採用免疫細胞源性的微小rna評估生殖障礙患者的方法與組合物的製作方法

2023-05-26 06:18:16

採用免疫細胞源性的微小rna評估生殖障礙患者的方法與組合物的製作方法【專利摘要】本發明涉及方法和組合物，所述方法和組合物用於在介入之前或之後收集免疫細胞(優選外周血單核細胞(PBMC))，從所述細胞提取含微小RNA的RNA，對所提取的RNA中的微小RNA定量，測定在統計學足夠數量的患者樣品中顯示雙峰性反應的一種或多種微小RNA。然後，優選將患者根據其反應分為不同組。【專利說明】採用免疫細胞源性的微小RNA評估生殖障礙患者的方法與組合物發明領域[0001]本公開一般涉及免疫學，更具體地涉及採用一種或多種微小RNA序列的表達模式來表徵個體或個體的組的方法和組合物。[0002]發明背景[0003]醫師面臨著診斷和治療決定。需要將患者歸入診斷和治療組來做出這些決定。醫師可利用多種手段做出此類決定。然而，沒有哪種單一門類的方法有普遍成功性。對用於將患者分為診斷類和治療類的新方法存在持續需求。[0004]已發現稱作微小RNA的一類調節性RNA短分子對於mRNA後續翻譯成基因產物具有顯著影響。真核細胞中發現的核糖核酸的短單鏈聚合物具有轉錄後作用，與信使RNA轉錄本上的基本互補序列結合。調節作用通常通過翻譯阻遏(translat1nalrepress1n)、mRNA降解和基因沉默。MorozovaN.,ZinovyevA.,NonneN.,PritchardL.-L.,GorbanA.N.和Harel-BellanA.(2012年9月)."KineticsignaturesofmicroRNAmodesofact1n(微小RNA作用模式的動態籤名)〃.RNA18(9):1635-1655)。與多細胞動物中的靶mRNA的互補性是不完全的，但通常涵蓋包含鹼基2-7的序列，「種子序列」。這導致的低嚴謹性需求使miRNA能夠靶向多於單一的mRNA。可在整個基因組的多個優選位點找到初級miRNA(Pr1-miRNA)序列。部分地,它們的定位指導其選擇性轉錄。發現其多在基因間區域或與相鄰調控基因(neighboring-regulatedgene)反義。("KineticsignaturesofmicroRNAmodesofact1n(微小RNA作用模式的動態籤名)〃.RNA18(9):1635-1655。LeeY,KimM,HanJ,YeomKH,LeeS,BaekSH,KimVN(2004年10月)."MicroRNAgenesaretranscribedbyRNApolymeraseII(微小RNA基因由RNA聚合酶II轉錄)〃.EMBOJ.23(20):4051-60.)。[0005]微小RNA還可與靶mRNA—同轉錄從而允許所述微小RNA和所述靶蛋白編碼基因的聯合調控。Mraz,M.；Dolezalova,D.；Plevova,K.；StanoKozubik,K.；Mayerova,V.；Cerna,K.；Musilova,K.；Tichy,B.等.(2012).〃MicroRNA_650express1nisinfluencedbyimmunoglobulingenerearrangementandaffectstheb1logyofchroniclymphocyticIeukemia(微小RNA-650表達受免疫球蛋白基因重排的影響並影響慢性淋巴細胞性白血病生物學)〃.Bloodll9(9):2110-2113.)。其大部分位於內含子序列內、蛋白質編碼轉錄本和非蛋白質編碼轉錄本內，以及非蛋白質編碼轉錄本的外顯子內。(RodriguezA,Griffiths-JonesS，AshurstJL,BradleyA(2004年10月)."Identificat1nofmammalianmicroRNAhostgenesandtranscript1nunits(哺乳動物微小RNA宿主基因和轉錄單兀的鑑定)〃.GenomeRes.14(1A):1902-10.)。協同調節也可通過通用啟動子序列的應用來施行(coordinateregulat1n)。(LeeY,KimM,HanJ,YeomKH,LeeS,BaekSH,KimVN(2004年10月)."MicroRNAgenesaretranscribedbyRNApolymeraseII(微小RNA基因由RNA聚合酶II轉錄)".EMBOJ.23(20):4051-60.)。(AltuviaY,LandgrafP,LithwickG,ElefantN,PfefferS，AravinA,BrownsteinMJ,TuschlT,MargalitH(2005)."Clusteringandconservat1npatternsofhumanmicroRNAs(人微小RNA的成族和保守模式)〃.NucleicAcidsRes.33(8):2697-706.)。[0006]微小RNA的表達可以是生物體範圍(organism-wide)的基因調節或器官局限性的(organ-limited)基因調節。基於血眾或血清的試驗已成為吸引人的研究領域。一個示例是微小RNA以多種不同的抗RNA酶形式釋放進入血漿，這些抗RNA酶形式允許通過外周血米集物來對其進行檢測。(Mitchell等，CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetect1n(循環微小RNA作為穩定的基於血液的標誌物供於癌症檢測),PNAS(2008)105(30):10513-10518。VishnuSwarup,M.R.Rajeswari,Circulating(cell-free)nucleicacids-Apromising,non-1nvasivetoolforearlydetect1nofseveralhumandiseases(循環(無細胞)核酸一供於數種人類疾病的早期檢測的有前景的非侵入性手段)，FEBSLetters581(2007)795-799.)。胎盤微小RNA表達可用作示例來說明對於器官局限性的基因調節的活躍研究的領域。(ChimSSC,Detect1nandCharacterizat1nofPlacentalMicroRNAsinMaternalPlasma(母方血眾中胎盤微小RNA的檢測與表徵)，ClinicalChemistry,(2008)54(3):482-490.)。研究者希望對妊娠相關疾病的「胎盤相關的」微小RNA進行表徵和定量。(GiladS，MeiriE,YogevY,BenjaminS,LebanonyD等.(2008)SerumMicroRNAsArePromisingNovelB1markers(血清微小RNA是有前景的新型生物標誌物).PLoS0NE3(9):e3148.do1:10.1371/journal,pone.0003148。MiuraK,Identificat1nofPregnancy-AssociatedMicroRNAsinMaternalPlasma(母方血眾中妊娠相關微小RNA的鑑定)，ClinicalChemistry(2010)56(11):1767-1771.)。[0007]儘管血清和血漿包含釋放的器官特異性和組織特異性微小RNA，血液中循環細胞中存在的微小RNA仍組成並徹底分隔並可檢測地匯集。此類細胞物質組成免疫系統的部分。檢測血源性細胞的微小RNA組成提供對免疫功能的了解。血源性細胞組成物如淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞或其它不同群體的分離允許進一步了解這些不同組成物的行為及相關生物學。基於表面和其它區別性標誌物對血源性細胞組成物(具體但不限於淋巴細胞)的進一步分離允許進一步表徵。[0008]探究血源性細胞的微小RNA表達的實用性在對不同種類炎症相關的以及對治療的響應程度或缺乏響應相關的微小RNA模式化量變的鑑定中得以清楚展示。Tang等對外周血單核細胞(PBMC)檢測了微小RNA-146a。他們發現紅斑狼瘡(SLE)患者的PBMC中該微小RNA表達不足。(TangY等，MicroRNA_146aContributestoAbnormalActivat1noftheTypeIInterferonPathwayinHumanLupusbyTargetingtheKeySignalingProteins(微小RNA-146a通過靶向關鍵信號轉導蛋白質導致人類狼瘡中I型幹擾素通路的異常活性)，ArthritisandRheumatism,(2009)60(4):1065-1075.)。已顯不Mir-146a是先天免疫功能的重要調節物，I型幹擾素(IFNI)的負調節物。(TaganovKD,BoldinMP,ChangKJ,BaltimoreD.NF_』B-dependentinduct1nofmicroRNAmiR-146,aninhibitortargetedtosignalingproteinsofinnateimmuneresponses(革巴向先天免疫應答的信號轉導蛋白的抑制劑，微小RNAmiR-146的NF-』B-依賴性誘導).ProcNatlAcadSciUSA2006；103:12481-6.)。因此，對血液細胞的檢測，尤其是對PBMC的檢測提供的信息不同於對血清或血漿的相應檢測。[0009]血漿/血清或細胞組成物中的血液標誌物在臨床實踐中的應用已充分確立。臨床醫師必須根據合適的分級應答來響應患者護理問題，可以是預防型或者是病理型。臨床醫師必須得出臨床問題並確定最合適的診斷和治療方法。若認為某一具體治療是必需的，則必須預計所選療法的功效並就進一步評估以及最終對預後做出合適的判斷。公認治療可能會是高成本、不方便、不適且具有風險的。此外，缺乏治療可能涉及成本、不適和風險。因此，在治療性介入之前必須進行合適水平的評估。介入本身被評估為應答的組成部分，其可進一步容許診斷評估和預後。[0010]對免疫系統優選外周血中細胞內所選微小RNA的定量具有優於傳統診斷形式的某些優勢。通過選擇已表徵的微小RNA標誌物，能夠評估通過其它臨床可用手段不易確定或無法實際確定的病理學機制。此類技術目前正在研究中。[0011]目前理解微小RNA對於mRNA翻譯成其最終蛋白質產物具有重要調節作用。靶向特定mRNA的微小RNA的表達提高使該mRNA向由其編碼的多核苷酸的翻譯減少。對於多細胞動物物種，有大約22個鹼基的微小RNA序列與mRNA中的靶區通常不完全互補。並且，完全互補性局限於所述微小RNA鏈的鹼基2至鹼基7的短序列。該低保真度允許靶向多種mRNA。因此，單一微小RNA的表達可對一群mRNA具有廣泛的調節作用。優勢使包含此類靶序列的mRNA序列的進化累積增加。所述方案的示例涉及miR-144。NRF2是抗氧化反應的中心調節物。NRF2是轉錄因子，其結合某些物質的mRNA中表達的抗氧化反應元件(ARE)，所述物質例如:過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、II期解毒酶NAD(P)H:醌氧化還原酶(NQOl)和穀胱甘肽(GSH)合成酶。NRF2調節這些含ARE基因的表達。miR-144調節NRF2，miR-144表達增加導致NRF2表達減少且抗氧化基因表達減少。(CarolynSangokoya,MarilynJ.Telen和Jen-TsanChi,microRNAmiR_144modulatesoxidativestresstoleranceandassociateswithanemiaseverityinsicklecelldisease(微小RNAmiR-144調節氧化脅迫耐受並與鐮狀細胞疾病的貧血嚴重性相關聯)，Blood2010年11月18日，第116卷，第20號4338-4348.)。[0012]對於考慮採用免疫治療的患者的鑑定是重要的。除生殖障礙以外，已顯現或在研或未來可能研究的大量其它病症可能會獲益於免疫治療。類似地，可應用本發明來評估對於這些病症的免疫治療的療法選擇、給藥和功效。這些病症的示例有:認為炎症部分對發病機理起一定作用的疾病。就不同病症而言，通常提供免疫治療，優選ivig。例如，這些包括同種異基因骨髓移植、慢性淋巴細胞性白血病、普通變異型免疫缺陷病(CVID)(大約150例原發性免疫缺陷(PID)的組，其共有一組特徵(包括血丙種球蛋白過少)，但其具有不同基礎病因)、特發性血小板減少性紫癜、兒科HIV、原發性免疫缺陷、川崎病、慢性炎性脫髓鞘性多發性神經根神經病(CIDP)高抗體受者或ABO不相容供者的腎移植、阿爾茲海默病、孤獨症、毛細血管滲漏症候群、慢性疲勞症候群、艱難梭菌結腸炎、皮肌炎與多肌炎、革氏眼病、格林-巴利症候群、肌肉萎縮症、包涵體肌炎、不育症、蘭伯特-伊頓症候群、紅斑狼瘡、多灶性運動神經病、多發性硬化症、重症肌無力、新生兒同種免疫血小板減少症、細小病毒B19、天皰瘡、輸血後紫癜、腎移植排斥反應、自發性流產/流產、乾燥症候群、僵人症候群、眼陣攣肌陣攣、嚴重膿毒症和危重症成人的敗血性休克[14]、毒性表皮壞死溶離，在慢性淋巴細胞性白血病和多發性骨髓瘤以及各種免疫球蛋白合成非常見缺陷(例如，X-連鎖無丙種球蛋白血症)中，給予IVIG以維持足夠的免疫球蛋白水平以防感染。設想本發明可用於以與就生殖疾病而言所述相似的方式來處理此類病症。[0013]介入的治療性試驗可揭示通過傳統診斷測試無法辨別的疾病、宿主和介入間複雜相互作用的特徵。試驗中已發現靜脈內給予匯集的供者Y球蛋白(IVIg)在廣譜免疫病症的治療中有效。也已對其作用提出相對寬範圍的機制。這些包括抗獨特型抗體介導的自身抗體中和、單核噬細胞系統阻滯、唾酸-Fe受體介導的與樹突細胞的相互作用，其為解釋IVIg給予的多種治療作用所提出的少許機制中的一些。其在試驗發現有響應的多種病症中的功效可能不歸結於單一機制。可能無法從所述疾病進展的臨床表現或實驗室表徵預測響應。差異且可區分的患者特點可能就對介入的患者特異性響應的成型而言具有重要性。對這些治療特異性響應的鑑定可改進患者的選擇與治療的定製。[0014]不育症與妊娠障礙是欲養育家庭的夫妻所面臨的苦惱問題。15%的妊娠發生自發性流產。反覆自發性流產定義為至少三次連續妊娠在孕期24周內流產，這在3-4%女性中發生。此外，被認為不育的夫妻可能經歷未被識別的極早期流產，此時還未經診斷測試證實短時妊娠狀態的存在。還有另一些女性患有妊娠併發症，例如先兆子癇、胎兒宮內發育遲緩(IUGR)、早產、胎膜早破(PROM)和死產。根據近期文獻，已將兒童病症例如氣喘、孤獨症、注意缺陷多動障礙(ADHD)、糖尿病、精神分裂症和妥瑞氏症候群與妊娠相關疾病和妊娠相關疾病的遲發併發症相關聯。[0015]現有眾多文獻將多種此類病症與免疫功能異常相關聯。