觸珠蛋白基因與原發性高血壓的相關性的製作方法

2023-05-26 11:31:31 1

專利名稱：觸珠蛋白基因與原發性高血壓的相關性的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地涉及觸珠蛋白基因(haptoglobin，HP)的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其與原發性高血壓的相關性。本發明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術：
高血壓是指收縮壓或舒張壓升高的一組臨床症侯群。血壓的升高與冠心病、腎功能障礙、高血壓心臟病及高血壓並發腦卒中的發生存在明顯的因果關係。高血壓最新的診斷標準是收縮壓≥19kpa(140mmHg)或舒張壓≥12kpa(90mmHg)，符合其中一項者可確診為高血壓。
大多數的高血壓患者在血壓升高早期僅有輕微的自覺症狀，如頭痛、頭暈、失眠、耳鳴、煩燥、工作和學習精力不易集中並容易出現疲勞等。隨著病情的發展，特別是出現併發症時，症狀逐漸增多並明顯，如手指麻木和僵硬、多走路時出現下肢疼痛，或出現頸背部肌肉酸痛緊張感。當出現心慌、氣促、胸悶、心前區疼痛時表明心臟已受累，出現夜間尿頻、多尿、尿液清淡時表明腎臟受累、腎小動脈發生硬化。如果高血壓患者突然出現神志不清、呼吸深沉不規則、大小便失禁等提示可能發生腦出血，如果是逐漸出現一側肢體活動不便、麻木甚至麻痺，應當懷疑是否有腦血栓的形成。
高血壓早期無明顯異常體徵出現。當腦、心、腎等重要器官出現輕度損害時可有異常的體徵出現。常見的心臟異常表現有心尖搏動左移、心前區有抬舉樣搏動感，聽診心尖區第一心音增強、主動脈瓣區第二心音增強且有收縮期雜音和舒張期雜音，表明已發生動脈硬化和左心室肥厚，如果在心尖區聽及奔馬樣心律可能表明有心力衰竭的出現。另外還常見耳垂出現摺痕、毛細血管搏動、橈動脈出現硬脈或無脈及下肢間歇性跛行等。
此外，由於某些誘發因素或高血壓本身的發展，可導致一些高血壓患者血壓顯著或急驟升高，同時伴有腦、心、腎、視網膜等重要器官功能損害，嚴重危及生命，出現一系列臨床特殊徵象，稱為高血壓急症。高血壓急症的發病率佔高血壓人群的5％，常見有高血壓腦病、腦出血、急性左心衰竭、可樂寧急性停藥症候群、急性心肌梗塞、急進型惡性高血壓等。
高血壓患者中約5％左右無自覺症狀，也不知道血壓何時升高，更不知道什麼時候已產生了血管和器官損害的併發症，有些患者甚至在發生了心血管意外之後才知道自己患有高血壓。所以，找出高血壓發病的遺傳原因，及早的進行預防以及檢測，可以有效控制高血壓的發病，將疾病對人體的傷害減到最小。
原發性高血壓(essential hypertension，EH)也叫高血壓病，是一種獨立的疾病，有著自己的病因、發生發展轉歸的規律和臨床表現。臨床上主要表現為動脈血壓的升高。佔人群高血壓患者的90％以上，目前發病機理尚未完全明了，主要依據排除了其他疾病導致的高血壓後才能診斷為原發性高血壓(高血壓病)。動脈血壓的升高主要是因外周小動脈阻力增高所致，同時有不同程度的血容量和心輸出量的增加。晚期常導致心、腦、腎等臟器受累發生高血壓心臟病、心力衰竭、腎功能障礙、腦出血等嚴重併發症。原發性高血壓的治療主要是降低血壓同時防止併發症的發生。原發性高血壓患者致死原因為腦血管意外、心血管意外和腎功能不全，我國以腦血管意外為多見，心力衰竭和尿毒症次之，而歐美國家以心力衰竭多見，腦血管意外和尿毒症次之。
原發性高血壓作為最常見的心血管疾病，其發病率逐年上升，並可引起嚴重的心、腦、腎併發症，是腦卒中和冠心病的主要危險因素。EH是一種由遺傳因素和環境因素相互作用而發病的多基因病，尋找EH相關基因進而闡明高血壓發病的遺傳機制已經成為目前研究的熱點。
雖然已有許多關於各種基因多態性與原發性高血壓的研究，但沒有證實HP基因與原發性高血壓相關性的報導，更沒有證實HP基因的SNP與原發性高血壓相關性的報導。
綜上所述，為了最終實現治療高血壓，本領域迫切需要尋找原發性高血壓易感基因，並開發檢測原發性高血壓的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物。

發明內容
本發明的目的就是提供一種診斷(尤其是早期診斷)高血壓的方法及檢測試劑盒。
本發明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
本發明的再一目的是提供一種治療高血壓的藥物組合物。
在本發明的第一方面，提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的HP基因、轉錄本和/或蛋白，並與正常的HP基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高於正常人群。
在另一優選例中，所述的方法中檢測的是HP的基因或轉錄本，並與正常HP核苷酸序列比較差異。
在另一優選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態性4884位G→C；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
在本發明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在觸珠蛋白基因HP的單核苷酸多態性的方法，包括步驟(a)用HP基因特異性引物擴增樣品的HP基因，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性4884位G→C；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
在另一優選例中，所述的基因特異性引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
在另一優選例中，所述的擴增產物的長度為100-3000bp，且含有SEQ IDNO1中第4884位。
在本發明的第三方面，提供了一種檢測高血壓的試劑盒，它包括特異性擴增HP基因或轉錄本的引物，更佳地，所述的引物擴增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第4884位的擴增產物。
在另一優選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第4884位的突變結合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第4884位的突變限制性內切酶。
