生物催化製備(r)－4,4,4－三氟－3－羥基丁酸乙酯的方法
2023-05-26 18:52:31
專利名稱：生物催化製備(r)－4,4,4－三氟－3－羥基丁酸乙酯的方法
技術領域：
生物催化製備(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯的方法，屬於生物不對稱還原製備手性滷代羥基丁酸酯技術領域。
背景技術：
(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯(R)-Ethyl 4，4，4-trifluoro-3-hydroxybutanoate)是一種重要有機合成中間體，是合成抗抑鬱劑單胺氧化酶-A抑制劑貝氟沙通(Befloxatone)的手性切塊，還是生產L-三氟蘇氨酸和D-三氟蘇氨酸的前體。由於4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯易於合成且價格低廉，以其為底物進行不對稱還原反應獲取(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯是非常經濟有效的製備途徑，而且反應產物(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯不易為微生物代謝利用，用微生物活細胞催化方法製備(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯非常有利。
目前所知的從4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯還原為手性醇的方法主要路徑是微生物催化不對稱還原法，即通過完整的微生物細胞(如麵包酵母)的立體選擇性生物催化來實現，但要篩選獲得高立體選擇性的優良微生物菌株比較困難；同時也需要添加輔酶，並不斷供給能量物質，另外還有底物對菌體的毒性及在水溶液中的不穩定性問題。
發明內容
本發明的目的是提供了產高立體選擇性羰基還原酶的微生物，提供了一種新的能有效催化不對稱還原反應製備手性滷代羥基丁酸酯的方法，並利用該類微生物菌株催化4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯不對稱還原，以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度的(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯。
本發明的技術方案以選擇性羰基還原酶產生菌為出發菌株，在單一水相體系中，以4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯為底物，在酶反應過程中補充添加底物，並添加葡萄糖和大孔樹脂，製備(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯，步驟如下(1)菌株葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602、CICC 1023、CICC1328、CICC 1494、CICC 1445、CICC 1625，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240，異常漢遜氏酵母(Saccharomyces Hansenula anomala)AS2300；(2)溼菌體的培養培養基組成以g/L計為醋酸鈉10～100，玉米漿10～100，磷酸二氫鉀1～10，硫酸鎂0.1～1，pH為4～9，溫度20～40℃，培養1～5天，發酵液過濾獲得溼菌體；(3)配製反應體系以4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯為底物，用0.1M，pH 5.0的檸檬酸緩衝液配製成反應體系，底物濃度以g/L計為10～500；(4)酶轉化反應在反應體系中加入溼菌體，加溼菌體量為1～20g/g底物，酶反應溫度為20～50℃，反應時間為1～20小時；在反應過程中補充添加底物，並添加葡萄糖和大孔樹脂，所得的轉化液進行手性氣相色譜分析(GC)測定。
(5)轉化液後處理轉化液過濾或離心分離菌體，清液以乙酸乙酯萃取，吸附樹脂用乙酸乙酯洗脫，合併萃取液和洗脫液，再脫水，脫色，蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯。
產物(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯提取的具體操作為轉化反應結束後，將反應液離心(8,000g×20min，4℃)，上清液用等體積的乙酸乙酯進行萃取三次，吸附樹脂用乙酸乙酯洗脫，合併乙酸乙酯萃取液和洗脫液，再向其中加入1～5％(w/v)的無水硫酸鎂，攪勻後靜置過夜，除去殘餘的水份。將有機相用濾紙過濾，收集有機相。70℃水浴旋轉蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯。取(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯0.05g，溶於乙酸乙酯中，定容至5mL，用GC-MASS進行定性分析，樣品與標準品(Sigma Co.)質譜圖對照，確定為同一物質。
菌株採用葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602，即SW-58，其轉化效果較優。
配製反應體系，或採用在溼菌體培養發酵液中直接添加以g/L計為10～500的4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯為底物。
酶轉化反應，底物起始濃度為10g/L，在反應過程中補充添加底物至500g/L。
在反應過程中添加葡萄糖，其濃度為10-70g/L。