已顯示免疫介入提高患有免疫病症的女性的生殖成功性,所述免疫病症例如通過體外試驗測定的調節性T細胞低水平、自然殺傷細胞增多和高TNF-α/11-10輔助性T細胞比例。還已顯示免疫治療性介入有助於那些患者的特定亞組。例如，已採用靜脈內給予免疫球蛋白(IVIg)來減少女性亞組的自然殺傷細胞的數量，經體外檢測所述女性中免疫功能有提高。已顯示該免疫治療性介入提高這些女性的生殖成功性。JAMA(1995)273:1933_36HumReprod(1998)13(9):2620-3,AmJReprodImmunol(2002)38(5):312-18，AnnNYAcadSci(2005)1051:743-78。還顯示肝素能降低抗磷脂抗體水平提高的那些人的流產率(SalmonJE,GirardiG.Antiphospholipidantibodiesandpregnancyloss:aninflammatorydisorder(抗憐月旨抗體與妊娠丟失:一種炎性疾病).R印rodImmunol.2008年I月；77(1):51-6.電子公開2007年月5日.綜述.)。先前被認為是「不明的」多種生殖病症可能由免疫學因素所引起。[0016]在包括淋巴細胞、單核細胞(包括其衍生的巨噬細胞和樹突細胞)的免疫細胞中，多種淋巴亞群(或稱作亞組)介導並調節免疫細胞毒性。這些細胞可包括NK細胞、NKT細胞、⑶8T細胞、⑶4T細胞、yδT細胞調節性T細胞和Thl7細胞。已表明此類亞組的活性可能對鑑定患有或有風險患上生殖障礙而可受益於免疫治療的女性群體而言具有特殊重要性。此外，對此類細胞的數量和活性進行定量的試驗已有助於監測所述免疫治療。在臨床環境中，從外周血部分收集上述免疫細胞並評估。[0017]例如，臨床上感興趣的一個領域是T輔助淋巴細胞(⑶3+/⑶4+)。可根據體外刺激之後的細胞因子譜將這些細胞分類為不同亞群，如T輔助I(Thl)細胞或T輔助2(Th2)細胞。T輔助細胞選擇性分泌特定細胞因子簇。例如，Th2細胞產生白介素，IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-1O和IL-13，進而參與針對胞外病原體的體液免疫的發展，但抑制吞噬細胞的若干功能。或者，Thl細胞，產生幹擾素-Y(IFN-Y)、IL-2和腫瘤壞死因子-a(TNF-a)0這些細胞因子參與細胞介導的免疫和吞噬細胞依賴性炎症(Mosmann和Coffman，1989；Romagnani,2000)。[0018]及時用抗凝劑介入能防止這些損失中的許多。臨床上感興趣的另一個領域是補體介導的妊娠丟失。(CohenD,BuurmaA,GoemaereNN,GirardiG,IeCessieS，ScherjonS，BloemenkampKff,deHeerE,BruijnJA,BajemaIM.Classicalcomplementactivat1nasafootprintformurineandhumanantiphospholipidantibody-1nducedfetalloss(典型補體活化作為鼠與人抗磷脂抗體誘導的胎兒損失的標記).(JPathol.(2011):502-511.YuG,SunY,FoersterK,ManuelJ,MolinaH,LevyGA,GorczynskiRM,ClarkDA.LPS-1nducedmurineabort1nsrequireC5butnotC3,andarepreventedbyupregulatingexpress1noftheCD200tolerancesignalingmolecule(LPS誘導的鼠流產需要C5而不是C3,其由上調⑶200耐受信號轉導分子的表達來阻止).AmJReprodImmunol.2008年8月；60(2):135-40.)。[0019]Raghupathy觀察到相較於不明反覆妊娠丟失,正常妊娠中的Th2細胞因子、IL-6和IL-1O的血清水平顯著較高。並且，相較於正常妊娠而言，在反覆妊娠丟失的女性中存在的Thl細胞因子、IFN-Y的血清水平顯著較高(Raghupathy等，1999)。總之，這些觀察結果表明，正常妊娠的女性中存在Th2偏向，而許多女性例如有上述的反覆妊娠丟失史、不明不育史和妊娠併發症史的女性中存在Thl偏向。[0020]AlanBeer解釋說，具有Thl偏向的女性向Th2偏向靠攏的Thl/Th2比例的再平衡可能會幫助其獲得更高的生殖成功性。他提出採用抗TNFa試劑治療此類女性可能導致使Thl/Th2平衡移向Th2偏向。[0021]為鑑定進行抗TNFa治療的候選者，Beer提出可對⑶4表達型T細胞分化為產Thl或Th2分組細胞因子的比例進行體外評估。若患者患有生殖疾病，尤其是具有不明不育和反覆不明流產問題，並且證明其Thl/Th2比例比正常對照患者高，則該患者被認為是抗TNFa治療的候選者。Beer提出對接受治療的患者的Thl/Th2比例進行反覆評估以評估治療功效。他解釋道，有效治療應導致Thl/Th2比例移向Th2偏向。Winger、Reed等人已顯示，預想Thl/Th2比例升高的女性在用抗TNFa治療時確實相比未接受該治療的女性顯示生殖成功性有提高。此外，即使療程在著床之前結束，發現所述療程仍有效。(參考文獻1:EdwardE.Winger,JaneL.Reed,TreatmentwithTumorNecrosisFactorInhibitorsandIntravenousImmunoglobulinImprovesLiveBirthRatesinWomenwithRecurrentSpontaneousAbort1n(用腫瘤壞死因子抑制劑和靜脈內給予免疫球蛋白的治療提高反覆自發性流產女性的活產率)，60(1)，8-16，電子公開:2008年6月28日。參考文獻2:EdwardE.Winger,JaneL.Reed,SherifAshoush,SapnaAhuja,TarekE1-Toukhy,MohamedTaranissi,TreatmentwithAdalimumab(HumiraandIntravenousImmunoglobulinImprovesPregnancyRatesinWomenUndergoingIVF(米用阿達木單抗(Humira)和靜脈內給予免疫球蛋白的治療提高IVF女性的妊娠率)，AmericanJournalofReproductiveImmunology61(2009)113-120))。[0022]Beer的方法收到大量批評意見。Chaouat給出了一種評論，其注意到胚胎著床入子宮內膜是炎性事件。(GerardChaouat,NatalieLedee-Batailie,SylvieDubanchet,SandrineZourbas,OlivierSandra,JacquesMarta,Thl/Th2ParadigminPregnancy:ParadigmLost?,CytokinesinPregnancy/EarlyAbort1n:ReexaminingtheThl/Th2Paradigm(妊娠中的Thl/Th2範式:範式流產？妊娠/早期流產中的細胞因子:重檢Thl/Th2範式),IntArchAllergyTmmunol2004;134:93_119)著床時和著床處的Thl細胞因子主導是該過程的基礎，由此指出Thl/Th2假說中的缺陷。此外，如KwakKim等(USPT0#20040105858)的專利申請所述，抗TNFα治療可使生殖有效性降低。並且，著床位點的Thl/Th2比例的確定可能無法從分離自外周血的淋巴細胞的分析來有效確定。Moffett等提出的另一評論是針對分析外周血細胞的嘗試。他們質疑外周血白細胞的檢查對胎盤內細胞事件不具代表性。(AshleyMoffett,LesleyRegan,PeterBraude,Naturalkillercells,miscarriage,andinfertility(自然殺傷細胞、流產與不育)，BMJ2004；329:1283-5.)他們總結出:1)「子宮NK細胞不同於外周血中循環的那些細胞」，2)「檢測外周血中NK細胞的測試不給出關於子宮NK細胞的有用信息」和3)「很遺憾，針對生殖障礙女性中自然殺傷細胞的新治療的興趣沒有科學支持」。)[0023]對抗磷脂抗體相關的反覆流產的抗凝劑治療也收到批評意見。抗磷脂抗體測試被批評為不可靠並且缺乏標準。(LakosG,FavaloroEJ,HarrisEN,MeroniPL,TincaniA,WongRC,PierangeliSS.1nternat1nalconsensusguidelinesonanticard1lipinandant1-a(2)glycoproteinltesting:AreportfromtheAPLtaskforceatthel3(th)internat1nalcongressonantiphospholipidantibodies(關於抗心憐月旨和抗a(2)糖蛋白I測試的國際共識指南:來自APL任務組第13次國際會議上關於抗磷脂抗體的報告).ArthritisRheum.2011年9月27日.do1:10.1002/art.33349.綜述.)。此外，已表明與抗磷脂抗體症候群相關的流產的實際原因是補體活性增高而非血栓形成活性增高(SalmonJE,GirardiG.TheodoreE.WoodwardAward:antiphospholipidsyndromerevisited:adisorderinitiatedbyinflammat1n(重探抗憐脂症候群:由炎症起始的疾病).TransAmClinClimatolAssoc.2007;118:99-114.)(LynchAM,SalmonJE.Dysregulatedcomplementactivat1nasacommonpathwayofinjuryinpreeclampsiaandotherpregnancycomplicat1ns(調節異常的補體活化是先兆子癇和其它妊娠併發症中損傷的共同通路).Placenta.2010年7月；31(7):561-7.電子公開2010年4月27日.綜述.)。微小RNA標誌物可更好地鑑定對抗凝劑治療充分相應的基礎炎性標誌物。[0024]此外,對胎兒半異體移植(hemial1graft)的母方耐受機制引起被稱為調節性T細胞的另一⑶4T細胞組的相互作用。Jasper等.(MolecularHumanReproduct1n第12卷，第5期301-308頁，2006)對不明不育女性和自然女性的分泌中期子宮內膜組織中調節性T細胞分化的主要調節子FoXP3mRNA水平進行了定量。他們發現，受影響的女性相較於對照而言FoxP3mRNA的水平下降。Winger和Reed發現經歷反覆流產的女性的外周血淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的水平下降(EdwardE.Winger,JaneL.Reed,低水平循環CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞預測具有妊娠障礙史的剛懷孕婦女的流產風險，AmJReprodImmunol.2011年10月；66(4):320-8)。[0025]目前認為Thl7細胞在妊娠的免疫中起作用(ShigeruSaito,AkitoshiNakashima,TomokoShima,MikaIto,Thl/Th2/Thl7andRegulatoryT-CellParadigminPregnancy(妊娠中的Thl/Th2/Thl7和調節T細胞範式)，AmericanJournalofReproductiveImmunology63(2010)601-610)。與調節性T細胞一道，它們似乎協同作用，其影響平衡的方式與所提出的Thl和Th2細胞影響妊娠成功性的方式大致相同。[0026]近期，描述了影響嬰兒出生的各種情況，其中母親在妊娠中或妊娠前後表現有免疫異常。例如，妊娠期間的免疫異常被認為是孤獨症的原因。認為孤獨症是一種譜系障礙，其病原學仍然未知。然而，已提出早期妊娠過程中的免疫學因素。已在受影響兒童中鑑定出Thl/Th2細胞因子譜改變、淋巴細胞數量變化和T細胞有絲分裂原反應的減少。作者表示可能涉及早期妊娠過程中的免疫異常(PaulAshwood,SharifiaWills和JudyVandeWater,Theimmuneresponseinautism:anewfrontierforautismresearch(孤獨症中的免疫應答:孤獨症研究的新領域)，JournalofLeukocyteB1logy.2006；80:1-15)。[0027]關於Thl/Th2假說的爭論還涉及測試與治療的時間。如上所述，Chaouat稱該假說有缺陷並且Th偏向在著床過程中可能並不保持不變。Winger，Reed等顯示在受孕前期評估為Thl/Th2細胞比例升高的患者在用抗TNFa治療時獲得顯著較好的妊娠結果。(WingerEE,ReedJL,AshoushS，El-ToukhyT,AhujaS，TaranissiM.DegreeofTNF-α/IL-1Ocytokineelevat1ncorrelateswithIVFsuccessratesinwomenundergoingtreatmentwithAdalimumab(Humira)andIVIG(TNF-a/IL-1O細胞因子增多程度與接受阿達木單抗(Humira)和IVIG治療的女性的IVF成功率相關).AmJReprodImmunol.2011年6月；65(6):610-8)Winger和Reed還證明在著床過程中評估調節性T細胞也預示妊娠結果。(WingerEE,ReedJL.LowCirculatingCD4(+)CD25(+)Foxp3(+)TRegulatoryCellLevelsPredictMiscarriageRiskinNewlyPregnantWomenwithaHistoryofFailure(低水平循環CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)調節性T細胞預示具有妊娠障礙史的剛懷孕女性的流產風險).AmJReprodImmunol.2011年10月；66(4):320-8.)所用的實驗室參數的性質和時間似乎十分顯著。[0028]此外,Winger和Reed鑑定出一個患者亞組,所述比例的表現不同於預期。治療後Thl/Th2比例偶有升高，而治療功效似乎完好。