在另一優選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態性4884位G→C；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
在本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的HP蛋白以及藥學上可接受的載體。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發現和證明了HP基因的部分SNP與高血壓密切相關，而且發現了它的新功能HP的改變將導致高血壓，其中關聯研究結果顯示，在HP第4884位的SNP(4884位G→C)在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.05)，因此可作為檢測高血壓的特異性SNP。在此基礎上完成了本發明。
HP基因觸珠蛋白也稱為結合珠蛋白，其基因(haptoglobin，HP)的詳細序列可參見登錄號為M69197的核苷酸序列(可參見網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO1所示。
HP基因所編碼的蛋白是一種具有結合Hb蛋白能力的α2-糖蛋白。1982年，Chapelle等人的研究發現HP基因與心肌梗塞的發生有著極強的相關性(Chapelleet al.New Eng.J.Med.307457-463，1982)。通過對496個心肌梗塞病人的HP基因外顯型的分析，他們發現擁有HP2-2型蛋白的病人人數要遠遠超過擁有HP1-1和HP2-1型的病人(p＜0.05)。在血清酶活力的對照比較中，證實HP2-2外顯型的病人的總肌酸激酶、肌酸激酶同工酶MB片段、天冬氨酸轉氨酶和乳酸脫氫酶的活性都顯著性偏高。這些病人的左心室併發症危險性也顯著增高。這個結果說明，基因HP的突變是加重心肌梗塞病症的重要原因，同時也表明HP基因對心血管系統具有相當重要的影響和作用。
2002年，Koda等人在日本人群中發現HP基因的多態性與糖尿病微血管病相關(Koda et al.Diabetologia.45(7)1039-40，2002)。
本發明人對HP基因中的幾乎整個區域進行了測序，發現了許多SNP，其中大部分SNP與高血壓易感性並不相關，然而關聯研究表明4884位G→C卻是與高血壓易感性關聯性非常高的SNP。該SNP位於HP的第5號內含子中，提示對HP的轉錄後的剪接過程有影響，進而導致影響觸珠蛋白的表達，並最終導致攜帶者的高血壓易感性明顯高於正常人群。
基於本發明的新發現，HP蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限於)直接做為藥物治療HP蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用於篩選促進HP蛋白功能的物質，如抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人HP蛋白篩選多肽庫可用於尋找有治療價值的能刺激人HP蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發明還包括對人HP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人HP基因產物或片段。較佳地，指那些能與人HP基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人HP蛋白的分子，也包括那些並不影響人HP蛋白功能的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人HP基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人HP蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。本發明的抗體包括能阻斷人HP蛋白功能的抗體以及不影響人HP蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人HP基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人HP基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗人HP蛋白的抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人HP蛋白的多少和/或突變與否。一種優選的抗HP抗體是不識別正常HP但識別突變HP的抗體，或者識別正常HP但不識別突變HP的抗體。利用這些抗體，可以方便地進行蛋白質水平的高血壓易感性檢測。
利用本發明HP蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與HP蛋白發生相互作用的物質，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明HP蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、靜脈內、或皮下給藥。
正常的HP多肽可直接用於疾病治療，例如，用於高血壓治療。在使用本發明HP蛋白時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明HP蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的HP蛋白或其拮抗劑、激動劑施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
人HP蛋白的多聚核苷酸也可用於多種治療目的。基因治療技術可用於治療由於HP蛋白的無表達或異常/無活性的HP蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。構建攜帶HP基因的重組病毒載體的方法可見於已有文獻(Sambrook，etal.)。另外重組人HP基因可包裝到脂質體中，然後再轉移至細胞內。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
本發明還涉及定量和定位檢測人HP蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括ELISA等。
一種檢測檢測樣品中是否存在HP蛋白的方法是利用HP蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與HP蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在HP蛋白。
