一種具有內涵體逃逸功能的殼聚糖衍生物及其製備方法和應用與流程
2023-05-26 04:30:41 1
本發明涉及一種具有內涵體逃逸功能的殼聚糖衍生物及其製備方法和應用，屬於生物藥用材料
技術領域：
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背景技術：
：癌症在全球範圍內已成為嚴重威脅人類生命健康的多發病和常見病。目前癌症臨床治療方式有藥物治療、放射治療和手術治療，其中化療在癌症治療中佔主導地位。但因化學藥物選擇性不強，在發揮殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長繁殖作用時對正常組織器官及細胞也起同樣作用，由此產生了嚴重的不良反應，甚至導致化療失敗。近年來研究的納米給藥系統雖具有腫瘤組織靶向性，可通過胞飲途徑進入細胞，但不可避免會被吞噬為內涵體，最終形成溶酶體而被降解，從而削弱了藥物的生物學活性。因此，研製能將藥物輸送至靶細胞並具有的內涵體逃逸功能的載體迫在眉睫。殼聚糖(Chitosan)是甲殼質脫乙醯基的產物，是自然界唯一大量存在的高分子鹼性氨基多糖，其荷正電的特性使其能與細胞表面荷負電的蛋白聚糖相互作用，促進細胞內吞攝取。與合成高分子材料相比，具有來源廣泛、價格低廉、性質穩定、無刺激、無致敏、無致突變、良好的生物相容性和生物可降解性、低免疫原性和無生物活性等優點，這使得殼聚糖在醫藥領域有著廣泛的應用。殼聚糖分子鏈上帶有大量活性氨基和羥基，易於化學修飾。控制不同的合成條件和方法，可製備具有不同特性的殼聚糖衍生物。在殼聚糖分子的伯氨基上易於接枝各種親油性小分子，引入了疏水基團，即形成帶有疏水長鏈的兩親性殼聚糖衍生物，在水中可以自發形成納米膠束，其具有上述聚合物膠束增溶作用、結構穩定、長循環和靶向等特點。但如前所述，載藥物的殼聚糖膠束靶向進入細胞內並不能保證穩定發揮藥效，還需經歷內涵體的吞噬進而被降解。因此為使藥物能完整進入細胞質，應使抗腫瘤藥物載體具備內涵體逃逸功能。內涵體逃逸的機制有四種：pH緩衝效應(質子海綿效應)，內涵體膜的致孔效應，內涵體膜融合效應以及內涵體膜的光化學斷裂。其中內涵體膜致孔效應是由於某些多肽類物質與內涵體膜上的孔隙具有高親和力，如陽離子兩親性多肽與脂質雙分子層結合，使孔內的張力增大，擴增孔洞從而實現從內涵體逃逸。膜融合是通過融合蛋白引發的內涵體膜結構紊亂而產生內涵體逃逸，如凝血素可在內涵體酸性pH條件下由陰離子親水核轉變為疏水螺旋狀構象，有利於膜融合。光化學斷裂源於內涵體和溶酶體膜上存在光敏感物質，其在光照下誘導形成氧自由基從而破壞膜結構。質子海綿效應是由能在質子化條件下具有高緩衝能力且易於膨脹的試劑介導產生，其中富含組氨酸的分子由於組氨酸上的咪唑環質子化後表現出緩衝效應，可引發內涵體膜破裂。又如PAMAM聚合物結構中存在質子化胺基亦產生了高緩衝效應，提高了內涵體的滲透壓，導致內涵體膜破裂。在以上四種方式中，質子化海綿效應方式相對較易實現，方便使用，成本相對較低，易於與靶配體結合，便於大規模生產。目前，現有內涵體逃逸功能化合物的研究眾多，但是也存在一些問題，如效應差，載藥效果差等。技術實現要素：發明目的：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種具有內涵體逃逸功能的殼聚糖衍生物及其製備方法和應用。技術方案：為了實現上述發明目的，本發明公開了一種具有內涵體逃逸功能的殼聚糖衍生物，其特徵在於，其化學結構式如下式I所示：其中，n表示殼聚糖的聚合度，m/n表示咪唑甲基取代度，k/n表示單元糖環上的氨基未被羥乙基的取代的比例。50kDa殼聚糖的n大約在250左右，100kDa殼聚糖的n大約在500左右；當採用50kDa或100kDa殼聚糖時，k/n反映了一步合成反應未接枝到羥乙基的氨基取代情況，根據實驗結果k/n大約是在0.831～1之間，即k可能範圍是207～250或415～500；m/n反映了咪唑取代度，根據實驗結果是0.189～0.205，則m的範圍是47～52，或94～104。