(WingerEE,ReedJL,AshoushS，El-ToukhyT,AhujaS，TaranissiM.DegreeofTNF-a/IL-1Ocytokineelevat1ncorrelateswithIVFsuccessratesinwomenundergoingtreatmentwithAdalimumab(Humira)andIVIG(TNF-a/IL-1O細胞因子增多程度與接受阿達木單抗(Humira)和IVIG治療的女性的IVF成功率相關).AmJReprodImmunol.2011年6月；65(6):610-8.)。[0029]此外，用於測定Thl/Th2比例的技術需要從外周血分離有活力的單核細胞(PBMC)，在阻斷細胞因子分泌之後對其體外刺激，這一步驟對細胞有些毒性。因此，可能會削弱胞內細胞因子表達的成功誘導，從而測試結果理論上準確性較低。並且，儘管Thl細胞的定量似乎相對可靠，Th2定量受限於其在CD4陽性T細胞中的低普遍性。目前採用的細胞分選可能有些主觀導致不準確結果。因此試驗結果可能會因輕微分選偏差而有變化。因為這些原因和其它原因，需要評估Thl和Th2數量的改進技術。[0030]此外，目前用以評估妊娠風險因素的不同試驗的預測能力對於檢測所有受影響個體而言並不足夠靈敏。極其需要額外的免疫細胞測試參數。例如，目前採用的對自然殺傷細胞的測試有兩種。第一種是對NK細胞定量的表型試驗。表達CD56但不表達CD3的淋巴細胞被定義為是NK細胞並且可通過流式細胞術計數。第二種測試評估NK細胞功能，由此將單核細胞與已知會被NK細胞破壞的經標記細胞一同孵育或共同孵育「靶細胞」，隨後通過流式細胞術檢測並定量。這兩種測試均可用於評估患者的生殖障礙風險，其具有一定成功度。然而，自然殺傷細胞結果正常的一些患者仍持續遭受免疫學基礎的妊娠障礙。[0031]如前所述，調節性T細胞(Treg)是新型且重要的細胞類型，其可協助對許多這些病例進行診斷和評估。已將外周血中這些細胞數量的減少與妊娠丟失尤其在受孕後短時期中的妊娠丟失相關聯。Jasper等對不明不育女性和未受影響女性的分泌中期子宮內膜組織中調節性T細胞分化的主要調節子FoxP3mRNA水平進行了定量(MolecularHumanReproduct1n第12卷，第5期301-308頁，2006)。他們發現,受影響的女性相較於對照而言FoxP3mRNA的水平下降。Winger和Reed發現在發展出早期妊娠損失的妊娠女性中外周血淋巴細胞中的調節性T細胞水平降低，所述細胞由CD4、CD25和FoxP3的同時表達來定義。WingerEE,ReedJL.LowCirculatingCD4(+)/CD25(+)/Foxp3(+)TRegulatoryCellLevelsPredictMiscarriageRiskinNewlyPregnantWomenwithaHistoryofFailure(低水平循環CD4(+)/CD25(+)/Foxp3(+)調節性T細胞預示具有妊娠障礙史的剛懷孕女性的流產風險).AmJReprodImmunol.2011年10月；66(4):320-8.)。[0032]目前採用多種標誌物對調節性T細胞定量，但是，沒有能方便地功能性評估T調節活性的相應試驗。極其需要這種試驗。[0033]除了由現有生殖免疫測定顯示的缺乏靈敏度以外，其還可能受樣品收集運輸條件的影響。NK細胞毒性試驗特別易受影響。在所述試驗中，測試效應細胞活性。預計對於效應細胞的任何脅迫均可減損所測細胞毒活性。經受不住這些影響，靶細胞因其易受細胞毒影響而經受顯著變化。因此，該試驗系統的變異性相當大。也極其需要不受功能試驗變異性影響的試驗系統。[0034]現有功能性試驗進一步受限於其無法檢測功能細胞中間物(intermediary)。調節性T細胞通過許多中間物來發揮其調節活性。現有的對調節性T細胞的數目計數的試驗不對任何中間物進行鑑定或定量。允許對已知中間物進行識別和定量的試驗系統將提供極大改進。[0035]新近，已將⑶4表達型T細胞按其細胞因子分泌譜分入另一個亞組。除Thl和Th2細胞類型以外，已定義調節性T細胞、Th3細胞和Thl7細胞。並且，已描述Th9細胞和濾泡輔助性T細胞(Tfh)。Jasper等評估了黃體期子宮內膜中FoxP3mRNA的相對量，並且顯示具有反覆妊娠丟失史的患者與正常患者相比具有顯著模式差異。相似地，對轉錄調節物的mRNA的定量和將其與對照患者相比較能夠提供信息來支持將患者分類為可進行免疫型治療及隨後的介入治療監測的候選者。[0036]除功能與表型免疫測試的前述缺陷以外，已知其特異度和靈敏度也有限。允許評估多種不同參數以一同提供患者的PBMC狀態的概況或特徵的試驗系統可能會克服單一測試所見的缺陷。現有的測試方法評估患者免疫系統的單一特徵。一起評估多種不同參數的組合方法可能會提高靈敏度和特異度，並且改進對於各自以相同方式影響單一免疫參數的不同形式免疫功能異常的辨別。一種比評估PBMC免疫狀態更寬的方法可對妊娠疾病的診斷和狀態提供更好的信息。理想上，所述方法會區分導致免疫或其它參數共同異常的不同機制。[0037]個體化藥物，如同理解的那樣，利用測試(尤其是DNA或RNA水平的測試)來確定用於個體的最適治療介入，而不是對有特定疾患的全部患者施用單一治療介入。理想上，診斷方案將患者分成不同類別，其中鑑定出有可能響應治療介入的患者。理想上，所述測試方案將鑑定出可能不受益於治療方案的患者，由此免於對不太可能有積極治療響應的那些患者施用高成本治療或具有潛在風險的治療。由於前述缺陷，為目前臨床實踐中實施的免疫學測試鑑定出更可靠和穩定的替代標誌物以及鑑定出炎症和凝結標誌物的替代標誌物將會是有利的。[0038]此外，需要這樣的新型測試:所述測試能夠鑑定出儘管採用傳統測試診斷為疾病陽性但不會獲益於治療的患者。[0039]並且，需要這樣的新型測試:所述測試能夠預測哪些患者將經歷免疫治療的不良副作用。[0040]微小RNA是小型內源性的，大約22個核苷酸鹼基的非蛋白質編碼RNA序列，其主要負性調苄基因表達。已鑑定了人類的數百條這種序列(Lee等，PLoSComputB1l3:e67(2007);0』Driscoll,AnticancerRes26:4271(2006)；Kusenda等,B1medPapMedFacUnivPalackyOlomoucCzechRepubl50:205(2006))。初級轉錄本或「初級微小RNA(pr1-microRNA)」包含一種或多種微小RNA前體，所述前體各自包含在發卡結構中。這些序列最常見於其宿主基因的內含子中(Lee等，PLoSComputB1l3:e67(2007))。發現其還可存在於外顯子和外顯子-內含子的邊界處(Kusenda等，B1medPapMedFacUnivPalackyOlomoucCzechRepubl50:205(2006))。已知這些序列革巴向全部人基因中的至少30%，調整這些基因的表達。最終的短序列通過兩種酶(Drosha酶和Dicer酶)參與的一系列切割由相對較長的RNA初級RNA序列產生。所述最終切割形式納入稱為RISC(RNA誘導的沉默複合體)的複合體中，所述RISC複合體包含催化蛋白如Argonaut蛋白(具體是Ago-2)οJeker和Bluestone(JournalofClinicalImmunology(2010),30:347-357)猜測微小RNA作用以穩定細胞表型，銳化基因表達，協助設定閾值及其它調節功能。微小RNA似乎是細胞生長、分化和凋亡的重要調節物(Lee等，PLoSComputB1l3:e67(2007))。微小RNA在癌症病理學中已有廣泛研究，因為已知其對細胞分化、生長和凋亡具有影響，而在癌症發展中，細胞分化、生長和凋亡各自均是重要細胞事件(Esau和Monia,AdvDrugDeliv.Rev.59:101-114(2007)；Hammond,NatGenet39:582(2007))。癌細胞中的微小RNA譜已是熱門研究領域。獲得的信息提供關於個體細胞的功能狀態的信息。[0041]研究者已發現，癌症分類中微小RNA的全表達似乎比mRNA表達更有用(Eis等.ProcNatlAcadSciUSA102:3627(2005))。新近，多項研究證明微小RNA對於體內穩態和B淋巴細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞和心臟的免疫系統功能的重要性(That等,Science316:604(2007)；Rodriguez等,Science316:608(2007);0，Connell等,ProcNatlAcadSciUSA104:1604(2007);Care等，NatMedl3:613(2007);Taganov等，ProcNatlAcadSciUSA1(2006))。[0042]微小RNA155(mir_155)是微小RNA作用於免疫系統功能以及免疫細胞分化的示例。本文公開的微小RNA均為人源性，mir-155作用以使調節性T細胞中FoxP3的表達穩定。(Foxp3_DependentMicroRNA155ConfersCompetitiveFitnesstoRegulatoryTCellsbyTargetingSOCSlProteinImmunity(Foxp3依賴性微小RNA155通過革巴向SOCSl蛋白免疫來賦予調節性T細胞以競爭能力)，第30卷，第I期，80-91頁L.Lu,T.Thai,D.Calado,A.Chaudhry,M.Kubο,K.Tanaka,G.Loeb,H.Lee,A.Yoshimura,K.Rajewsky)。調節性T細胞對於預防自體免疫和建立外來組織耐受而言極其重要。此外，That等顯示mir-155在調節輔助T細胞分化和生發中心反應中起作用，所述生發中心反應調節T細胞依賴性的抗體反應(That等，Science316:604(2007);Rodriguez等，Science316:608(2007)。此外，微小RNA-155-缺陷型0)4+T細胞的轉錄組(transcriptosome)分析顯示廣譜的受mir-155調苄基因，包括細胞因子、趨化因子和轉錄因子(That等，Science316:604(2007)；Rodriguez等，Science316:608(2007)。[0043]mir-155是微小RNA多向性(pleitropism)的示例。到目前為止的證據顯示mir-155涉及許多生物過程。這些生物過程包括造血作用、炎症和免疫。其還涉及對血管緊張素II受體的調節。已將mir-155的失調與某種癌症、心血管疾病以及病毒感染相關聯。調節性T細胞發育以及對FoxP3作用的介導可能均涉及mir-155(SusanKohlhaas,OliverA.Garden,CherylScudamore,MartinTurner,KlausOkkenhaug,ElenaVigorito,CuttingEdge:TheFoxp3Targetmir-155ContributestotheDevelopmentofRegulatoryTCells(Foxp3革巴標mir-155導致調節性T細胞的發育),TheJournalofImmunology(2009)182:2578-2582)。令人吃驚的是，這些研究者發現儘管Treg發育可能不能缺少bic/mir-155(初級微小RNA)，但其對Treg的外周增殖和存活而言並不是必需的。儘管Treg數量較少，其在體外的抑制劑功能保持完整。此類預料之外的作用是微小RNA的特點。微小RNA可在細胞發育及其後續功能活化的不同時間點發揮作用。儘管微小RNA可單獨作用，其也能在多種微小RNA對單一靶mRNA的協同作用中發揮作用。個體微小RNA也可作用於多種不同靶mRNA，這為微小RNA作用添加了複雜性。總之，這些複雜性使得對其在不同環境下作用的預測很繁瑣。迄今為止，僅經驗主義方法定義了個體和多種微小RNA在特定疾病情況下的作用。[0044]其它微小RNA與免疫應答顯著相關。例如，TNFa和IL_1β還受另一種微小RNA，mir-146a的調節。(K.D.TaganovjM.P.Boldin，K.J.Chang和D.Baltimore,NF-B-dependentinduct1nofthemicroRNAmir—146，aninhibitortargetedtosignalingproteinsofinnateimmuneresponses(革巴向先天免疫應答的信號轉導蛋白的抑制劑，微小RNAmiR-146的NF-B-依賴性誘導)，ProcNatlAcadSciUSA103(2006)，第12481-12486頁，Μ.M.Perry,S.A.MoschosjA.E.Williams,N.J.Shepherd,H.M.Larner-Svensson和M.A.Lindsay,RapidchangesinmicroRNA_146aexpress1nnegativelyregulatetheIL-lbeta-1nducedinflammatoryresponseinhumanlungalveolarepithelialcells(微小RNA-146a表達的快速變化負向調節IL-1β誘導的人肺泡上皮細胞中的炎性反應)，JImmunol180(2008),第5689-5698頁)。對這些微小RNA的定量提供對調節狀態的進一步理解。此外，對類風溼性關節炎患者的研究顯示其PBMC中存在有趣的微小RNA譜。(KalebMPauley,MinoruSatohjAnnieLChan,MichaelRBubbjWestleyHReeves和EdwardKLChan,Upregulatedmir_146aexpress1ninPBMCsfromrheumatoidarthritispatients(類風溼性關節炎患者的PBMC中mir_146a表達上調)，ArthritisResearch&Therapy2008,10:RlOl(do1:10.1186/ar2493)。該文章的網址:http://arthritis-research.com/content/10/4/R101)。他們觀察到mir_146a、mir-155、mir-132、mir-16、mir-let_7a的相對表達顯著高於正常對照，以及活躍和無活躍臨床狀態之間具有顯著差異。Hunter等.(HunterMP，IsmailN，ZhangX，AgudaBDjLeeEJ等.(2008)人外周血微泡中微小RNA表達的檢測.PLoS0NE3(11):e3694.do1:10.1371/journal,pone.0003694)發現外周血中微小RNA周轉於若干區室(compartments)、血眾微泡、血小板和PBMC中。其表明位於不同區室的微小RNA的作用不同。位於PBMC內的微小RNA與CD4表達型T細胞亞族特性和穩定表達最緊密相關。對位於PBMC群內的微小RNA的研究最可能提供關於CD4表達型T細胞的信息。此外，單核細胞系和樹突細胞的細胞及單核細胞，所述兩種外周血單核群之一，調節T細胞尤其是CD4表達型T細胞的功能狀態和活性。