在反應過程中添加大孔樹脂，採用添加樹脂是用來吸附底物、產物，以抑制底物、產物對菌體的毒性。樹脂與底物的質量比為0.6-6∶1，大孔樹脂為DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5大孔吸附樹脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔陰離子樹脂，HD-2、D61、D001、HD-1、D001-CC、D113大孔陽離子樹脂，所述大孔樹脂的孔徑為100～180。上述樹脂均為市獸，如上海華東理工大學華震科技開發公司、南開大學化工廠等產品。
本發明篩選得到的能有效催化不對稱還原反應製備手性滷代羥基丁酸酯的微生物菌株是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602(即SW-58，江南大學生物催化研究室的保藏編號)、CICC 1023、CICC1328、CICC 1494、CICC1445、CICC 1625，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240，異常漢遜氏酵母(Saccharomyces Hansenula anomala)AS2300等，將此菌種移種到含1～10(g/L)，4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯的麥芽汁瓊脂培養基上，20～40℃培養3～7天，檢出在含高濃度4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯培養基上生長的菌落。作為催化不對稱還原反應製備手性滷代羥基丁酸酯的菌株。
含4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯的麥芽汁瓊脂培養基由麥芽粉配成10°Be′的麥芽汁加20g/L的瓊脂製成。斜面培養配製含麥芽粉浸汁50～300g/L，瓊脂10～25g/L，pH6～9的培養基。100～121℃滅菌，20～50分鐘，滅菌後冷卻、製成斜面、接種，20～40℃培養2～7天。
底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯與產物(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯的氣相色譜(GC)測定反應結束後，用適量的乙酸乙酯萃取，無水MgSO4脫水，過濾，加入適量內標物(十六烷)，定容後用GC分析。使用VARIAN3900氣相色譜儀，VARIAN CP WAX 52CB極性色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)，色譜條件為進樣量0.5μL，進樣口250℃，檢測器250℃，流量2.0ml/min，採用程序升溫100℃保留2min，以5℃/min升溫至180℃，保留5min，載氣H2流速30mL/min，尾吹N2流速25mL/min，燃燒氣H2流速30mL/min，空氣流速300mL/min。
產物(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯對映異構體過量值(e.e.)測定採用手性氣相色譜法。手性色譜柱CP-Chirasil Dex CB 25m×0.25mm×0.25μm；色譜條件為10℃保留2min，以2℃/min升溫至140℃保留2min；進樣量0.2μL；柱流速2.0mL/min；載氣H2流速30mL/min，燃燒氣H2流速30mL/min，空氣流速300mL/min，尾吹N2流速25mL/min；進樣口250℃，檢測器250℃，分流比50∶1。
本發明的有益效果本發明篩選獲得了高對映體選擇性的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)等，在單一水相體系中催化不對稱還原4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯生成的(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯對映體過量值達到89％e.e.，在反應體系中添加樹脂，供給能量物質，添加高濃度底物，可以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度，更主要的是在整個反應過程中不需要添加輔酶。
本發明微生物轉化法相對於傳統的化學不對稱合成法、麵包酵母氧化還原方法或用添加輔酶NADH/NAD+的酶催化不對稱還原方法具有以下優點①生成的(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯對映體過量值高，達到89％e.e.；②生物催化劑為微生物菌體，可以自行發酵生產，質量穩定，成本低廉；③在反應體系中添加樹脂，供給能量物質，添加高濃度底物，可以獲得高光學純度、高反應產率、高產物濃度；④在整個反應過程中不需要添加輔酶；⑤反應條件溫和，環境友好。
生物材料樣品說明本發明所用的葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602(即SW-58)、CICC 1023、CICC1328、CICC 1494、CICC 1445、CICC 1625，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240；異常漢遜氏酵母(Saccharomyces Hansenula anomala)AS2300。其中ATCC編號菌種保存於美國模式菌種收集中心，CICC編號菌種保存於中國工業微生物菌種保藏管理中心，AS編號菌種保存中國微生物菌種保藏管理中心。
具體實施例方式
實施例1產羰基還原酶微生物菌株的篩選斜面培養培養基為100mL麥芽汁(含麥芽粉10g)，瓊脂2g，pH 6.0，121℃滅菌20分鐘，滅菌後冷卻接種，菌種為表1所示的各種微生物菌株，28℃培養2天，作為斜面活化種子。
種子培養和發酵醋酸鈉60g/L，玉米漿30g/L，KH2PO46g/L，MgSO4·7H2O1g/L，pH 6.0，裝液量為250mL三角瓶裝液50mL，120℃滅菌20分鐘，滅菌後冷卻接種斜面種子，160r/min的搖床，28℃培養36小時，作為種子或發酵酶液。