HP蛋白的多聚核苷酸可用於HP蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，HP蛋白的多聚核苷酸可用於檢測HP蛋白的表達與否或在疾病狀態下HP蛋白的異常表達。如HP DNA序列可用於對活檢標本的雜交以判斷HP蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用HP蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測HP蛋白的轉錄產物。
檢測HP基因的突變也可用於診斷高血壓。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。HP蛋白突變的形式包括與正常野生型HP DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
最方便的檢測本發明SNP的方法，是通過用HP基因特異性引物擴增樣品的HP基因，得到擴增產物；然後檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性4884位G→C，其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
應理解，在本發明首次揭示了HP基因的SNP與高血壓的相關性之後，本領域技術人員可以方便地設計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產物，然後通過測序等方法確定是否存在4884位G→C。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優選的，但是本領域技術人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發明範圍之內，只要該引物擴增出的擴增產物含有本發明SNP的對應位置。一種優選的引物對具有SEQ ID NO2和3的序列。
雖然擴增產物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產物的長度為100-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產物都應含有SEQ ID NO1中第4884位。
由於本發明的SNP與高血壓具有非常高的關聯性，因此不僅可用於早期較準確地診斷原發性高血壓，而且可以未雨綢繆地使攜帶者在未發病前就採取合理的預防措施(如在飲食上採取相應控制)，從而提高攜帶者的生存期和生存質量，因此具有極其重大的應用價值和社會效益。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例11.1研究對象由於血壓是多基因參與的受多種環境因素影響的數量性狀，必然在分析相關基因時要考慮遺傳異質性的問題。選擇遺傳背景相對比較單一的隔離人群作為研究多基因疾病的材料將有助於降低遺傳異質性的影響，同時由於這些群體具有比較固定的生活環境和較為一致的生活習慣使得環境因素的影響大大降低。選擇這樣的群體，不論是用於連鎖不平衡分析，還是從中選取家系進行家系分析，都有助於提高高血壓易感基因位點的檢測靈敏度。因此在本實施例中選定隔離群體作為研究對象(隔離群體具有遺傳背景的相對一致性，奠基者數目比較少的優點)。
在知情同意的基礎上隨機收集了324個年齡在50歲以上的漢族個體，均來自於安徽省嶽西縣大別山響腸鎮。80％的個體只有6個姓，奠基者數目應該比較少，並且同一性別的個體來自於同一個奠基者。選用的高血壓樣本要求收縮壓不低於140mmHg，舒張壓不低於90mmHg，測量血壓兩次取平均值。
挑選其中的11％位於血壓分布的最頂端(37例個體；SBP＞178mmHg)和有7％位於血壓分布的最底端的(22個個體；SBP＜104mmHg)共59個個體，通過直接測序的方法進行SNP的檢測。
1.2實驗方法和結果1.2.1 DNA提取用常規酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul後，用於常規PCR擴增。
1.2.2 PCR及測序引物的設計根據GenBank中HP的基因組序列，設計和合成以下引物。具體引物如下表1所示。
表1 引物序列表

1.2.3 HP基因的PCR擴增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進行PCR擴增。反應條件為94℃預變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個循環，每個循環退火溫度遞減0.5℃；以後94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個循環；最後72℃延伸7分鐘。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證。
結果，獲得401bp的擴增產物。
1.2.4 SNP的發現和檢測PCR產物經Resin樹脂純化後，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀(美國應用生物系統公司appliedbiosystems(ABI))進行螢光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟體(美國華盛頓大學http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進行序列的判讀和SNP確認。
結果，發現存在以下SNP4884位G→C。
1.2.5 SNP基因分型和關聯分析用直接單向測序法進行SNP基因分型。即在高血壓病人和正常血壓對照組中進行分型和關聯分析。
等位基因的頻率統計出來以後進行卡方檢驗，通過對血壓最高的11％和最低的7％個體數據進行比較，初步確定是否等位基因的頻率和血壓水平連鎖。
結果發現SEQ ID NO1中4884位的G型SNP在高血壓個體中的頻率為4％，而在低血壓人群中的頻率為17％。兩者之間的頻率差為13％，證實了SEQ ID NO1中4884位的G/C型SNP與高血壓的發生存在著相關性。
實施例2原發性高血壓易感性檢測試劑盒如實施例1所述，SEQ ID NO1中4884位G→C的突變與高血壓疾病密切相關。因此，可基於這個突變設計HP基因特異性引物在以病人的DNA為模板進行擴增進行檢測。
製備一試劑盒(100人次)，它含有

