;廣P泳娟，2002;謝明權和李國清，2003;謝德華等，2004)，而且豬弓形蟲病還經常與其它傳染病混合感染(林笑智，2001;程海慶等，2002;馬軍啟和吳秀風，2002)。隨著我國養豬業的發展，種豬及肉豬流通渠道的暢通，更加速了豬弓形蟲病的傳播和流行，給養豬業造成嚴重經濟損失，並嚴重威脅人體健康。據估計，美國每年大約有225，000新病例，50%的病例是通過食物感染的(Meadetal，1999)。在美國豬肉也已成為人感染弓形蟲病的主要來源(Dubeyetal，1990)。對人和動物弓形蟲病的準確診斷是有效防控弓形蟲病的前提，為此國內外學者已作了多方面的探索，包括病原學、免疫學和分子生物學診斷方法(謝明權和李國清，2003;謝德華等，2004;廖申權等，2006)。從病料中查出弓形蟲的存在，是最可靠的檢測方法，可將病料作觸片或組織切片進行染色檢查，或將病料接種於易感動物分離蟲體。染色鏡檢通常用Giemsa染色或Wright，s染色，但症狀輕微或即將耐過的病豬，以及使用磺胺類藥物治療過的病豬，往往不易檢出弓形蟲。加之病料採集的局限性，也容易被漏檢(謝德華等，2004;廖申權等，2006)。弓形蟲感染人和動物後可在體內釋放循環抗原並誘導產生抗弓形蟲抗體，可採用免疫學方法檢測人和動物體內的弓形蟲循環抗原及抗弓形蟲抗體(李輝等，2006，李健等，2006)。可用於弓形蟲病免疫診斷的方法有很多(於恩庶等，1992)，包括各種凝集試驗(Dubeyetal，1995;Dubey，1997;謝德華等，2004;廖申權等，2006)(例如間接血凝試驗，IHA)，間接螢光抗體試驗(IFAT)(Arko-Mensahetal，2000)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)及其改進方法(陳子慶等，1995;吳敘蘇和計浩，1995;趙恆梅等，1997;曾明安等，2000;鄭蘭豔和王海鵬，2000;Damriyasaetal，2004)，膠體金免疫層析法(ColloidalGoldl腿unochromatography)等(張陽根，1996;郭蘭英和萬巻芳，2000)。但弓形蟲病的免疫學檢測方法仍存在很多問題，如交叉反應、檢出率不高、假陽性較多、費時費力，又多受機體免疫狀態的影響，容易出現誤診和漏診，不能作為現症的診斷依據等(廖申權等，2006)。近年來，以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的分子生物學方法已在寄生蟲學領域廣泛應用(朱興全和Gasser，1999;何芳等，2004;Zhuetal.，2007)。PCR以其簡便、快速、特異、敏感等優勢已在人及動物弓形蟲病的診斷中應用(單連玉等，2003;Remingtonetal，2004;Switajetal，2005;廖申權等，2006;張翰等，2007)，弓形蟲病特異PCR診斷方法就是其中最常用的一種(Burgetal，1989;Savvaetal.，1990;Ho-yenetal,1992;Hurtadoetal，2001;Cultreraetal，2002;Buchbinderetal，2003;Filisettietal，2003;Continietal，2003，2005;廖申權等，2006;張翰等，2007)，而建立弓形蟲病特異PCR診斷方法的關鍵是尋找敏感、特異的遺傳標記。然而，目前多採用B1基因(Pellouxetal，1998;Continietal，2002)及核糖體DNA內轉錄間隔區(ITS)序列(Jaureguietal，2001;謝德華等，2005)作為遺傳標記而建立弓形蟲病特異PCR診斷方法。綜上所述，現有的檢測方法存在交叉反應、檢出率不高、假陽性較多、費時費力，容易出現誤診和漏診，敏感性有限等問題，而且還沒有用於犬、貓弓形蟲病的檢測，而犬、貓也是與人類密切接觸的動物，經調査，臨床上因其它疾病就診於寵物醫院的40隻犬中，9隻的血液中可擴增出弓形蟲529bpDNA序列，說明犬的弓形蟲感染還很普遍。