重要的是，單核細胞參與在其表面凝結表達組織因子的起始。Mir-19b和mir_20a看來調節狼瘡患者中的組織因子表達(RaiilTeruel,CarlosPerez-Sanchez,JavierCorral,MariaTeresaHerranz,VirginiaPerez-Andreu,Encarnac1nSaiz,NuriaGarcia-Barbera,IreneMartinez-Martinez,VanessaRoldan,VicenteVicente,Lopez-Pedrera,ConstantinoMartinez,Identificat1nofmicroRNAsaspotentialmodulatorsoftissuefactorexpress1ninpatientswithsystemiclupuserythematosusandantiphospholipidsyndrome(作為系統性紅斑狼瘡和抗磷脂症候群患者中組織因子表達的潛在調節劑的微小RNA的鑑定)，JournalofThrombosisandHaemostasis,在編)。因此，對PBMC中微小RNA的整體研究提供關於免疫平衡和循環單核細胞穩定性的重要信息。[0045]對單核細胞亞組的選擇性研究可獲得額外信息。例如，從分離的PBMC移出單核細胞允許對淋巴細胞進行選擇性微小RNA研究。相反，可直接研究單核細胞的微小RNA。此外，可在選擇性分離單核細胞亞群之後對其自身進行單獨研究，所述選擇性分離採用的技術例如:在與螢光標記的單克隆抗體組合相互反應之後進行流式細胞術分選，所述單克隆抗體組合能夠清楚表徵不同個體亞族。例如，可使調節性T細胞在選擇性結合條件下接觸螢光標記的抗⑶3、⑶4、⑶25和⑶127，並通過其⑶3、⑶4、⑶25的表達和⑶127的不表達或低表達來選擇調節性T細胞。[0046]微小RNA提供的信息不同於對淋巴細胞亞組、其功能或這些亞組的標誌物定量所提供的信息，其中所述標誌物可以是這些亞組的替代物，例如FoxP3mRNA可以作為替代物來定量調節性T細胞。微小RNA可在多種不同細胞類型中發現，並且在不同細胞類型中顯示不同功能或可顯示由細胞類型或功能狀態定量無法揭示的活性狀態或其它特徵(例如細胞毒性)。疾病與疾病之間的微小RNA表達的變化不同。類風溼性關節炎中所見微小RNA的變化與狼瘡中觀察到的那些不同。(PauleyKM,SatohM,ChanAL，BubbMR,ReevesWHjChanEK.Upregulatedmir_146aexpress1ninPBMCsfromrheumatoidarthritispatients(類風溼性關節炎患者的PBMC中mir_146a表達上調).ArthritisResTher.2008;10(4):R101，GastroenterolHepatol(NY).2010年11月；6(11):714-722.MicroRNA(microRNA)Express1ninUlcerativeColitis(UC)andCrohnisDisease(CD)(潰瘍性結腸炎(UC)與克羅恩氏病(CD)中微小RNA(microRNA)的表達)，以及DaiY，HuangYSjTangMjLvTYjHuCXjTanYHjXuZMjYinYB.MicroarrayanalysisofmicroRNAexpress1ninperipheralbloodcelIsofsystemiclupuserythematosuspatients(系統性紅斑狼瘡的外周血細胞中微小RNA表達的微陣列分析).Lupus.2007;16(12):939-46.，RaiilTeruel,CarlosPerez-Sanchez,JavierCorral，MariaTeresaHerranz,VirginiaPerez-Andreu,Encarnac1nSaizjNuriaGarcia-Barbera,IreneMartinez-MartinezjVanessaRoldan,VicenteVicente,§haryLopez-Pedrera,ConstantinoMartinez,Identificat1nofmicroRNAsaspotentialmodulatorsoftissuefactorexpress1ninpatientswithsystemiclupuserythematosusandantiphospholipidsyndrome(作為系統性紅斑狼瘡和抗憐脂症候群患者中組織因子表達的可能調節劑的微小RNA的鑑定)，JournalofThrombosisandHaemostasis,在編)。[0047]免疫疾病的多個方面均暗示微小RNA表達的變化。微小RNA對於免疫學功能調節和對自體免疫的預防具有顯著作用(KalebM.Pauley,SeungheeCha和EdwardK.L.Chan,MicroRNAinautoimmunityandautoimmunediseases(自體免疫和自體免疫疾病中的微小RNA)，JAutoimmun.(2009)32(3-4):189-194)。抗磷脂抗體症候群是自體免疫病症的示例，其與生育力下降、反覆不明流產和妊娠併發症以及自體免疫風險增加、心血管疾病和血栓形成疾病相關聯。某些微小RNA(mir-19b和20a)的表達減少可能鑑定患者的妊娠併發症風險增高，所述妊娠併發症可通過抗凝治療來治療(例如，阿司匹林和/或肝素)(RaiilTeruel,CarlosPerez-Sanchez,JavierCorral,MariaTeresaHerranz,VirginiaPerez-Andreu,Encarnac1nSaiz,NuriaGarcia-Barbera,IreneMartinez-Martinez,VanessaRoldan,VicenteVicente,§haryLopez-Pedrera,ConstantinoMartinez,Identificat1nofmicroRNAsaspotentialmodulatorsoftissuefactorexpress1ninpatientswithsystemiclupuserythematosusandantiphospholipidsyndrome(作為系統性紅斑狼瘡和抗憐脂症候群患者中組織因子表達的可能調節劑的微小RNA的鑑定)，JournalofThrombosisandHaemostasis,在編))。[0048]對生殖疾病患者的功能異常狀態的替代檢測法的鑑定，值得一提的是妊娠構成了這樣一種免疫學悖論:在對組織(如組織/器官移植物)產生排斥性的典型同種免疫應答情況下，健康妊娠中對於同種異體抗原的耐受則成功防止對半同種抗原胚胎的排斥。描述了似乎保留同種異體耐受性(allo-tolerance)的多種且看似多餘的機制。這些機制的存在將對於胎兒的同種異體應答(allo-response)和自體免疫區分開來。因此，預計在生殖疾病患者中鑑定的微小RNA譜不太可能與自體免疫患者中鑑定的那些相似。此外，似乎還沒有用微小RNA直接替代現用的免疫、凝結測試，這歸因為其在不同細胞類型中廣泛且多樣的存在。Mishra(美國專利申請20100216142A1,Mishra；Nilamadhab,microRNAB1markersinLupus(狼瘡中的微小RNA生物標誌物))鑑定了在狼瘡中失調的多種微小RNA。狼瘡情況中所見免疫異常中包含針對各種磷酯的抗體和炎性標誌物(如組織因子)水平的升高。Ceribelli的近期研究鑑定了針對Ago2的抗體，Ago2是微小RNA產生所需的RISC部分的組成部分(AngelaCeribelli,AngelaTincani,FrancoFranceschini,RobertoCattaneo,BradA.Pauley,JasonY.F.Chan,EdwardK.L.Chan,Ant1-argonaute2(Ago2/Su)and-Roantibodiesidentifiedbyimmunoprecipitat1ninprimaryant1-phospholipidsyndrome(PAPS)(原發性抗磷脂症候群(PAPS)中通過免疫沉澱法鑑定的抗Argonaute蛋白2(Ago2/Su)和抗Ro抗體)，2010年8月9日電子公開(do1:10.3109/08916934.2010.499886))。靜脈內免疫球蛋白(IVIG)治療是用於降低具有免疫學反覆自發性流產史的女性中流產發生率的免疫治療的一個示例。Winger和Reed已證明IVIG對反覆自發性流產史女性組的功效(相較於未接受IVIG治療的女性組而言)。(WingerEE,ReedJL,AshoushS,El-ToukhyT,AhujaS，TaranissiM.ElevatedPreconcept1nCD56(+)16(+)and/orThl:Th2LevelsPredictBenefitfromIVIGTherapyinSubfertileWomenUndergoingIVF(高水平孕前⑶56(+)16(+)和/或Thl:Th2預示IVIG治療對經歷IVF的低生育力女性的益處).AmJReprodImmunol.2011年5月30日.)。此外,該研究中若將有抗磷脂抗體的患者從患者集中排除，則在治療組和未治療組之間不再發現顯著差異(未公開數據)。因此，當，鑑定有抗磷脂抗體相關標誌物的患者的能力可能在決定誰可受益於免疫學治療時特別有用。[0049]對PBMC及其組成選定亞組中微小RNA的檢測為臨床醫師提供額外手段，將生殖免疫相關疾病患者或有患生殖免疫相關疾病風險的患者表徵為失衡介導的疾病組，例如，免疫細胞活性、炎症或凝結的失衡。Taylor和Gercel-Taylor提出了對於患有妊娠疾病的女性的微小RNA的檢測(Taylor和Gercel-Taylor，於美國專利申請20100151480A1)。他們提出用於診斷對象的癌症和不良妊娠結果的方法，所述方法通過檢測分離自受影響個體的生物樣品的外來體中存在的一種或多種RNA的量來進行。他們提出的方法可與本【
發明內容】區分開。他們提出，他們研究的微小RNA直接源自胎盤組織，因而顯示該器官的病理生理狀態。本公開內容提出用於確定受影響個體的全身性和/或局部免疫狀態的方法，由此為評估可能受其生殖健康狀況的負面影響的個體的免疫狀態提供替代性和補充性方法。此類參數的添加應會提高診斷組的靈敏度。例如，已顯示mir-155對穩定FoxP3的表達很重要，並且對調節性T細胞的效應物功能也重要，部分是通過調節CTLA-4表達(Lu等.1mmunity30,80-91(2009))。假設了在不同時間點誘導母方耐受狀態的許多且冗餘的機制，所述時間點包括卵子發育(卵子發生)期、孕前、受精、著床直至妊娠剩餘時期，以及分娩後。卵子質量也可受免疫學事件的影響。卵子發生涉及細胞因子、激素、生長因子的複雜相互影響，其牽涉免疫細胞相互作用。對免疫細胞中微小RNA的定量可對正常過程進行概況分析並可與生殖疾病或其它免疫相關疾病患者的過程區分開。[0050]微小RNA定量還提供其它益處。若鑑定出對免疫治療的反應模式，其可用於預測按微小RNA譜所鑑定的患者亞組中的反應模式。若鑑定出特定微小RNA或微小RNA的組，則它們在治療後的響應可用對分或多分患者組，可根據對治療的反應評估如此分組的患者並用於更準確地預測如此分組的個體患者的反應。[0051]將患者分成兩組或更多組的能力是重要的。赫賽汀(Herceptin)在治療乳腺癌中的應用在用於臨床上其它方面相似的乳腺癌時可能不顯示成效。赫賽汀(曲妥單抗(trastuzumab))靶向HER2/neu受體。在早期乳腺癌中，該受體的存在與否在臨床上不顯見。然而，當由乳腺癌表達時，其指示一類後期表現更具侵襲性的腫瘤。可採用分子技術來評估腫瘤的HER2/neu狀態。臨床研究顯示，若該藥物僅用於其腫瘤為HER2/neu表達陽性的那些患者，則該藥物顯示有效。對於包含一種或多種個體微小RNA進行微小RNA譜的鑑定可能在將患者分成不同組(這些組在其它方面無法區分)中具有相似重要性，可對這些患者進行評估以確定具有相似藥物反應的個體的組。[0052]本發明實現了這些以及其它目標。[0053]發明概述[0054]根據上述需求以及下文中將被提及和將變得明顯的那些需求，本公開涉及一種基於微小RNA表達來從患者群鑑定至少兩個特徵組的方法，所述方法包括如下步驟:收集免疫細胞、從所述免疫細胞提取包含微小RNA的RNA、對提取RNA中的至少一種微小RNA定量，以及基於所述至少一種微小RNA的表達將所述患者群分成不同組。優選地，所述收集免疫細胞的步驟包括收集外周血單核細胞。[0055]一方面，所述對患者群分組的步驟包括將相對高水平表達所述至少一種微小RNA的患者分配至第一組，並將相對低水平表達所述至少一種微小RNA的患者分配至第二組。免疫細胞的收集可包括在免疫療法治療之前或之後收集細胞。另一個方面涉及在免疫療法治療之前和之後收集細胞，從而對患者群的分組包括測定免疫療法治療之後所述至少一種微小RNA的表達水平變化。優選地，對所述患者群分組包括:將所述表達水平顯示第一變化的患者分配至第一組，並且將所述表達水平顯示第二變化的患者分配至第二組。所述第一變化可以是表達水平的相對較大變化，而所述第二變化可以是表達水平的相對較小變化。或者，所述第一變化可以是表達水平的正向變化，而所述第二變化可以是表達水平的負向變化。[0056]優選地，所述第一組中的所述至少一種微小RNA的表達水平變化的平均值的絕對值除以標準偏差大於或等於I。此外，一個實施方式涉及額外步驟:在所述第一組中鑑定已知微小RNA組內顯示表達水平變化的微小RNA亞組，使所述表達水平變化的平均值的絕對值除以標準偏差大於或等於I。此外，所述方法還可包括如下步驟:在所述第一組中鑑定已知微小RNA組內顯示表達水平最大變化的微小RNA。[0057]本發明的另一個實施方式涉及如下額外步驟:從其它患者收集免疫細胞，從所述其它患者的免疫細胞提取包含微小RNA的RNA，對提取自所述其它患者的RNA中的至少一種微小RNA定量，以及基於所述至少一種微小RNA的表達鑑定所述其它患者屬於所分組中的一組。優選地，這還包括基於所述鑑定結果對所述其它患者給予治療(例如IVIG)。[0058]另一方面中，本發明方法還包括基於所分組中的成員從屬關係診斷患者患有某種病症。一個實施方式涉及診斷患有生殖疾病的患者。[0059]而本發明的另一個方面包括如下額外步驟:監測對屬於所述分組之一的患者的治療，所述監測通過收集免疫細胞、提取至少一種微小RNA並隨後對所述至少一種微小RNA定量來進行。