抽取待檢測男性病人的血液3ml，使用常規方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1ìmol/ìl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應。PCR產物純化後，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進行螢光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟體進行序列的判讀和SNP確認。
或者，將擴增產物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，也可檢測出4884位G→C。
檢測結果，含4884位G→C的檢測對象的高血壓易感性高於正常人群。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110復旦大學上海人類基因組研究中心120觸珠蛋白基因與原發性高血壓的相關性1300401791603170PatentIn version 3.121012118025212DNA213智人(Homo sapiens)4001tctagaagct gccatcatac tgaaggtaat cttctgaaac ttgcggtttt ctttcaaaaa 60ttatgtttat aagatgatcc atgttcttgc agagtttatt cattttatgc tgtataatat 120tccattatat ccacatacaa tgcagtattg acccttcctc ctgttgatgg gcatttgtct 180tgtttctagt tactttgcta ttatatcagt gtcaccatga ttatccaaaa gtaattcttt 240tgtacactct aatttaagaa caactaaccc tttttaatga ataaatcaac cttgtattga 300gttgctacta agtttcagtt gactagtacc tgggatacac acaggtgcag acatttgact 360gagacatatt gatttttctc atctgcctat ttaggctaat caccagacta taaaaccatg 420agaaccactg ccattgagta tagtctgtgt cagtctacac tatagcttta actagttgtg 480tgatttcttg caaagagcaa tcagagaaga cacaataaac acatttactg atttcaggct 540ggagagcttt taagcaatag ggagatggcc acacacaagg tggagaaaat tactgtgaaa 600aggaagtact ttctttagag ccccacctaa gctaggctgc agaaatgtct acaatgggtt 660tgaaaaaact caaaatgagc ctttctgcag tgtgaaaatc ctccaagata aagagacaga 720ttgatggttc ctgccgccgc cctgtcctgc ccagttgctg atttcaggaa atactttggc 780aggtttgtgg gtcatagagt tgccaggttt cttgggattt gtaatagaac atcacaagaa 840aatcaagtgt gaagcaagag ctcaactctt aacaggggta ttgtttgtgg ttttgttact 900ggaaaagata gtgaccttac cagggccaaa gtttgtagac acaggaatta cgaaatggag 960aagggggaga agtgagctag tggcagcata aaaagaccag cagatgcccc acagcactgc1020tcttccagag gcaagaccaa ccaagatgag gtgggtccac agctttccct cctgcctttc1080ctctggttct ttatttcagt cttttttgca tacatcggta gagatgcaga aatagaacaa1140agaaacgggc aaatgggcta aattatagtg aaccaaaggg cttagtgtgt taaatcttct1200ccttttctgc atccatagaa gacagtgctg ctgtctttcc caggagataa gatttactct1260caggagtgtc tttttccttc aggttacatt tttgacttta tagggtatgt catcagctcc1320cgtggtaggc ttcctggcat cctgagtata tttattagca gatattttcc tctttaaaaa1380tgtacaataa ggaagactaa tagtaacaca tttgaatgac acaattaatt gactagtacc1440tgggatacac actaatacct gggatacatc taattaaggc acttagatct tataaaaata1500aacacttttt gaaatgttga aataataaga ctagaaactt tttttttttt tgagatggag1560tctcgctttg tcaccaggct gcagtgcagt ggcatgatct cggctcactg caacctccac1620ctcccaggtt caagtgattc tcctgcctca gcctcccagg tagctgggac tacaggcgtg1680cgccactatg cccacctaat ttttgtattt ttagtagaga cgggctttca ccatgttggc1740caggatgacc tcgatctctt gacctcgtga tctgcctgcc ttggcctccc aaagtgctgg1800