從市售用於食用的10隻貓中，1隻的血液中可擴增出弓形蟲529bpDNA序列，說明貓的弓形蟲感染也很普遍，應引起有關部門、寵物主人及家人的高度關注。迫切需要探討一種使用方便、靈敏度高且可以檢測犬、貓動物弓形蟲的檢測方法。Homan等(2000)從弓形蟲基因組中鑑定出一個200-300個拷貝的529bp重複DNA片段，並認為是弓形蟲病診斷的理想遺傳標記。529bp序列比Bl基因具有更高的敏感性和準確性(Reischletal，2003;Edvinssonetal，2006)。但目前沒有出現利用這一科研成果設計發明的弓形蟲檢測方法以及試劑盒。
發明內容本發明的目的旨在提供一種動物弓形蟲病PCR檢測試劑盒，尤其適用於豬、犬或貓弓形蟲病檢測的試劑盒。本發明的另一個目的是提供所述動物弓形蟲病PCR檢測試劑盒的使用方法。本發明的目的通過以下技術方案實現提供一種動物弓形蟲病PCR檢測試劑盒，它含有(1)DNA裂解液；(2)紅細胞裂解液；(3)白細胞裂解液；(4)PCR反應液；(5)弓形蟲基因DNA陽性對照液。所述DNA裂解液為100mM的NaCl、pH8.0的lOmMTris-Cl、pH8.0的25mMEDTA、W/V為1%的SDS和4ug/uL蛋白酶K的混合溶液；所述紅細胞裂解液為10mM的NaCl、pH8.0的lOmMTris-Cl和5mM的MgCl2的混合溶液;所述白細胞裂解液為100mM的NaCl、pH8.0的lOmMTris-Cl、pH8.0的lmMEDTA和W/V為0.5%的SDS的混合溶液；所述PCR反應液為終濃度各為200PM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP;終濃度各為0.5pmo1/uL的引物T0X4、T0X5和2raM的MgCl2的混合溶液。所述試劑盒的使用方法包括以下步驟(1)提取血液樣品或組織樣品的DNA;(2)PCR擴增；(3)取擴增後的PCR產物加樣於瓊脂糖凝膠上，電泳後置於紫外透射儀下觀察結果並拍照分析，得出檢測結果。步驟(1)所述提取血液樣品的DNA為採用全血樣品與0.5M/LEDTA以1:9的比例混合抗凝，離心去除血漿，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心沉澱白細胞，加入白細胞裂解液裂解白細胞，加入DNA裂解液後水浴，酚-氯仿法提取DNA。步驟(1)所述提取組織樣品的DNA為剪碎組織樣品，加DNA裂解液，置於溫箱消化過夜，酚-氯仿法提取DNA。血液樣品和組織樣品也可用BioFlux公司生產的試劑盒BiospinBloodGenomicDNAExtractionKit禾口BiospinTissueGenomicDNAExtractionKit按說明書提取。步驟(2)所述PCR擴增是按照擴增樣品數加2後的數目取離心管並標記，向離心管中依次加入滅菌去離子雙蒸水、10Xbuffer、MgCl2、dNTPs，上下遊引物T0X4和T0X5、TaqDNA聚合酶，旋渦振蕩混勻；瞬時離心後，分裝於0.2uL的離心管中，最後加樣品模板DNA或陰、陽性對照；再旋渦振蕩混勻，瞬時離心，置於PCR擴增儀中擴增。所述TaqDNA聚合酶按每個PCR反應按1.25U加入。所述PCR擴增的條件為Mg唚濃度梯度為1.5mM2.5mM、退火溫度為5(TC65t:和循環數為3045，優選擴增的條件為退火溫度為57°C;MgW的濃度為2.OraM;循環數為38。PCR擴增體系見表l:表lPCR擴增體系tableseeoriginaldocumentpage9PCR擴增條件94"C預變性94"C變性57"C退火72"C延伸72。C後延伸所述PCR擴增的優選條件為MgW濃度梯度為1.5mM2.5mM、退火溫度為50。C65。C和循環數為3045。所述PCR擴增的最佳條件為退火溫度為57°C;MgCh的濃度為2.0mM;循環數為38。