[0060]可用於本公開內容的合適微小RNA的示例包括但不限於:hsa-miR-582-3pMIMAT0004797(SEQIDNO:1)；hsa-miR-7-1-3pMIMAT0004553(SEQIDNO:2)；hsa-miR-340-5pMIMAT0004692(SEQIDNO:3);hsa-miR-199b_3pMIMAT0004563(SEQIDNO:4)；hsa-miR-199a-3pMIMAT0000232(SEQIDNO:5)；hsa-miR-30e-5pMIMAT0000692(SEQIDNO:6)；hsa-miR-575MIMAT0003240(SEQIDNO:7)；hsa-miR-7-5pMIMAT0000252(SEQIDNO:8)；hsa-miR-33a-3pMIMAT0004506(SEQIDNO:9)；hsa-miR-7-2-3pMIMAT0004554(SEQIDNO:10);hsa-miR-199b_5pMIMAT0000263(SEQIDNO:11)；hsa-miR-144-5pMIMAT0004600(SEQIDNO:12)；hsa-miR-30e-3pMIMAT0000693(SEQIDNO:13)；hsa-miR-424-3pMIMAT0004749(SEQIDNO:14)；hsa-miR-33a-5pMIMAT0000091(SEQIDNO:15)；hsa-miR-671-3pMIMAT0004819(SEQIDNO:16)；hsa-miR-340-3pMIMAT0000750(SEQIDNO:17)；hsa-miR-1267MIMAT0005921(SEQIDNO:18)；hsa-miR-1229-3pMIMAT0005584(SEQIDNO:19)；hsa-miR-424-5pMIMAT0001341(SEQIDNO:20);hsa_miR-22l_3pMIMAT0000278(SEQIDNO:21)；hsa-miR-lMIMAT0000416(SEQIDNO:22)；hsa-miR-133bMIMAT0000770(SEQIDNO:23)；hsa-miR-221-5pMIMAT0004568(SEQIDNO:24)；hsa-miR-210MIMAT0000267(SEQIDNO:25)；hsa-miR-1229-5pMIMAT0022942(SEQIDNO:26);hsa-miR-671_5pMIMAT0003880(SEQIDNO:27)；hsa-miR-582-5pMIMAT0003247(SEQIDNO:28)；hsa-miR-199a-5pMIMAT0000231(SEQIDNO:29)；hsa-miR-144-3pMIMAT0000436(SEQIDNO:30)；hsa-miR-376a-5pMIMAT0003386(SEQIDNO:31)；hsa-miR-193a-3pMIMAT0000459(SEQIDNO:32)；hsa-miR-557MIMAT0003221(SEQIDNO:33)；hsa-miR-34a-3pMIMAT0004557(SEQIDNO:34)；hsa-miR-584-5pMIMAT0003249(SEQIDNO:35)；hsa-miR-1244MIMAT0005896(SEQIDNO:36)；hsa-miR-125b-1-3pMIMAT0004592(SEQIDNO:37)；hsa-miR-32-3pMIMAT0004505(SEQIDNO:38)；hsa-miR-933MIMAT0004976(SEQIDNO:39)；hsa-miR-373-5pMIMAT0000725(SEQIDN0:40);hsa_let_7b_5pMIMAT0000063(SEQIDN0:41)；hsa-miR-376a-3pMIMAT0000729(SEQIDNO:42);hsa-miR-129-2_3pMIMAT0004605(SEQIDNO:43)；hsa-miR-548am-3pMIMAT0019076(SEQIDN0:44)；hsa-let-7f-5pMIMAT0000067(SEQIDNO:45)；hsa-miR-876-3pMIMAT0004925(SEQIDN0:46)；hsa-miR-371a-5pMIMAT0004687(SEQIDNO:47);hsa-miR-423_5pMIMAT0004748(SEQIDNO:48)；hsa-miR-373-3pMIMAT0000726(SEQIDNO:49)；hsa-miR-152MIMAT0000438(SEQIDNO:50)；hsa-miR-34a-5pMIMAT0000255(SEQIDNO:51)；hsa-miR-335-5pMIMAT0000765(SEQIDNO:52);hsa_miR-18Ic_5pMIMAT0000258(SEQIDNO:53)；hsa-miR-125b-2-3pMIMAT0004603(SEQIDNO:54)；hsa-miR-548am-5pMIMAT0022740(SEQIDNO:55)；hsa-miR-338-3pMIMAT0000763(SEQIDNO:56)；hsa-miR-1225-5pMIMAT0005572(SEQIDNO:57)；hsa-miR-362-3pMIMAT0004683(SEQIDNO:58)；hsa-miR-767-5pMIMAT0003882(SEQIDNO:59)；hsa-miR-136-3pMIMAT0004606(SEQIDN0:60)；hsa-miR-29b-1-5pMIMAT0004514(SEQIDNO:61)；hsa-miR-29a-3pMIMAT0000086(SEQIDNO:62)；hsa-miR-92b-3pMIMAT0003218(SEQIDNO:63)；hsa-miR-362-5pMIMAT0000705(SEQIDNO:64)；hsa-miR-223-5pMIMAT0004570(SEQIDNO:65)；hsa-miR-505-3pMIMAT0002876(SEQIDNO:66)；hsa-miR-634MIMAT0003304(SEQIDNO:67)；hsa-miR-371a-3pMIMAT0000723(SEQIDNO:68)；hsa-miR-129-1-3pMIMAT0004548(SEQIDNO:69)；hsa-miR-1238-5pMIMAT0022947(SEQIDN0:70)；hsa-miR-876-5pMIMAT0004924(SEQIDNO:71)；hsa-miR-181c-3pMIMAT0004559(SEQIDNO:72)；hsa-miR-338-5pMIMAT0004701(SEQIDNO:73)；hsa-miR-505-5pMIMAT0004776(SEQIDNO:74)；hsa-miR-335-3pMIMAT0004703(SEQIDNO:75)；hsa-miR-543MIMAT0004954(SEQIDNO:76)；hsa-miR-223-3pMIMAT0000280(SEQIDNO:77)；hsa-miR-125b-5pMIMAT0000423(SEQIDNO:78)；hsa-miR-1238-3pMIMAT0005593(SEQIDNO:79)；hsa-miR-377-5pMIMAT0004689(SEQIDNO:80)；hsa-miR-584-3pMIMAT0022708(SEQIDNO:81)；hsa-miR-22-5pMIMAT0004495(SEQIDNO:82)；hsa-miR-376a-2-5pMIMAT0022928(SEQIDNO:83)；hsa-miR-301a-5pMIMAT0022696(SEQIDN0:84)；hsa-miR-548mMIMAT0005917(SEQIDNO:85)；hsa-miR-29b-3pMIMAT0000100(SEQIDN0:86)；hsa-miR-99a-3pMIMAT0004511(SEQIDN0:87)；hsa-miR-33b-3pMIMAT0004811(SEQIDNO:88);hsa-miR-92b_5pMIMAT0004792(SEQIDNO:89)；hsa-miR-602MIMAT0003270(SEQIDNO:90)；hsa-miR-1237-3pMIMAT0005592(SEQIDN0:91)；hsa-miR-129-5pMIMAT0000242(SEQIDN0:92)；hsa-miR-148b-3pMIMAT0000759(SEQIDN0:93)；hsa-miR-377-3pMIMAT0000730(SEQIDNO:94)；hsa-let-7b-3pMIMAT0004482(SEQIDNO:95)；hsa-miR-125a-5pMIMAT0000443(SEQIDN0:96)；hsa-miR-125a-3pMIMAT0004602(SEQIDN0:97)；hsa-miR-148b-5pMIMAT0004699(SEQIDN0:98)；hsa-miR-22-3pMIMAT0000077(SEQIDN0:99)；hsa-miR-1237-5pMIMAT0022946(SEQIDNO:100);hsa-let_7f+3pMIMAT0004486(SEQIDNO:101)；hsa-miR-29a-5pMIMAT0004503(SEQIDNO:102)；hsa-miR-193a-5pMIMAT0004614(SEQIDNO:103)；hsa-miR-423-3pMIMAT0001340(SEQIDNO:104)；hsa-miR-191-3pMIMAT0001618(SEQIDNO:105)；hsa-miR-301a-3pMIMAT0000688(SEQIDNO:106)；hsa-miR-767-3pMIMAT0003883(SEQIDNO:107)；hsa-miR-563MIMAT0003227(SEQIDNO:108)；hsa-miR-95MIMAT0000094(SEQIDNO:109)；hsa-miR-1234-3pMIMAT0005589(SEQIDNO:110)；hsa-miR-1225-3pMIMAT0005573(SEQIDNO:111)；hsa-miR-136-5pMIMAT0000448(SEQIDNO:112)；hsa-miR-1234-5pMIMAT0022944(SEQIDNO:113)；hsa-miR-99a-5pMIMAT0000097(SEQIDNO:114)；hsa-miR-32-5pMIMAT0000090(SEQIDNO:115)；hsa-miR-19l-5pMIMAT0000440(SEQIDNO:116)；hsa-miR-33b-5pMIMAT0003301(SEQIDNO:117)；hsa-mir-1-lM10000651(SEQIDNO:118)；hsa-mir-1-2M10000437(SEQIDNO:119)；hsa-mir-7-lM10000263(SEQIDNO:120)；hsa-mir-7-2M10000264(SEQIDNO:121)；hsa-mir-7-(SEQIDNO:3M10000265122)；hsa-mir-30eM10000749(SEQIDNO:123)；hsa-mir-33aM10000091(SEQIDNO:124)；hsa-mir-133bM10000822(SEQIDNO:125)；hsa-mir-144M10000460(SEQIDNO:126)；hsa-mir-199a-lM10000242(SEQIDNO:127)；hsa-mir-199a-2M10000281(SEQIDNO:128)；hsa-mir-199bM10000282(SEQIDNO:129)；hsa-mir-210M10000286(SEQIDNO:130)；hsa-mir-221M10000298(SEQIDNO:131)；hsa-mir-340M10000802(SEQIDNO:132)；hsa-mir-424M10001446(SEQIDNO:133)；hsa-mir-575M10003582(SEQIDNO:134)；hsa-mir-582M10003589(SEQIDNO:135)；hsa-mir-671M10003760(SEQIDNO:136)；hsa-mir-1229M10006319(SEQIDNO:137)；hsa-mir-1267M10006404(SEQIDNO:138)；hsa-let-7a-3M10000062(SEQIDNO:139)；hsa-let-7eM10000066(SEQIDNO:140)；hsa-mir-22M10000078(SEQIDNO:141)；hsa-mir-29aM10000087(SEQIDNO:142)；hsa-mir-29b-lM10000105(SEQIDNO:143)；hsa-mir-32M10000090(SEQIDNO:144)；hsa-mir-33bM10003646(SEQIDNO:145)；hsa-mir-34aM10000268(SEQIDNO:146)；hsa-mir-92bM10003560(SEQIDNO:147)；hsa-mir-95M10000097(SEQIDNO:148)；hsa-mir-99aM10000101(SEQIDNO:149)；hsa-mir-125aM10000469(SEQIDNO:150)；hsa-mir-125b-lM10000446(SEQIDNO:151)；hsa-mir-125b-2M10000470(SEQIDNO:152)；hsa-mir-129-lM10000252(SEQIDNO:153)；hsa-mir-129-2M10000473(SEQIDNO:154)；hsa-mir-136M10000475(SEQIDNO:155)；hsa-mir-148bM10000811(SEQIDNO:156)；hsa-mir-152M10000462(SEQIDNO:157)；hsa-mir-181cM10000271(SEQIDNO:158)；hsa-mir-191M10000465(SEQIDNO:159)；hsa-mir-193aM10000487(SEQIDNO:160)；hsa-mir-223M10000300(SEQIDNO:161)；hsa-mir-301aM10000745(SEQIDNO:162)；hsa-mir-335M10000816(SEQIDNO:163)；hsa-mir-338M10000814(SEQIDNO:164)；hsa-mir-362M10000762(SEQIDNO:165)；hsa-mir-371aM10000779(SEQIDNO:166)；hsa-mir-373M10000781(SEQIDNO:167)；hsa-mir-376a-lM10000784(SEQIDNO:168)；hsa-mir-376a-2M10003529(SEQIDNO:169)；hsa-mir-377M10000785(SEQIDNO:170)；hsa-mir-423M10001445(SEQIDNO:171)；hsa-mir-425M10001448(SEQIDNO:172)；hsa-mir-505M10003190(SEQIDNO:173)；hsa-mir-543M10005565(SEQIDNO:174)；hsa-mir-548mM10006400(SEQIDNO:175)；hsa-mir-557M10003563(SEQIDNO:176)；hsa-mir-563M10003569(SEQIDNO:177)；hsa-mir-584M10003591(SEQIDNO:178)；hsa-mir-602M10003615(SEQIDNO:179)；hsa-mir-634M10003649(SEQIDNO:180)；hsa-mir-767M10003763(SEQIDNO:181)；hsa-mir-876M10005542(SEQIDNO:182)；hsa-mir-933M10005755(SEQIDNO:183)；hsa-mir-1225M10006311(SEQIDNO:184)；hsa-mir-1234M10006324(SEQIDNO:185)；hsa-mir-1237M10006327(SEQIDNO:186)；hsa-mir-1238M10006328(SEQIDNO:187)；hsa-mir-1244-lM10006379(SEQIDNO:188)；hsa-mir-1244-2M10015974(SEQIDNO:189)；hsa-mir-1244-3M10015975(SEQIDNO:190)；和hsa-mir-1825M10008193(SEQIDNO:191)。