發酵酶液中溼菌體量為2.5g/100mL，離心10分鐘(8,000轉/分鐘)收集菌體，用檸檬酸緩衝液(0.1M，pH 5.0)清洗兩次，將菌體轉入25mL含葡萄糖的相同的緩衝液中，使菌體濃度為發酵液中的兩倍，同時加入0.25g底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯，於30℃，160r/min下反應。反應6小時結束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4乾燥過夜，過濾後進行氣相色譜分析(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯含量與對映體過量值，結果如表1。
表1產羰基還原酶微生物菌株的篩選
實施例2添加不同葡萄糖濃度對轉化的影響葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC 26602(SW-58)，按實施例1方法產酶培養36小時後，稱取2g溼菌體加於250mL三角瓶裝50mL 0.1M，pH5.0檸檬酸緩衝液中，含底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯量為0.5g/瓶，分別添加不同濃度的葡萄糖，質量濃度為0g/L，10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L，60g/L，70g/L，於30℃，160r/min下進行轉化反應，反應6小時後結束，測定其產物量及對映體過量值。反應液離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4乾燥，過濾後進行氣相色譜分析(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯含量與對映體過量值，結果如表2。
表2添加不同葡萄糖濃度對轉化的影響
由表2可以看出，添加葡萄糖並不影響產物的對映體過量值，而其產率則隨葡萄糖濃度的增加有所增加。
實施例3不同的菌體量對轉化的影響葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按實施例1方法產酶培養36小時後，發酵酶液中溼菌體量為1.5g/100mL，稱取0.25～2.0g溼菌體加於250mL三角瓶裝0.1M，pH 5.0檸檬酸緩衝液25mL，起始底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯量為0.25g/瓶，於30℃，160r/min下進行轉化反應。6小時後反應結束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4乾燥，過濾後進行氣相色譜分析(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯含量與對映體過量值，結果如表3。
表3不同的菌體量對轉化的影響
由表3可以看出，隨著菌體量的增加，反應的轉化率逐漸上升，而對映體過量值基本沒有變化。
實施例4不同底物濃度對轉化的影響葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按實施例1方法產酶培養36小時後，發酵酶液中溼菌體量為1.5g/100mL，稱取2.0g溼菌體加於250mL三角瓶裝0.1M，pH 5.0檸檬酸緩衝液25mL，起始底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯量為0.13～1.13g/瓶(5～45g/L)，於30℃，160r/min下進行轉化反應。6小時後反應結束，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4乾燥，過濾後進行氣相色譜分析(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯含量與對映體過量值，結果如表4。
表4不同底物濃度對轉化的影響
由表4可知，反應的轉化率隨底物濃度的增加而降低，底物濃度超過30g/L以後，反應的轉化率和對映體過量值均有明顯的下降。
實施例5轉化時間曲線葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按實施例1方法發酵產酶，按實施例2方法進行轉化反應，25mL反應體系中含底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯量為0.6g(24g/L)。於反應不同時間取樣，進行氣相色譜分析(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯含量並計算轉化產率，結果如表5。
表5轉化時間曲線
由表5可知，轉化時間為6h產物濃度最高，對映體過量值不隨轉化時間的增加而變化。
實施例6添加樹脂對轉化的影響葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按實施例1方法產酶培養36小時後，發酵酶液中溼菌體量為1.5g/100mL，稱取2.0g溼菌體加於250mL三角瓶裝0.1M，pH 5.0檸檬酸緩衝液25mL，起始底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯量為0.75g/瓶(30g/L)，反應體系中添加樹脂HPD300，添加量按說明書所述範圍，於30℃，160r/min下進行轉化反應。6小時後反應結束，濾紙過濾，離心除去菌體，得上清液。上清液用乙酸乙酯萃取，適量無水MgSO4乾燥，過濾後進行氣相色譜分析(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯含量與對映體過量值，結果如表6。
表6添加樹脂對轉化的影響
由表6可知，通過在反應體系中添加樹脂HPD300後，轉化後產物濃度有了明顯的提高，並且對映體過量值也有一定的上升。