本發明使用Homan等公開發表的從弓形蟲基因組中鑑定出用於5min30sec30sec卜38個循環L5min10min擴增529bpDNA重複序列的特異引物T0X4及T0X5，其核苷酸序列組成如下上遊引物T0X4序列為5'-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3'，下遊引物T0X5序列為5'-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3'，預期擴增片段大小約530bp。本發明的有益效果是本發明在Homan等(2000)鑑定出弓形蟲特有的529bpDNA片段的基礎上，建立了以529bpDNA片段作為遺傳標記的特異PCR檢測方法，並在豬、犬、貓弓形蟲病檢測中應用；本試劑盒還可用於實驗豬弓形蟲病藥物篩選的藥效評價。本發明建立的特異PCR方法可用於檢測犬、貓是否現症感染弓形蟲。實驗表明，本發明用弓形蟲529bp重複序列所建立的特異PCR診斷方法具有敏感、特異、快速等特點，既可用於豬、鼠實驗弓形蟲病的檢測、藥物篩選的檢測手段之一，也可用於豬、犬、貓弓形蟲病現症感染的診斷。綜上所述，本發明操作簡單程序化，方法特異性強，敏感性高，結果判定客觀，特別適用於豬、犬或貓現症感染弓形蟲的檢測與調查；也可用於豬肉中弓形蟲的檢測；還可作為實驗動物弓形蟲病治療藥物篩選時藥效評價的手段之一。具體實施例方式下面的實施例旨在對本發明進行進一步詳細的說明。實施例l試劑盒的組成試劑盒內含DNA裂解液30ml，其中含lOOmM的NaCl、pH8.0的lOmM的Tris—Cl、pH8.0的25mM的EDTA、1%(W/V)的SDS和4ug/uL的蛋白酶K;紅細胞裂解液100ml，其中含10mM的NaCl、pH8.0的lOraM的Tris-Cl、5mM的MgCl2;白細胞裂解液lOOml，其中含lOOmM的NaCl、pH8.0的lOraM的Tris-CI、pH8.0的ImM的EDTA、0.5%(W/V)的SDS;PCR反應液100個反應(25uL/反應)，為終濃度各200MM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP、終濃度各0.5pmo1/uL的引物T0X4及T0X5，2mM的MgCl2，Taq酶按每個PCR反應按1.25U加入，弓形蟲基因組DNA陽性對照1支。實施例2試劑盒特異性試驗用經過DNA有效性驗證的犬新孢子蟲、毛滴蟲、微小隱孢子蟲、惡性瘧原蟲、柔嫩艾美耳球蟲、豬蛔蟲等6個對照樣品DNA各1uL為模板，按照試劑盒的反應條件進行特異PCR擴增，同時設空白對照和試劑盒陽性對照。PCR擴增條件為94'C預變性5min94。C變性30sec57。C退火30sec[38個循環72。C延伸1.5min72。C後延伸10minPCR產物在0.8%TBE瓊脂糖凝膠中電泳後，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系統攝像。結果只有弓形蟲試劑盒陽性對照DNA樣品擴增出約530bp的條帶，而上述其他6種對照寄生蟲和陰性對照均無條帶出現。實施例3試劑盒的敏感性試驗首先將計數後抽提的弓形蟲速殖子DNA進行稀釋，旋渦振蕩混勻，按EppendorfBiophotometer核酸蛋白測定儀的操作規程，檢測其總DNA含量。採用倍比稀釋法按10X、IOOX、IOOOX、2000X、4000X稀釋速殖子DNA。PCR擴增條件同上，同時設空白對照。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定其敏感性。通過5個濃度梯度的弓形蟲DNA的PCR反應，表明該PCR檢測方法最低能檢測到0.5個弓形蟲速殖子的DNA。實施例4試劑盒的保存期試驗將在4"C和-2(TC保存1個月、3個月、6個月、9個月的試劑盒對已知樣品進行檢測，擴增條件同前述。