[0061]本發明的實施方式可包括選自下組的至少一種微小RNA的應用:hsa-let-7e、mir-1、hsa-mir-1181、hsa-miR-1183、hsa-miR-1224_5p、hsa-miR-127_3p、hsa-mir-1296、hsa-mir-132、hsa-mir_136、hsa-miR-139_3p、hsa-mir_141、hsa-miR-142_3p、hsa-mir-142_5p、hsa—mir-144、hsa—mir-153、hsa—mir-1537、hsa—miR-154、hsa—miR-191、hsa-mir-193a_3p、hsa_miR-19a、hsa-mir—219_5p、hsa-mir_29b、hsa-mir—30la、hsa_miR-301b、hsa_miR-30e、hsa-mir-32、hsa-mir_33a、hsa-miR-340、hsa-miR-362_3p、hsa-miR-371_5p、hsa-377、hsa-miR-423_3p、hsa-miR-432、hsa-mir_513a_5p、hsa-mir—545、hsa-miR-548a_5p、hsa-miR-574_5p、hsa-mir-582_3p、hsa-mir-590_5p、hsa-mir_15a、hsa-mir-548c_5p、hsa-mir-1225_3p、hsa-mir_29b、hsa-mir—21、hsa-mir-1237、hsa-mir-lOl、hsa-mir_1539、hsa-mir_557、hsa-mir-125a_3p和hsa-mir-423_5p。在另一方面，所述微小RNA選自hsa-mir-136、hsa-mir-141、hsa-mir-142_5p、hsa-mir—144、hsa-mir—153、hsa-mir—1537、hsa-mir-193a_3p、hsa-mir-219_5p、hsa-mir_29b、hsa-mir_301a、hsa—mir-32、hsa-mir_33a、hsa—mir-545、hsa-mir-582_3p、hsa-mir-590_5p、hsa-mir-1181、hsa-mir-513a_5p、hsa-mir-132和hsa-mir-1296。在另一方面，所述微小RNA選自hsa-miR-144、hsa-miR-582_5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa_miR-210、hsa-miR-221_5p、hsa-miR-33a_5p、hsa-miR-575、hsa-miR-7_5p、hsa-miR-1229、hsa_miR-1267、hsa_miR-67l_3p、hsa_miR-1244、hsa-miR-1和hsa-miR_133b。在另一方面，所述至少一種微小RNA可以是mir_1229或mir-671_3p。在又另一個方面，定量和分組可包括釆用選自下組的至少四種微小RNA:miR-7-5p、miR-1229、miR-1267、miR-671_3p、miR-340_5p、hsa-miR-1Λhsa_miR-133b和hsa-miR-33a_5p0[0062]附圖簡要說明[0063]其它特徵和優勢將由下文和對本發明優選實施方式的更具體描述(如相應附圖所示)而顯見，並且其中類似的所引字符貫穿視圖通指相同部分或元件，並且附圖中:[0064]圖1顯示本發明實施方式中，具有高起始微小RNA表達的患者在IVIG治療之前和之後的CT水平；[0065]圖2顯示本發明實施方式中，具有低起始微小RNA表達的患者在IVIG治療之前和之後的CT水平；[0066]圖3顯示根據本發明的一個實施方式用於評估所選微小RNA的評分系統；[0067]圖4a_4g顯示根據本發明實施方式，有關患者結果的最前100種和最末100種微小RNA。[0068]圖5a_b顯不根據本發明的一個實施方式，圖4a_g的最前25種和最末25種微小RNA的表達差異。[0069]發明詳述[0070]首先應理解，本公開不限於具體舉例的材料、體系、常規、方法或結構，因為這些當然是可變化的。因此，雖然本文描述一些優選的材料與方法，但與本文所述那些相似或等同的眾多選擇均可用於實踐本公開的實施方式。[0071]也應當理解本文所使用的術語僅為了描述本公開特定的實施方式而不是限制。[0072]這裡概述性地列出本公開主題內容的若干實施方式。然而，應理解存在這些實施方式的變化形式和置換形式。這一概述意在示例性說明可能的實施方式。[0073]本文所用術語「免疫細胞」應指淋巴細胞、單核細胞和粒細胞，其前體和成熟衍生物。這些應包括，例如，血漿細胞、樹突細胞、肥大細胞、粒細胞和巨噬細胞。應理解免疫細胞參與廣泛活性。這些包括免疫監控和介入(例如清除惡性細胞和清除感染性物質)。此外，免疫系統的細胞，尤其是巨噬細胞及其衍生物參與凝結。此外，應理解，炎症是免疫系統細胞活性的表現。[0074]本文中所用術語「免疫治療」、「免疫治療的」或「免疫療法」應包括旨在免疫系統細胞的活性改變的治療性介入，由此設想影響免疫細胞的作用，其中所述細胞影響凝結和炎症。[0075]本文中，可通過前綴mir-和標識符來指明特定微小RNA,例如如下情況:mir_155。RNA轉錄本中被miRNA靶向的序列可位於該轉錄本中的任何位置。然而，最常見的是3』未翻譯區域中的序列。微小RNA命名法包括三字母前綴「mir」後跟數字，所述數字通常按微小RNA的描述順序分配。在一種慣例中，在「R」為小寫體時，該序列指微小RNA前體，而採用大寫體(miR)時，指示成熟形式。序列有一個或兩個鹼基不同時變體可由字母「a」和「b」指定。有時，位於基因組不同區域中的微小RNA前體導致相同的成熟微小RNA。這些微小RNA由數字後綴區分(「miR-123-l」和「miR-123-2」)。當兩種微小RNA源自相同微小RNA前體的相對臂時，根據所用的是3』鏈還是5』鏈來採用後綴-3p或-5p對其指定。如本文中所用，數字編碼，例如「mir-123」應包括其變體諸如mir-123-1、mirl23_2，以及_3p和_5p變體。如本文所用，術語「初級-miRNA」應指由Drosha酶-Pasha酶複合物靶向的RNA。如本文所用，術語「miRNA前體」應指由Drosha酶-Pasha酶複合物切割的產物。如本文所用，對親本命名(如mir-123)和任何更具選擇性的序列(如mir-123_5p)的序列之間除了由文字描述的以外應不作區分。[0076]特定微小RNA縮寫還可包括確定起源物種的額外前綴，例如hsa為智人。儘管本文所述的主要實施方式涉及人，本領域技術人員應理解本公開的技術可應用於其它物種。[0077]如本文所用的術語「對照個體」具有特殊含義。「對照個體」應指具有可比特點(如年齡和性別)的未患生殖疾病且未知有發展生殖疾病風險的個體。本文所用術語「對照樣品」應指來自相同來源(如外周血)，並在相同或相當條件下收集的生物樣品，如包含收集自對照個體的免疫細胞的試驗對象樣品，該試驗對象樣品用與對患者樣品相同的方式處理並分析。[0078]還應理解如本文所用的術語「對照樣品」可以代表來自對照個體的多個樣品的數學平均水平，其中收集本領域技術人員認為足夠數量的樣品。可源自所述樣品的其它統計學參數有例如平均值的標準偏差。所述其它統計學參數可用於比較患者測試結果和對照樣品，以評估所述患者測試結果表示異常結果的可能性，並且由此指示該患者患有生殖疾病或具有生殖疾病風險。出於簡潔目的，該術語還可以另一種方式使用，其中收集並分析來自單一個體的多個相當的，時間上分離的樣品，並彼此進行比較，使得第一樣品或特定後續樣品按前者是後者的對照來比較，這允許評估條件變化與臨床狀態，或妊娠階段或治療性介入結果的可能函數關係。[0079]如本文所用，術語「生殖免疫功能異常」或「生殖疾病」應包括疑似具有免疫成分的那些生殖系統疾病。這些應包括但不限於:不育和受孕後障礙，如可能未經識別並由此診斷為不育的著床失敗；流產；不導致流產但有損最佳妊娠結果的病症，如宮內生長遲緩、PROM(胎膜早破)、先兆子癇、早產、胎盤早剝和死產；已知造成不育、妊娠併發症和早期著床失敗的那些病症，如子宮內膜異位和自體免疫性甲狀腺炎以及抗磷脂抗體症候群、在妊娠中有損最佳胎兒生長、成熟和發育的那些妊娠疾病和/或分娩後有損潛在兒童發育的那些妊娠疾病、在母方生殖壽命期間有損其長期生殖潛力的那些生殖疾病。本文所用的術語「免疫疾病」應包括由不論體液、細胞介導的或兩者介導的和/或免疫組成(如炎症、補體或凝結介導的組成)相關的異常所致的疾病。[0080]本文所用的術語「差異表達的」或「不同表達」應指患者生物樣品與對照群的相應平均值之間特定微小RNA的量上通過所選檢測手段可檢測的差異，其中所述差異在統計學顯著性生殖疾病患者群和未患該疾病或沒有該疾病風險的相應對照群之間確定。在多種個體微小RNA的定量形成的模式能與對照中鑑定的相應模式相區分的情況下也可使用該術語。生殖疾病患者和/或具有生殖疾病風險的患者與對照個體之間的一種或多種微小RNA的差異表達優選以篩選一組微小RNA的方式確定(例如SA生物科學公司(SAB1sciences)提供的那些(產品編號MAH-104A))。患者與對照值之間的差異表達的微小RNA可通過不同方式測定。各方法需要包括來自各組的最小數量的樣品，從而可確定兩組間表達上的顯著差異。確定患者和對照之間的差異表達的微小RNA的優選實施方式利用微小RNA人類免疫病理學相關的微小RNA陣列(SuperArray技術，馬裡蘭州弗雷德裡克的SA生物科學公司(SAB1sciences),產品編號MAH-104A,用於司查塔基公司(Stratagene)Mx3005p)。用來自生殖疾病患者或有生殖疾病風險的患者的三份或多份RNA提取物和三份或更多份對照樣品按照生產商說明來進行。按照生產商說明在Stratagene3005p實時熱循環儀上運行定量PCR0就各組三重測定或更多重測定而言，確定各微小RNA的平均值並用於計算水平差異。當患者值與對照值之間的差異的P值let7a_l、let7a_2、let7a_3、let7e、let7g、mir-132、mir-9、mir-142-3b>mir-17-92、mir-223、mir-181a。所述方法包括:提供鑑定患生殖疾病或具有患生殖疾病風險的特定微小RNA譜。所述方法涉及:從所述細胞分離微小RNA並鑑定所述細胞中包含的微小RNA譜，然後將所述對象的微小RNA譜與微小RNA對照譜相比較。若顯示存在前述微小RNA譜，則診斷該對象患有生殖疾病。[0102]在本公開內容的另一個實施方式中，公開了一種用於評價治療功效和/或生殖疾病發展的方法。所述方法包括:在一段時間內提供多個生物樣品，其中所述樣品包含免疫系統的細胞，分離所述細胞並從所述細胞分離微小RNA，然後對所述細胞中包含的多種微小RNA的種類和量進行定量，然後將該微小RNA譜與一種或多種微小RNA對照譜作比較以確定這些譜的差異表達，由此允許評估所述病症的發展或治療功效。[0103]對象可以是人或其它動物。「生殖疾病」包括一種或多種選自下組但不限於下組的疾病:胎膜早破、先兆子癇、早產、宮內發育遲緩和復發性流產以及抗磷脂抗體症候群。[0104]免疫功能異常包括由不論體液介導、細胞介導或兩者介導的異常免疫機制引起的和/或與免疫相關機制有關(例如炎性、補體或凝結相關病症)免疫疾病。[0105]免疫功能異常可增加孕育的兒童後來發展病症的風險，例如，氣喘、孤獨症、注意缺陷多動障礙(ADHD)、妥瑞氏症候群、糖尿病和精神分裂症，其中所述免疫功能異常涵蓋在生殖和/或免疫疾病的概念內。本發明還設想包括妊娠之前一年或之後一年的圍妊娠期。然而，卵子發生有關時期也包括在本發明的範圍內。該時期可能在妊娠前一年外。如Winger和Reed所述，妊娠前的時期可能會形成對妊娠結果不利的免疫狀態(WingerEE,ReedJL,AshoushS，SapnaA,El-ToukhyT,TaranissiM:"Treatmentwithadalimumab(Humira)andintravenousimmunoglobulin(IVIG)improvespregnancyratesinwomenundergoingIVF(採用阿達木單抗(Humira)和靜脈內給予免疫球蛋白(IVIG)治療提高IVF女性妊娠率).AmericanJournalofReproductiveImmunology,2009;61:113-120)。同樣地，妊娠後的時期可能會受例如自體免疫疾病如類風溼性關節炎(已知在妊娠後發作的疾病)的影響。處理來自疑似患有生殖疾病的對象的包含免疫系統細胞的生物樣品，其中所述細胞通過本領域技術人員已知的各種方法分離。在一個優選實施方式中，所述生物樣品是全血。在一個更優選實施方式中，來自全血的細胞通過泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度離心法分離，所述方法在如下文獻中有指導(BoyumA1983.1solat1nofhumanbloodmonocyteswithNycodenz,anewnon-1onic1dinatedgradientmedium(用Nycodenz分離人血單核細胞，一種新型非離子碘化梯度介質).ScandJImmunol17:429-436)。