gattacaggc atgagccacc gtgtctggcc tagaaactat tttaatagaa gcaagtagtg1860cccgaatggt tggcatttgt tagtgagatg gtgaactggc agacggcacc tgtgggtcaa1920tgcccatggc caccgtcctg cttttggaca ccagttctct tccaggtaac cttctggcat1980tttggggttt cagataccat ttcctaaagg tgaattatta taaaatacta gaaataccca2040cgtgtttaaa attatatatt taaggaacct tttattacgg aaaatatcaa gaagtagagg2100aatagcacag taagcccaaa gttcccatct ctgagttatc tacattttat taccactatc2160tttgcggtgt ctgagggagg tttctctttc ctggagggct cctgtattat tgccaatgta2220ctttcctgaa tgcagccaga aactgagccc acccctccac ctatgtgcct ttctatccct2280ctctgaagct tctgcagaat tcccagcagg acagggcttg ctggaagctt ggtatgctca2340gaagctgcta aagtgtgtat gggcaggtgt gggggcaatt tcttggtcct agcacttcca2400tatatcgact ttcttttctg gctgctaagt gggaggagtg tgtgtgtatg catgtgtgtg2460tgtgtgtgtg tacatgcatg tgtgtgtgga tgcatgcatg tgctgtgaag cagggagact2520agctttccac tcctccttgt cttctctctg cagtgccctg ggagctgtca ttgccctcct2580gctctgggga cagctttttg cagtggactc aggcaatgat gtcacggata tcgcaggtca2640gtctttggtt gggtaggagt gtgcatccca ctctgaccct ctcgggtctg cactctctct2700gagaacaccc aattccccct tcttatctcg acctctgggc tttcaggacc ataaagaaca2760ttggggttcc tgccagaaat gaggggagct tgcctttcca ttggcttcta ttcggggtgg2820aaggagattg atgtgcagag cagctcccgc tcatctgact tttcacggtt cactgggaac2880aatttccaaa tagcaaactc tctggcttct ctctctttgc agatgacggc tgcccgaagc2940cccccgagat tgcacatggc tatgtggagc actcggttcg ctaccagtgt aagaactact3000acaaactgcg cacagaagga gatggtaaga tgtggacaac tgtctccatg ccctacatac3060aacccccttc tctgacattt ccatgatggg tggtgctgag gtgattcgcc agaaagttcg3120ttgctctcct tggagccagg agatttagat tctaataagc gttttgtcgc cagtagccat3180ggccctttgg gcagactaac ttttgtcagc ctcaagtttt ctgttttgtt aaggggaggc3240gatgccatgc agcctacctc atgtaaatct cagagtcaga tttacatctc cagcagatgt3300gggaaaagaa ggaatgctga tgatgatgtc accctcacct agtgagtctt gctgtcctgg3360cactgctcta agggctttat acttatttgc tcacttagtc ctcacagtat ccctctgaac3420agagtttatt gttttcactt tgctgataag gaaactgagg cacagacagg ttgagtatct3480tgcccaaatt caggcagcct gtaagaggca gagtcaggat ttgaaccctg agccctccct3540gtactgcttg gctgtgaccg ccatgaccac agtgtgttct gctgggctta actggtgtcc3600aggcacttgg cttccagcac agcactcttt cccttcctcc ttctcatatt ctctctcctt3660tctcccttcc tgtctgcctc ctttcttctt cttcttttta attcttctcc ttaaatgcct3720tctcactctg ctctgggtgc agacttgact tttcctttgg ctcatttctt gccttttgtt3780tcaggagtat acaccttaaa tgataagaag cagtggataa ataaggctgt tggagataaa3840cttcctgaat gtgaagcagg tgggtgctga gcactgagca cttaagagag caggcaggcg3900tccagcgggg aacgtcctag aggcacagcc ttccagtgcg gcttcctctg agcacacaag3960agccaggagg agggatgtgg gagaaccgca gctggccagg gagagactta agcagttagg4020tgatgactcc ctaagggtca ccaagggtct tgttcattgg ggcctgaagg gcactggctg4080aatccactgt cggcactgcc cacagatcag gagagcctgt gcatacagag agcctgctag4140aaagccctgg gtctaaggag aagcaagctc cagggagaac aagtcaagga atgacataaa4200atcttaatcc atggaagcct agcaggaggc tggacatggg ctggaactcc tgcttctcgt4260tattaggagg agctgttgct ctctcctttc attctcagaa ccagaggcaa agacccagcc4320tcttctgctc ttactggtgt ggaaatgcca acctgcctcg tattaactgc accatctaca4380aaatctgagc tccagccagt gctgctctag attcatcttt ctttagagag aatgaattat4440tgtagcccct agccctttca atgaatttca gggaattgtg gaaattcctt tattgggata4500attgtttaaa tataatacag ttcgcgagct tctattcggg gtggaaggag attgatgtgc4560agagcagctc ccgctcatct gacttttcac ggttcactgg gaacaatttc caaatagcaa4620actctctggc ttctctctct ttgcagatga cggctgcccg aagccccccg agattgcaca4680tggctatgtg gagcactcgg ttcgctacca gtgtaagaac tactacaaac tgcgcacaga4740