結果表明試劑盒可在4"C(7^酶除外，須-2(TC保存)和-2(TC保存長期保存，在試驗周期的9個月內，在合適保存條件下陽性樣品均能擴增出目的亮帶，而陰性對照無條帶出現。實施例5試劑盒在豬弓形蟲病藥物試驗中的應用1.豬弓形蟲病動物模型的建立將液氮保種的弓形蟲速殖子在小鼠體內連續復甦三代，斷頸法處死小鼠，適量生理鹽水衝洗腹腔，取出洗滌液，適當稀釋後用白細胞計數板計數。豬感染弓形蟲的劑量為1Xl(f個速殖子/頭，腹水以生理鹽水稀釋成2XlS個速殖子/mL，每頭豬感染5mL。2.豬實驗弓形蟲病藥物篩選效果的特異PCR檢測評價由華南農業大學獸醫寄生蟲學研究室碩士研究生廖申權完成豬實驗弓形蟲病藥物篩選的實驗，提供實驗豬的血樣及組織樣品。提取基因組DNA後，用本項研究所建立的529bp特異PCR擴增來檢測各實驗組豬組織及血樣中的弓形蟲DNA。將試驗豬隨機分為4組，其中2個藥物治療組、感染不治療組各3頭，空白對照組2頭。試驗觀察期為20天。感染劑量為PYS株速殖子1X107個/頭。試驗分組及給藥方法見表2。表2豬弓形蟲病的治療藥物及給藥方法組別藥物給藥方法給藥劑量給藥時間組一磺胺間甲氧嘧啶十灌胃50mg/Kg.d+感染後2h開始給乙胺嘧啶+TMP2.5mg/Kg.d+藥，連給5天，lOmg/Kg.d每天2次組二複方磺胺甲噁唑+灌胃50mg/Kg.d+同上乙醯螺旋黴素20mg/Kg.d陽艦照is生理鹽水灌胃0.2raL/只同上空白對照i且生理鹽水灌胃0.2mL/只同上試驗前後每頭豬血樣分兩份保存(抗凝與非抗凝血)，於感染後6、11、21天各組隨機宰殺1頭豬，宰殺前每頭試驗豬進行前腔靜脈採血，血液分兩份保存。然後取剖殺豬的腹水、肝臟、肺臟、肺門淋巴結、心臟、脾臟、腸繫膜淋巴結凍存。取凍存臟器的邊緣各0.01g提取DNA。3.豬全血DNA的提取血液與0.5M/LEDTA的抗凝劑以1:9抗凝。血液樣品DNA的提取採用酚-氯仿法，具體步驟如下(1)取lmL抗凝血置於2邁L離心管中，4°C，3000rpm，離心20min，去除血漿。(2)往沉澱的血細胞中加入3倍體積左右的紅細胞裂解液，4°C，3000rpm，離心10min，棄上清。重複一次，若紅細胞去除不理想，可再重複一次，冷的紅細胞裂解液很重要。(3)將沉澱的白細胞中加入lmL白細胞裂解液，混合後加入lOuL蛋白酶K(25mg/mL)，混合後置於5(TC水浴4h以上。(4)經過夜消化後的液體應澄清透亮，加入等體積Tris飽和酚:氯仿(3:1)，充分混勻，4°C，3000rpm，離心10min。(5)小心吸出上層清亮無色液體置於新離心管中，重複上一步驟。(6)吸出第二次抽提後的液體，置於新離心管中，加入2倍體積以上的無水乙醇，充分混合，置於-20。C，3060min，讓DNA沉澱。(7)12000rpm離心10min。(8)手持離心管呈45。角，DNA沉澱面向外，用微量移液器從另一面緊貼管壁輕輕吸出乙醇，不要搖動DNA沉澱。在DNA沉澱回收結果鑑定之前，用另一離心管保存吸出的乙醇。(9)加入70%的乙醇至管中2/3體積，漂洗以除去殘餘的鹽，12000rpm離心2min，棄上清。(10)不蓋管蓋，室溫中放置1015min，使乙醇揮發。(11)重新懸浮DNA在50iiL滅菌蒸餾水或TE中，用微量移液槍反覆吹打DNA沉澱，使其充分溶解。4.豬組織DNA的提取各取感染豬的肺門淋巴結及頜下淋巴結組織約O.Olg，剪碎加DNA裂解液進行消化，37'C作用1224h，其間不時搖動離心管，使病料組織充分裂解。組織樣品DNA的提取採用酚-氯仿法，具體方法和步驟如下(1)將消化過夜的樣品10000rpm離心2min，取上清液到2mL滅菌離心管中，加入500yL滅菌雙蒸水，再加入等體積的Tris飽和酚溶液，緩慢輕柔地將其混勻。(2)12000rpm離心lmin，吸取上層水相到一新離心管中。(3)加入等體積酚/氯仿(1:1)溶液，12000rpm離心lmin，吸取上層水相到一新離心管中。