採用適於提取短RNA序列的方法來提取RNA。優選所述方法採用最適用於回收微小RNA序列的試劑盒，例如mirNeasyMini試劑盒(凱傑公司(Qiagen),目錄號217004),按照生產商提供的說明進行所述提取。可根據本領域技術人員已知的多種技術確定對微小RNA的定量。在一個優選實施方式中，個體微小RNA通過實時聚合酶鏈式反應(PCR)定量。在一個更優選的實施方式中，由SA生物科學公司提供的試劑盒(www.SAB1scies.com)為已知人免疫病理學病症涉及的個體微小RNA提供試劑和方法以使所述定量針對特定實時熱循環儀(例如StratageneMx3005p,目錄號MAH-104A)最優化。StratageneMx3005p的操作說明書由生產商提供。其中包含用於對回收的RNA進行分光光度定量的說明、關於RNA和PCR主混物輸入量的推薦。定量可與對「管家基因」(這種基因在細胞中相對保守地表達，由此被研究以供相對定量)的定量同時進行。管家基因可選自，例如，β_肌動蛋白、甘油醛-3P-脫氫酶(GAPDH)、膜聯蛋白Α2(ΑΝΧΑ2)、穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRTl)、泛素(UBQ甘油醛-3Ρ-脫氫酶(GAPDH)、膜聯蛋白Α2(ΑΝΧΑ2)、穀胱甘肽S-轉移酶(GST)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRTl)、泛素(UBQ)、18sRNA。所得比例包含獨立於測定系統內RNA輸入量的相對量。這允許以分析物信號和選定管家基因的比例的形式與釆用相似方式定量的對照樣品進行比較。[0106]已知參與免疫病理學病症的感興趣的微小RNA包括但不限於mirHea、lmir_46b、mir-155、mir_605、mir-623、mir-583、mir_26a、mir_519d、lmir-26、lmir_6、3mir-69_3、Let_7aandl25bmir-126、mir-155、mir-21、Let_7a、let_7c、let_7d、let_7e、let_7g、mir-214、mir-409_3p、mir-451、mir-103、mir-105、mir_106a、mir-125a_5p、mir_125b、mir-126、mir-128、mir_130a、mir-132、mir-134、mir_135a、mir_135b、mir-138、mir-142_3p、mir-142_5p、mir_143、mir_145、mir_147、mir_148a、mir_149、mir-150、mir_15a、mir_15b、mir_16、mir_181a、mir—183、mir—184、mir—185、mir—187、mir_18a、mir_191、mir_195、mir_196a、mir_198、mir_19a、mir_19b、mir_200a、mir_203、mir-205、mir_206、mir_20a、mir_20b、mir_21、mir-214、mir-223、mir_23b、mir_26a、mir_26a，mir_26b、mir_27a、mir_27b、mir-298、mir-299_3p、mir_29b、mir_29c、mir_302a、mir_302c、mir_30b、mir_30c、mir_30e、mir-31、mir-325、mir-335、mir_34a、mir-369-3、mir-370、mir_379、mir-383、mir-409_3p、mir_46b、mir-493、mir_519d、mir-574_3p、mir-577、mir-583、mir-605、mir-623、mir_9、mir_98、mir-99b。[0107]在一個優選實施方式中，米用已知相較於對照樣品值而言差異表達的一種或多種微小RNA。同樣優選地，將多種微小RNA鑑定為指示差異表達的微小RNA的模式或特徵。可通過如下方式來確定所述單一或多種微小RNA:在微小RNA組內對生殖疾病患者或有患生殖疾病風險的患者中的微小RNA水平進行定量並將由患者水平的生物樣品確定的微小RNA與源自對照樣品的那些相比較。[0108]在一個優選實施方式中，將患者樣品分組。各組可通過其臨床概況以其他方式定義。作為替代方式，例如並如本文所用，一種或多種微小RNA在患者間具有可區分的水平，或可以不同方式響應免疫治療性介入。例如並如本文所用，各組可通過其對IVIg治療的響應，通過其不同mir-132反應來區分。基於其對IVIg的不同mir_132反應，可將其分為兩組(「A」和「B」)。可對樣品的微小RNA的差異絕對表達或其對免疫治療性介入的差異微小RNA反應進行後續研究。這些方法可用於確定通過上述方法建立的組之間的微小RNA反應模式。[0109]本發明可用於提出生殖和/或免疫疾病患者對可能減輕所述疾病的特定免疫治療的適合性，還可用於評估患者發展此類疾病的風險。此外，本發明可用於通過提供一系列試驗和結果比較來監測疾病治療的發展或監測疾病風險的降低。系列研究可在妊娠過程中、妊娠前、妊娠後以及療程期間進行並比較，以確定所提供治療的成功性和充分性。[0110]對來自PBMC的微小RNA進行定量允許研究者或臨床醫師將所得結果與合適對照作比較，其中鑑定出表達差異。例如，若生殖疾病患者或有患此類疾病(例如反覆性流產)風險的患者中的某一微小RNA(如mir-155)相較於由未經歷反覆性流產的個體形成的對照而言差異表達，則可診斷該患者患有生殖疾病且該患者是例如採用TNFa阻斷劑進行免疫介入的候選者。被如此診斷的患者可按Winger和Reed對定義為患有相似疾病的患者所述的方式治療(EdwardE.Winger,JaneL.Reed,TreatmentwithTumorNecrosisFactorInhibitorsandIntravenousImmunoglobulinImprovesLiveBirthRatesinWomenwithRecurrentSpontaneousAbort1n(用腫瘤壞死因子抑制劑和靜脈內給予免疫球蛋白的治療提高反覆自發性流產女性的活產率)，60(1)，8-16，電子公開:2008年6月28日。EdwardE.Winger,JaneL.Reed,SherifAshoush,SapnaAhuja,TarekEl-Toukhy,MohamedTaranissi,TreatmentwithAdalimumab(HumiraandIntravenousImmunoglobulinImprovesPregnancyRatesinWomenUndergoingIVF(米用阿達木單抗(Humira)和靜脈內給予免疫球蛋白的治療提高IVF女性的妊娠率)，AmericanJournalofReproductiveImmunology61(2009)113-120))。[0111]在一些實施方式中，用於提取RNA的細胞應該是PBMC細胞，而在其它情況中，細胞應該是源自身體組織的免疫細胞，所述身體組織例如子宮內膜、蛻膜、胎兒和胎盤組織，以及次級淋巴器官例如淋巴結。單核細胞還可通過多種技術選擇，例如用標誌物標記所述細胞之後通過流式細胞術分選，所述標誌物例如允許其分離成不同免疫細胞亞型的單克隆抗體。例如，調節性T細胞可在用單克隆抗體標記後進行選擇，所述單克隆抗體例如CD4、CD127和CD25(添加或不加CD3)，根據BD公司(BectonDickinsonC0.)(採用來自該公司的試劑和儀器如下進行:http://www.bdb1sciences.com/research/tcell/regulatorytcells/workflow/identifyingtregs.jsplO年4月28日下載)。可從通過所述方式選擇分離的細胞提取的RNA可通過按生產商說明提取來製備(凱傑公司(Qiagen)目錄號763134)。微小RNA，例如mir-155，可按Chen等人所述的方法通過PCR(聚合酶鏈式反應)來檢測並定量(http://www3.appliedb1systems,com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_040548.pdf,5/11/10下載)。可從產品介紹中描述的那些來選擇用於個體微小RNA的引物和試劑(http://www3.appliedb1systems,com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_068884.pdf,5/11/10下載)。該文件提供指導對個體微小RNA進行檢測和定量的信息。[0112]所述方法包括:提供來自具有生殖和/或免疫疾病史或有患此類疾病風險的對象的生物樣品，所述樣品源自免疫細胞，例如，源自外周血，然後如Boyum指導分離單核細胞(BoyumA1983.1solat1nofhumanbloodmonocyteswithNycodenz,anewnon-1onic1dinatedgradientmedium(用Nycodenz分離人血液單核細胞,一種新型非離子碘化梯度介質).ScandJImmunol17:429-436)，然後測定非編碼RNA(例如優選為一種或多種微小RNA)的量並將該樣品中對應RNA的量與來自對照個體的經相似處理的生物樣品中對應RNA的量作比較。此外，所述方法可包括對來自所述生物樣品的多種個體微小RNA進行定量，並對這些個體微小RNA進行定量，然後將微小RNA的量與對應微小RNA對照水平作比較。然後，若來自所述樣品的一種或多種RNA的量相較於對應RNA對照水平而言是差異表達的，則將該對象診斷為患有生殖和/或免疫疾病或具有發展此類疾病的風險。在一些實施方式中，所述方法還包括基於所測定的一種或多種RNA的量來選擇治療或改變治療。該測定可基於對於特定個體微小RNA或微小RNA的組合的評估。[0113]在本公開內容的其它實施方式中，提供了一種用於對生殖或免疫疾病患者和/或對象內有發展生殖疾病風險的試驗對象評價治療功效和/或進展的方法。在一些實施方式中，所述方法包括在一段時間內提供來自對象的一系列生物樣品，如上所述分離RNA(包含來自該系列生物樣品的RNA)，測定來自該系列的各生物樣品中的一種或多種微小RNA的量，並且測定來自該系列的各生物樣品中的一種或多種微小RNA的量中的任何可檢測的變化，以允許檢測對於對象內生殖疾病或生殖疾病風險的治療功效和/或進展。[0114]在本公開內容的另外其它實施方式中，提供一種用於表徵對象內生殖疾病的方法。在一些實施方式中，所述方法包括提供來自對象的生物樣品，從所述生物樣品分離包含微小RNA的RNA，測定一種或多種所述RNA的量，以及將所述一種或多種微小RNA的量與對應的微小RNA對照水平作比較。然後，基於來自所述樣品的所述一種或多種微小RNA的量相較於一種或多種微小RNA對照水平而言的差異表達來表徵所述生殖疾病。在一些實施方式中，在與患有已知生殖疾病的充分表徵的個體相比較時表徵所述生殖疾病。[0115]在這些方法的一些中，對微小RNA的定量包括採用實時聚合酶鏈式反應。SA生物科學公司為已知涉及人免疫病理學病症的個體微小RNA提供試劑和方法，以使所述定量針對特定實時熱循環儀(例如StratageneMx3005p(產品編號MAH-104A))最優化(www.SAB1scies.com)。定量可與對「管家基因」(經研究以允許標準化的在細胞物質中相對保守地表達的基因)的定量同時進行。此外，在這些方法的一些實施方式中，所述mirRNA是一種或多種微小RNA。其中定量的微小RNA包括但不限於此。[0116]已證明微小RNA，其在miRNA前體中或在靶位點中的側接區域影響生理學和病理學過程。微小RNA及其側接區域和靶mRNA中的單核苷酸多態性(SNP)可改變靶標特異性，使野生型與含SNP的對應物之間造成作用喪失或減小。此外，此類多態性可產生新mRNA革巴標相互作用。(GongJ,TongY,ZhangHM,WangK,HuT,ShanG,SunJ,GuoAY,Genome-wideidentificat1nofSNPsinmicroRNAgenesandtheSNPeffectsonmicroRNAtargetbindingandb1genesisHumanMutat1n(基因組範圍鑑定微小RNA中的SNP以及SNP對微小RNA靶標結合和生物生成人類突變的影響)(2012)33(1):254-63.do1:10.1002/humu.21641.電子公開2011年11月23日)。這些多態性可導致微小RNA對靶mRNA調節的功效發生變化。(JazdzewskiK,MurrayEL,FranssilaK,JarzabB,SchoenbergDR,delaChapelleA.CommonSNPinpre-mir_146adecreasesmaturemir—express1nandpredisposestopapillarythyroidcarcinoma(mir_146a前體中的常見SNP減少成熟mir表達並傾向乳頭狀甲狀腺癌).ProcNatlAcadSciUSA2008；105:7269-74.)。此外，可能會潛在影響微小RNA所介導對細胞調節的多態性其可存在於微小RNA靶基因的3』-UTR中。其它多態性也可存在於參與微小RNA生物發生以及初級微小RNA序列、前體微小RNA序列和成熟微小RNA序列的基因中。經加工的微小RNA中的此類多態性的結果可對靶基因多樣性表達具有很大影響並且具有嚴重後果，而在微小RNA靶位點中的多態性，在靶mRNA的3』-UTR中，可更具靶標和/或通路特異性(PrasunJMishra和JosephRBertino,MicroRNApolymorphisms:thefutureofpharmacogenomics,molecularepidem1logyandindividualizedmedicine(微小RNA多態性:藥物基因組學、分子流行病學和個體化醫學的未來)，Pharmacogenomics.2009年3月；10(3):399-416.do1:10.2217/14622416.10.3.399)。[0117]例如，通過例如實時等位基因區別的技術對此類多態性進行的檢測也在本發明範圍內。可在Mx3000P指導手冊中找到方法(www.b1.davidson.edu/courses/B1343/Mx3000P_Manual.pdf10/24/10下載))。已登入有野生和含SNP靶標的等位基因相互作用的識別。