實施例7用葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)SW-58，按實施例1方法發酵產酶，按實施例5方法進行轉化，起始底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯濃度30g/L，轉化6h反應結束後，將反應液離心(5,000rpm，20min，4℃)，得均一透明的淡黃色上清液300mL，測定(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯的濃度為15.01g/L，上清液用等體積的乙酸乙酯進行萃取三次，合併乙酸乙酯萃取液，再向其中加入1～3％(w/v)的無水硫酸鎂，攪拌後靜置過夜，除去殘餘的水份。將所得有機相用濾紙過濾，收集有機相。80℃水浴旋轉蒸乾溶劑，得無色稠狀產物粗品6.31g，GC分析其純度為71.55％。
粗產品6.31g用矽油浴進行減壓蒸餾，在5～7mmHg條件下，在80～83℃時收集餾分得到(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯產物3.44g，用GC分析含量92.4％，收率70.6％。
取蒸餾產物3.44g在戊烷/乙醚中溶解，於-20℃結晶、重結晶兩次，得精製產物2.82g，用手性GC色譜分析，含量99.2％，對映體過量值達到97.3％e.e.，旋光法測定[α]D24＝+12.40(c＝1.0，CHCl3)，收率88.01％。用GC-MS進行定性分析，與標樣質譜圖對照，確定樣品與標準品為同一物質(圖譜略)。
權利要求
1.生物催化製備(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯的方法，其特徵是以選擇性羰基還原酶產生菌為出發菌株，在單一水相體系中，以4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯為底物，在酶反應過程中補充添加底物，並添加葡萄糖和大孔樹脂，製備(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯，步驟如下(1)菌株葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602、CICC 1023、CICC 1328、CICC 1494、CICC 1445、CICC 1625，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AS2.1429、AS2.23、AS2.146、AS2.240，異常漢遜氏酵母(Saccharomyces Hansenula anomala)AS2300；(2)溼菌體的培養培養基組成以g/L計為醋酸鈉10～100，玉米漿10～100，磷酸二氫鉀1～10，硫酸鎂0.1～1，pH為4～9，溫度20～40℃，培養1～5天，發酵液過濾獲得溼菌體；(3)配製反應體系以4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯為底物，用0.1M，pH 5.0的檸檬酸緩衝液配製成反應體系，底物濃度以g/L計為10～500；(4)酶轉化反應在反應體系中加入溼菌體，加溼菌體量為1～20g/g底物，酶反應溫度為20～50℃，反應時間為1～20小時；在酶反應過程中補充添加底物，並添加葡萄糖和大孔樹脂；(5)轉化液後處理轉化液過濾或離心分離菌體，清液以乙酸乙酯萃取，吸附樹脂用乙酸乙酯洗脫，合併萃取液和洗脫液，再脫水，脫色，蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(R)-4，4，4-三氟-3-羥基丁酸乙酯。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述菌株採用葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)ATCC26602，即SW-58。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述配製反應體系，或採用在溼菌體培養發酵液中直接添加以g/L計為10～500的4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯為底物。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述酶轉化反應，底物4，4，4-三氟乙醯乙酸乙酯起始濃度為10g/L，在反應過程中補充添加底物至500g/L。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述酶轉化反應，在反應過程中添加葡萄糖，其濃度為10～70g/L。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述酶轉化反應，在反應過程中添加大孔樹脂，樹脂與底物的質量比為0.6～6∶1，大孔樹脂為DA201、Hz816、Hz803、AB-8、D4006、HPD300、HPD100A、NAK-II、X-5大孔吸附樹脂，D201GF、D392、D315、D290、D280、D293大孔陰離子樹脂，HD-2、D61、D001、HD-1、D001-CC、D113大孔陽離子樹脂，所述大孔樹脂的孔徑為100～180。
全文摘要
生物催化製備(R)－4，4，4－三氟－3－羥基丁酸乙酯的方法，屬於生物不對稱還原製備手性滷代羥基丁酸酯技術領域。本發明利用篩選並保藏的高對映體選擇性羰基還原酶的產生菌葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)等，在優化條件下發酵產酶，溼菌體在單一水相體系中，以4，4，4－三氟乙醯乙酸乙酯為底物，並添加葡萄糖和大孔樹脂，製備(R)－4，4，4－三氟－3－羥基丁酸乙酯。當底物4，4，4－三氟乙醯乙酸乙酯濃度為30g/L，轉化6h，得到產物(R)－4，4，4－三氟－3－羥基丁酸乙酯濃度26.2g/L、光學純度88.9％e.e、摩爾轉化率87.3％，在整個反應過程中不需要添加輔酶。
文檔編號C12R1/85GK1948499SQ20061008592
公開日2007年4月18日 申請日期2006年5月26日 優先權日2006年5月26日
發明者孫志浩 申請人:江南大學