aggagatggt aagatgtgga caactgtctc catgccctac atacaacccc cttctctgac4800atttccatga tgggtggtgc tgaggtgatt cgccagaaag ttcgttgctc tccttggagc4860caggagattt agattctaat aagggttttg tcgccagtag ccatggccct ttgggcagac4920taacttttgt cagcctcaag ttttctgttt tgttaagggg aggcgatgcc atgcagccta4980cctcatgtaa atctcagagt cagatttaca tctccagcag atgtgggaaa agaaggaatg5040ctgatgatga tgtcaccctc acctagtgag tcttgctgtc ctggcactgc tctaagggct5100ttatacttat ttgctcactt agtcctcaca gtatccctct gaacagagtt tattgttttc5160actttgctga taaggaaact gaggcacaga caggttgagt atcttgccca aattcaggca5220gcctgtaaga ggcagagtca ggatttgaac cctgagccct ccctgtactg cttggctgtg5280accgccatga ccacagtgtg ttctgctggg cttaactggc atccaggcac ttggcttcca5340gcacagcact ctttcccttc ctccttctca tatactctct ccttttcccc ttcctttttg5400tccccttttc ctcttccttt tagttcttct ctttaaatgc cttctcactc tgcacggggt5460ctagacttga cttctccttt ggctcacttc ttgccttttg tttcaggagt gtacacctta5520aacaatgaga agcagtggat aaataaggct gttggagata aacttcctga atgtgaagca5580ggtgggtgct gagcacttaa gagagcaggc aggcgtccag cggggaacgt cctagaggca5640cagccttcca gtgcggcttc ctctgagcac acaagagcca ggaggaggga tgtgggagaa5700ccgcagctgg ccagggagag acttaagcag ttaggtgatg actccctaag ggtcaccaag5760ggtcttgttc attagggcct gaagggcact ggctgaatcc attgtctaca tcgcccacag5820attaggagag cctgtgcata cagagagcct gctagagagc cctgggtcta aggagaagca5880agctccaggg agaacaagtc aaggaatgac ataaaatctt aatccatgga agcctagcag5940gaggctggac atgggctgga actcctgctt ctcgttatta ggaggagctg ttgctctctc6000ctttcattct cagaacaaga ggcaaaggcc cagcctcttc tgctcttact ggtgtggaaa6060tgccaacctg cctcgtatta actgcaccat ctacaaaatc tgagctccag ccagtgctgc6120tctagattca tctttcttta gagagaatga attattgtag cccctagccc tttcaatgaa6180tttcagggaa ttgtggaaat tcctttattg ggataattgt ttaaatataa tacagttcac6240cagccagggc tcaaaaatct cagtatttcc cacttccttt gttagaaaag tgggaaatag6300agctttttgt aatgtaaaca atttaaaaaa cagaattatt ttaaaactgc aactattgga6360aatgagatca gcaggtggta agggcaaagc atttaaatct ttctacttta cgcagcagtg6420acagccgccc atgctttcac ccctttctca gatggaaagg ctcttgcaca tttccactca6480cgagtgtctt gctctccttg acagtatgtg ggaagcccaa gaatccggca aacccagtgc6540agcggatcct gggtggacac ctggatgcca aaggcagctt tccctggcag gctaagatgg6600tttcccacca taatctcacc acaggtgcca cgctgatcaa tgaacaatgg ctgctgacca6660cggctaaaaa tctcttcctg aaccattcag aaaatgcaac agcgaaagac attgccccta6720ctttaacact ctatgtgggg aaaaagcagc ttgtagagat tgagaaggtt gttctacacc6780ctaactactc ccaggtagat attgggctca tcaaactcaa acagaaggtg tctgttaatg6840agagagtgat gcccatctgc ctaccttcaa aggattatgc agaagtaggg cgtgtgggtt6900atgtttctgg ctgggggcga aatgccaatt ttaaatttac tgaccatctg aagtatgtca6960tgctgcctgt ggctgaccaa gaccaatgca taaggcatta tgaaggcagc