(4)加入等體積氯仿溶液，12000rpm離心lmin，吸上層水相到一新離心管中。(5)加入1/10體積3mol/L的NaAc溶液，至終濃度為0.3mol/L。(6)混勻後，加入準確量的2倍容積無水乙醇，將溶液混勻，置於-20。C3060min，讓DNA沉澱。(7)12000rpm離心10min。(8)手持離心管呈45。角，DNA沉澱面向外，用微量移液器從另一面緊貼管壁輕輕吸出乙醇，不要搖動DNA沉澱。在DNA沉澱回收結果鑑定之前，用另一離心管保存吸出的乙醇。(9)加入70%乙醇至管中2/3體積，漂洗以餘去殘餘的鹽，12000rpm離心2min，棄上清。(10)不蓋管蓋，室溫中放置1015min，使乙醇揮發。(11)重新懸浮DNA在50uL滅菌蒸餾水或TE中，用微量移液槍反覆吹打DNA沉澱，使其充分溶解。5.PCR擴增應用本試劑盒進行PCR擴增，同時設立陽性對照和陰性對照。6.瓊脂糖電泳分析PCR產物在0.8%TBE瓊脂糖凝膠中電泳後，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系統攝像。7.結果與分析人工感染對照豬樣品除心臟外均可擴出弓形蟲特異性529bpDNA片段，而磺胺間甲氧嘧啶+乙胺嘧啶+TMP治療組及複方磺胺甲噁唑+乙醯螺旋黴素治療組則僅從血、肺門中擴出弓形蟲特異性529bpDNA片段，證明這兩種治療方法有一定的治療效果。結果表明本發明的試劑盒可用於實驗弓形病藥物篩選的藥效評價。實施例6試劑盒在豬弓形蟲病臨床病例檢測中的應用1.病料及DNA樣品兩份疑似豬弓形蟲病的病料分別來自廣州番禺和廣州增城兩個豬場。2.病料組織DNA的提取將疑似豬弓形蟲病的病死豬的肺、肺門淋巴結等病料組織，各取約0.01g，剪碎進行消化，病料DNA的提取如前述。3.PCR擴增應用試劑盒對上述抽提的基因組DNA進行PCR擴增，同時做陰性對照和陽性對照。4.瓊脂糖電泳分析PCR產物在0.8%TBE瓊脂糖凝膠中電泳後，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系統攝像。5.擴增產物的DNA序列測定取一個代表性陽性PCR產物分別送廣州拓譜基因技術有限公司和上海博尚生物技術有限公司，用弓形蟲T0X4及T0X5特異引物進行雙向測序。測序結果用DNAstar軟體進行分析，用BLAST進行序列比對。6.結果與分析從兩個病例的肺門淋巴結的DNA樣品均擴增出約530bp的條帶，並且擴增的條帶較清晰。證明了我們所建立的弓形蟲特異PCR方法可用於疑似豬弓形蟲病病料的檢測，並可用於豬弓形蟲病的檢測與流行病學調查。實施例7試劑盒在在犬、貓弓形蟲病檢測中的應用1.犬、貓全血樣品犬血分別採自深圳市瑞鵬寵物醫院和本校獸醫學院動物醫院；貓血採自廣州天河長興路市場。2.犬、貓全血DNA的提取將隨機抽取的不同品種的犬、貓全血，血液與0.5M/LEDTA的抗凝劑以1:9抗凝。血液樣品DNA的提取採用酚-氯仿法，具體步驟如前述。3.PCR擴增應用試劑盒對上述抽提的基因組DNA進行PCR擴增，同時做陽性及陰性對照。4.瓊脂糖電泳分析PCR產物在0.8%TBE瓊脂糖凝膠中電泳後，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系統攝像。5.擴增產物的DNA序列測定取一個代表性陽性PCR產物分別送廣州拓譜基因技術有限公司和上海博尚生物技術有限公司，用弓形蟲T0X4及T0X5特異引物進行雙向測序。測序結果用DNAstar軟體進行分析，用BLAST進行序列比對。6.結果與分析經證實有效的40份犬DNA樣品，用本試劑盒進行了擴增，結果從9個樣品中擴增出弓形蟲529bp特異性片段，並且擴增的條帶較清晰，陽性率達22.5%。對10份貓血DNA樣品，用本試劑盒進行了擴增，結果從l個樣品中擴增出弓形蟲529bp特異性片段，並且擴增的條帶較清晰，陽性率10%。