例如，參見http://www.b1gu0.0rg/miRNASNP/index,php,(10/21-2012下載)。本發明特別良好適用於個性化醫療。利用核酸表徵和定量來評估特定治療幹預的成功可能性。個性化醫療的目標是鑑定出可能或相反不太可能響應候選治療的患者。成本、副作用和改善的治療反應是爭取將核酸測試作為選擇治療的手段以及跟蹤療程的公認原因。對微小RNA的定量不僅可有助於鑑定患有生殖疾病的患者，此類定量還將在實質上無限種疾病中相應地協助選擇並指示治療選擇並監測其效果。[0118]通過對患者對於介入(例如免疫治療如IVIG)的反應將其分成兩組或更多組的能力允許更具體地預測對於特定介入的治療反應並也可允許預測對於其它介入的反應。所述區分的另一個方面是更好地預測並判斷其它疾病(例如自體免疫疾病)的易患病性。若鑑定患者組間的某一微小RNA的反應模式是雙峰性的，則可根據其反應將患者分成所述組。[0119]本發明包括在介入(優選免疫治療性介入，例如IVIG)之前和之後收集免疫細胞(優選PBMC)，從所述細胞提取含微小RNA的RNA，對所提取的RNA中的微小RNA定量，測定一種或多種定量的微小RNA是否在統計學足夠數量的患者樣品間顯示雙峰性反應。若一種或多種微小RNA中顯示雙峰性反應模式，則可根據其反應將患者分成不同組。[0120]本文所用的「反應」定義為第一樣品結果與第二樣品結果之間的差異，其中之前已有介入性介入或有介入的介入性作用。其可以是變化的缺失或者增加、減少。本文所用術語「雙峰」或「雙峰性」指反應的非正態分布，其中數據特徵為兩個不同模式。數據可以圖表形式在直方圖中展現，並通過觀察評估雙峰性。已開發統計學方法來辨別雙峰性。第一步將結果簇識別為兩個群。儘管通常通過觀察檢驗數據直方圖來識別兩個群之間的區分點，可由統計學領域普通技術人員施用統計學方法。計算兩個簇的平均值和標準偏差。在雙峰性的一個優選定義中，若兩個簇的平均值等於或遠離所述兩個簇的標準偏差之和，則認為數據具有雙峰性(Schilling,Watkins和Watkins,「IsHumanHeightBimodal?(人類身高具有雙峰性嗎？)」，TheAmericanStatistician(2002)，56(3):223-229)。[0121]在測試組的一種或多種微小RNA反應之間呈現雙峰性分布時，認為群體就微小RNA反應而言具有兩分性。應理解，並非所有患者組就其在任何給予的介入之後的個體微小RNA反應而言都具有兩分性。若發現一種或多種微小RNA具有雙峰性反應，則認為該患者群具有兩分性。[0122]在一個優選實施方式中，本領域普通技術人員個體採用人類微小RNA陣列(來自安捷倫技術公司(AgilantTechnologies))(例如產品編號G4471A-029297)並按照生產商的指導)根據微陣列生產商的指導在提取自PBMC的樣品RNA上對所有已知人類微小RNA定量。收集的血液放入肝素管中並在室溫下保持優選約24小時，然後分離PBMC。RNA制樣與提取:將PBMC或分選的細胞群(<1χ10~7活細胞)收集在ImlTRIzoI(英傑公司(Invitrogen))中並儲存在_80c備用)。根據TRIzol方案(英傑公司)或Rneasy小抽試劑盒(凱傑公司(Qiagen))分離總RNA。就Rneasy小抽試劑盒的使用而言,整個過程在室溫下採用QIAcube自動化機器人(凱傑公司)進行。總RNA產量採用ThermoScientificNanoDroplOOO微體積分光光度計來評估(260nm處的吸光度和260/280及260/230比例)。RNA完整性採用安捷倫的B1analyzerNANO晶片實驗室(Lab-on-Chip)儀器(安捷倫)評估。微小RNA微陣列處理。微小RNA微陣列數據通過採用安捷倫的GeneSpringGXvll.5.1進行標準化(見連結)(http://www.chem.agilent.com/en-US/Products-Services/Software-1nformatics/GeneSpring-GX/pages/default,aspx)10/7/2012下載。測試在樣品上進行，所述樣品優選在治療介入之前I~3周或更短時間內以及治療介入之後I~3周或更短時間內採得。在一個優選實施方式中，選擇有統計學意義數量的患者，這些患者具有相似人口統計學和臨床特點(例如年齡、性別和臨床狀況(例如反覆性妊娠損失))。分析這些數據的目標是將患者分成兩組或更多組。在一個更優選實施方式中，目標是將患者二分化為兩組，各組具有獨特的微小RNA譜。[0123]有多種方法適於測定定義各組的獨特微小RNA譜。在第一步中，計算在治療前和治療後取樣的各微小RNA之間的差異。計算不同「之前和之後」樣品亞組之間的各個差異的平均值和標準偏差並這些微小RNA以統計學顯著性排序。選擇微小RNA的平均值和SD最具統計學顯著性差異的亞組(Graphpad軟體t檢驗)。通過研究，鑑定結果呈二分性分布的微小RNA。然後根據測定將患者結果分成兩組，各組含選定的微小RNA結果。[0124]如下討論,在一組17個患者間顯示雙峰性hsa-mir-132反應。隨後,來自所述兩組(由hsa-mir-132雙峰性分布確定)各組的患者的之前和之後樣品的RNA在含全部「已知」或疑似的人類微小RNA的微陣列中評估。如此，鑑定出hsa-mir-132為符合上述標準。[0125]選擇在AlanE.Beer中心因反覆性流產和不育症就診並接受靜脈內免疫球蛋白(IVIG)治療的十七位女性患者(平均年齡35.8±4.8年)(平均有1.5±1.8次先前流產；有1.6±1.5次先前IVF失敗)。各患者都籤署了同意書，允許其血液被用於研究目的。該研究選擇的各患者在IVIG治療之前平均13.2±6.0天和在IVIG治療之後平均11.8±5.6天進行採血(在微小RNA採血之間平均25.1±7.9天)。血液作為對患者進行的常規血研究的部分來採得。從室溫保持24~48小時久的肝素化血液，通過Ficol1-Hypaque密度梯度離心來分離PBMC。大約1xlO6個細胞保存在ImlTrizol(英傑公司)中並保持在_20°C備用。表1總結了患者特點。[0126]表1【權利要求】1.一種基於微小RNA的表達來鑑定患者群中至少兩種特徵性的組的方法，所述方法包括如下步驟:a)收集免疫細胞；b)從所述免疫細胞提取含微小RNA的RNA；c)定量所述提取的RNA中的至少一種微小RNA;和d)基於所述至少一種微小RNA的表達將所述患者群劃分成不同組。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述收集免疫細胞的步驟包括收集外周血單核細胞。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述劃分所述患者群的步驟包括:將相對高水平表達所述至少一種微小RNA的患者分配至第一組，並將相對低水平表達所述至少一種微小RNA的患者分配至第二組。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述收集免疫細胞的步驟包括在免疫療法治療之前收集所述細胞。5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述收集免疫細胞的步驟包括在免疫療法治療之後收集所述細胞。6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述收集免疫細胞的步驟包括:在免疫療法治療之前和之後收集所述細胞，並且其中所述劃分所述患者群的步驟包括:測定所述免疫療法治療之後所述至少一種微小RNA的表達水平的變化。7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述劃分所述患者群的步驟包括:將表達水平顯示第一變化的患者分配至第一組，並將表達水平顯示第二變化的患者分配至第二組。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述第一變化是表達水平的相對大的變化，而所述第二變化是表達水平的相對小的變化。9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述第一變化是表達水平的正向變化，而所述第二變化是表達水平的負向變化。10.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述第一組中所述至少一種微小RNA表達水平變化的平均值的絕對值除以標準偏差大於或等於I。11.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括如下步驟:鑑定已知微小RNA的組中的微小RNA亞組，其在所述第一組中顯示表達水平變化以致所述表達水平變化的平均值的絕對值除以標準偏差大於或等於I。12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括如下步驟:鑑定已知微小RNA組中的微小RNA，其在所述第一組中顯示表達水平的最大變化。13.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括如下步驟:a)從其它患者收集免疫細胞；b)從所述其它患者的免疫細胞提取含微小RNA的RNA；c)定量從所述其它患者提取的RNA中的至少一種微小RNA;和d)基於所述至少一種微小RNA的表達將所述其它患者鑑定為屬於劃分的不同組之一。14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括如下步驟:基於所述鑑定對所述其它患者給予治療。15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述給予治療的步驟包括給予IVIG。16.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括如下步驟:基於所屬劃分組診斷患者患有病症。17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述病症是生殖疾病。18.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法還包括如下步驟:監測對屬於所述劃分的組之一的患者的治療，所述監測通過收集免疫細胞、提取至少一種微小RNA並在此後定量所述至少一種微小RNA來進行。19.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述至少一種微小RNA選自下組:hsa_let_7e、hsa-mir-l181、hsa-miR-l183、hsa-miR-1224_5p、hsa-miR-127_3p、hsa-mir-1296、hsa-mir_132、hsa-mir_136、hsa_miR-139_3p、hsa-mir_141、hsa-miR-142_3p、hsa-mir-142_5p、hsa-mir_144、hsa-mir_153、hsa-mir_1537、hsa-miR-154、hsa-miR-191、hsa-mir-193a_3p、hsa_miR-19a、hsa-mir_219_5p、hsa-mir_29b、hsa-mir_301a、hsa_miR-301b、hsa_miR-30e、hsa-mir—32、hsa-mir_33a、hsa-miR-340、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-371-5p、hsa-377、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-432、hsa-mir-513a_5p、hsa-mir—545、hsa-miR-548a_5p、hsa-miR-574_5p、hsa-mir-582_3p、hsa-mir-590_5p、hsa-mir_15a、hsa-mir-548c_5p、hsa-mir-1225_3p、hsa-mir_29b、hsa—mir-21、hsa—mir-1237、hsa—mir-101、hsa—mir-1539、hsa—mir-557、hsa-mir-l25a~3p和hsa-mir-423_5p。20.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述至少一種微小RNA選自下組:hsa—mir-136、hsa—mir-141、hsa-mir-142_5p、hsa—mir-144、hsa—mir-153、hsa—mir-1537、hsa-mir-l93a~3pλhsa-mir-219_5p、hsa-mir_29b、hsa-mir_301a、hsa-mir_32、hsa-mir_33a、hsa-mir_545、hsa-mir-582_3p、hsa-mir-590_5p、hsa—mir—l181、hsa-mir-513a_5p、hsa-mir-132和hsa-mir-1296。21.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述至少一種微小RNA選自下組:hsa-miR-144、hsa-miR-582_5p、hsa-miR-30e_3p、hsa-miR-340_5p、hsa-miR-424_5p、hsa-miR-199a_5p、hsa-miR-199b_5p、hsa-miR-210、hsa-miR-221_5p、hsa-miR-33a_5p、hsa-miR-575、hsa-miR-7_5p、hsa-miR-1229、hsa-miR-1267、hsa-miR-671_3p、hsa-miR-1244、hsa-miR-l和hsa_miR-133b022.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述至少一種微小RNA選自下組:hsa-miR-1229和hsa-miR-671_3p。23.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法包括:利用選自下組的至少四種微小RNA進行定量和分組:miR-7-5p、miR-1229、miR-1267、miR-671_3p、miR-340_5p、hsa-miR-l、hsa_miR-133b和hsa-miR-33a_5p0【文檔編號】C12Q1/68GK104039983SQ201280065238【公開日】2014年9月10日申請日期:2012年10月25日優先權日:2011年10月28日【發明者】愛德華·E·維因格,簡·L·裡德申請人:愛德華·E·維因格,簡·L·裡德