acagtccccg7020aaaagaagac accgaagagc cctgtagggg tgcagcccat actgaatgaa cacaccttct7080gtgctggcat gtctaagtac caagaagaca cctgctatgg cgatgcgggc agtgcctttg7140ccgttcacga cctggaggag gacacctggt atgcgactgg gatcttaagc tttgataaga7200gctgtgctgt ggctgagtat ggtgtgtatg tgaaggtgac ttccatccag gactgggttc7260agaagaccat agctgagaac taatgcaagg ctggccggaa gcccttgcct gaaagcaaga7320tttcagcctg gaagagggca aagtggacgg gagtggacag gagtggatgc gataagatgt7380ggtttgaagc tgatgggtgc cagccctgca ttgctgagtc aatcaataaa gagctttctt7440ttgacccatt tctgtgttgt gttcagtctt gagtcttttt tatttgctcc tttatggtcc7500agggtagtca gaaggtatag agtctactgg gagtatggca gaaaacaccc taaacccact7560ggaaatcccg aaggtgatac aaactcttcc accttaggga atcatgctca ctgattgagt7620gcctattgaa tgctaggtcc cagaaagtta actgttgtcc ttgttttaca gacaaggaaa7680
cagagactca gagatggtaa gtgagttgct taaggttaca tagctatgaa acagggaagc7740agaactttga acccaggtct gtttgataca aactcagagg tcctttcact gcatgctgtt7800gcctcctcaa agtgaattag gagaaaaggc atgggcctgg ttgaggaaga ggctagctca7860aaatgggatg gggaaaaagt gttttaacac agacagtaat tcagagtttg ggatctaacc7920taccagcact ccagaaaaca aaagacaatg atgtaaaggc aggatctctg gacttactga7980gtccaaatca cagaatggcc cataaatttg ctaggtaatt taggt8025210221120212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4002tcggttcgct accagtgtaa20210321120212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4003ccttagagca gtgccaggac20
權利要求
1.一種體外檢測樣品是否存在觸珠蛋白基因HP的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，包括步驟(a)用HP基因特異性引物擴增樣品的HP基因，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性4884位G→C；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的基因特異性引物具有SEQID NO2和3的序列。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的擴增產物的長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第4884位。
4.一種檢測高血壓的試劑盒，其特徵在於，它包括特異性擴增HP基因或轉錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第4884位的擴增產物。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第4884位的突變結合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第4884位的突變限制性內切酶。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述的突變是以下的單核苷酸多態性4884位G→C；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
7.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述的引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
8.一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，其特徵在於，它包括步驟檢測該個體的HP基因、轉錄本和/或蛋白，並與正常的HP基因、轉錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高於正常人群。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，檢測的是HP的基因或轉錄本，並與正常HP核苷酸序列比較差異。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述的差異是以下的單核苷酸多態性4884位G→C；其中，核苷酸位置編號基於SEQ ID NO1。
全文摘要
本發明公開了一種檢測原發性高血壓易感性的方法，它包括檢測個體的觸珠蛋白基因HP、轉錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患原發性高血壓的可能性大於正常人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1661063SQ20041001654
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月25日 優先權日2004年2月25日
發明者金力, 黃薇, 姜正文, 王穎, 張晨輝, 李豔平, 王志敏, 肖君華, 盧大儒 申請人:復旦大學, 上海人類基因組研究中心