取一個陽性犬和一個陽性貓中擴出的片段經兩家測序公司進行測序，兩家公司所測序列完全一權利要求1、一種動物弓形蟲病PCR檢測試劑盒，其特徵在於它含有(1)DNA裂解液；(2)紅細胞裂解液；(3)白細胞裂解液；(4)PCR反應液；(5)弓形蟲基因DNA陽性對照液。2、根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述DNA裂解液為lOOmM的NaCl、pH8,0的lOmMTris-Cl、pH8.0的25mMEDTA、W/V為W的SDS和4txg/ixL蛋白酶K的混合溶液；所述紅細胞裂解液為10mM的NaCl、pH8.0的10mMTris-Cl禾Q5mM的MgC:U的混合溶液；所述白細胞裂解液為100mM的NaCl、pH8.0的lOmMTris-Cl、pH8.0的lmMEDTA和W/V為0.5%的SDS的混合溶液；所述PCR反應液為終濃度各為200幽的dATP、dTTP、dGTP、dCTP;終濃度各為0.5pmol/uL的引物T0X4、T0X5和2mM的MgCl2的混合溶液。3、根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述引物序列為上遊引物T0X4:5，-CGCTGCAGGGAGGMGACGAMGTTG-3，，下遊引物T0X5:5，-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3，。4、一種權利要求1所述試劑盒的使用方法，其特徵在於包括以下步驟(1)提取血液樣品或組織樣品的DNA;(2)PCR擴增；(3)取擴增後的PCR產物加樣於瓊脂糖凝膠上，電泳後置於紫外透射儀下觀察結果並拍照分析，得出檢測結果。5、根據權利要求4所述試劑盒的使用方法，其特徵在於步驟(1)所述提取血液樣品的DNA為釆用全血樣品與0.5M/LEDTA以1:9的比例混合抗凝，離心去除血漿，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心沉澱白細胞，加入白細胞裂解液裂解白細胞，加入DNA裂解液後水浴，酚-氯仿法提取DNA。6、根據權利要求4所述試劑盒的使用方法，其特徵在於步驟(l)所述提取組織樣品的DNA為剪碎組織樣品，加DNA裂解液，置於溫箱消化過夜，酚-氯仿法提取DNA。7、根據權利要求4所述試劑盒的使用方法，其特徵在於步驟(2)所述PCR擴增是按照擴增樣品數加2後的數目取離心管並標記，向離心管中依次加入滅菌去離子雙蒸水、10Xbuffer、MgCl2、dNTPs，上下遊引物T0X4和T0X5、TaqDNA聚合酶，旋渦振蕩混勻；瞬時離心後，分裝於0.2uL的離心管中，最後加樣品模板DNA或陰、陽性對照；再旋渦振蕩混勻，瞬時離心，置於PCR擴增儀中擴增。8、根據權利要求7所述試劑盒的使用方法，其特徵在於所述TaqDNA聚合酶按每個PCR反應按1.25U加入。9、根據權利要求4所述試劑盒的使用方法，其特徵在於所述PCR擴增的條件為MgW濃度梯度為1.5mM2.5mM、退火溫度為50。C65。C和循環數為3045。10、根據權利要求9所述試劑盒的使用方法，其特徵在於所述PCR擴增的條件為退火溫度為57°C;Mg—的濃度為2.OmM;循環數為38。全文摘要本發明公開了一種動物弓形蟲病PCR檢測試劑盒，它含有DNA裂解液、紅細胞裂解液、白細胞裂解液、PCR反應液、弓形蟲基因DNA陽性對照液，應用弓形蟲的529bp重複DNA片段作為遺傳標記，以特異引物，優化了鎂離子濃度、退火溫度、循環數的調節等PCR反應條件。本發明可快速、特異、靈敏地檢測豬、犬、貓弓形蟲病感染，操作方便、敏感度高，可應用於豬、犬、貓弓形蟲病的診斷和檢測以及實驗弓形蟲病藥物篩選的藥效評價。文檔編號C12Q1/68GK101182571SQ200710032159公開日2008年5月21日申請日期2007年12月6日優先權日2007年12月6日發明者宋慧群,朱興全,林瑞慶,翁亞彪申請人:華南農業大學