本發明還提供了所述殼聚糖衍生物的製備方法，包括以下步驟：(1)殼聚糖衍生化製成兩親性殼聚糖--羥乙基殼聚糖(MHC)；(2)N-(4-咪唑甲基)-羥乙基殼聚糖(MHC)的合成；反應步驟如下：優選，所述步驟(1)的方法如下：將殼聚糖溶於10％的醋酸溶液中，攪拌至完全溶解後加入50％的氫氧化鈉，升溫至20-50℃反應6-12小時，再加冰降溫至0-4℃後加入環氧乙烷2.5-10ml，升溫至40-60℃反應12-18小時，冷卻至室溫，加入5mol/L的HCl調pH至中性，所得產物經3000rpm離心10min，0.8μm微孔濾膜過濾，透析凍幹即得。優選，所述殼聚糖的分子量為50kDa或者100kDa。優選，所述步驟(2)的方法如下：取步驟(1)所得產物加水完全溶解，加適量6％HAc調至PH＝5加入4-咪唑甲醛，並升溫至80℃反應12～24h，冷卻後加適量4mol/LNaOH至中性，並加入10％的NaBH4，5mol/LHCl調至中性，離心後經0.8μm微孔濾膜過濾，濾液透析凍幹即得。本發明提供了所述殼聚糖衍生物在製備載藥膠束中的應用。優選，所述載藥膠束中的藥物為槲皮素或香豆素。優選，製備載藥膠束時採用直接溶解法、旋轉蒸發法、透析法或者乳化法。技術效果：相對於現有技術，本發明採用簡單的合成手段製備出兩親性殼聚糖衍生物，通過質子海綿效應實現內涵體逃逸。所得載體材料具有一定的載藥能力，幫助藥物實現內涵體逃逸功能。具體實施方式實施例1材料合成材料表徵方法如下：通過1HNMR、有機元素分析分別進行咪唑甲基和羥乙基的取代度測定。採用芘螢光光譜法測定MHC的臨界膠束濃度1、羥乙基殼聚糖(HE-Cs)的合成：稱取1克殼聚糖(50KDa100KDa)，加入10ml2％的HAc，攪拌至完全溶解後加入50％的NaOH10ml。之後升溫至40℃反應12小時，再加冰降溫後加入環氧乙烷10ml，升溫至50℃反應18h。冷卻至室溫加入5mol/LHCl調pH至中性。所得產物經3000rpm離心10min，0.8μm微孔濾膜過濾，透析凍幹即得。元素分析可知不同環氧乙烷投料量，可得不同羥乙基取代度。表1：羥乙基殼聚糖取代度與環氧乙烷投料量的關係環氧乙烷投料量羥乙基取代度2.5mL0.294～0.3725.0mL0.523～0.65410.0mL0.946～1.1692、N-(4-咪唑甲基)-羥乙基殼聚糖(MHC)的合成：取上述產物0.6g加72ml水完全溶解，加適量6％HAc調至PH＝5加入0.14g4-咪唑甲醛，並升溫至80℃反應24h。冷卻後加適量4mol/LNaOH至中性，並加入10％的NaBH4，5mol/LHCl調至中性，離心後經0.8μm微孔濾膜過濾，濾液透析凍幹即得。通過1H-NMR可知咪唑甲基取代度0.189～0.205。3、採取芘螢光光譜法測定MHC的臨界膠束濃度，配製濃度為6×10-6mol/L的芘的丙酮溶液，精密量取1mL置於一系列10mL容量瓶中，通氮氣流揮去丙酮，分別加入MHC的水溶液適量，並加水稀釋至刻度使MHC濃度分別為0.2、0.4、1.0、4.0、10.0、20.0、50.0、100.0、250.0、500.0、1000.0、2000.0、5000.0μg/mL。上述溶液超聲30min，置於65℃水浴中孵育1h，取出，室溫下暗處放置過夜。採用螢光光度計繪製芘的激發光譜，λem＝390nm，激發和發射狹縫寬度均為3.0nm。記錄各溶液激發光譜的I338/I333，以I338/I333對MHC的對數濃度作圖，計算CMC。表2投料量為10.0mL環氧乙烷不同分子量羥乙基殼聚糖的臨界膠束濃度分子量CMCHE-Cs(50KDa)242.66μg/mlHE-Cs(100KDa)380.19μg/ml實施例2載藥工藝優化以槲皮素為模型藥物，比較了直接溶解法、旋轉蒸發法、透析法、乳化法製備膠束載藥量不同。採用單因素考察法比較槲皮素的不同溶媒(乙醇、二甲基亞碸、甲醇)、載體濃度(1％、0.67％、0.5％)以及藥物和載體投料比(1:25、1:10、1:5)對載藥量的影響，以載藥量為指標進行工藝優化，製成達到一定濃度的載藥膠束。結果如下表3和表4所示。表3不同製備方法所得載藥膠束載藥量表4單因素考察工藝優化結果實施例3細胞攝取及細胞內內涵體逃逸以香豆素-6(C6)為疏水性藥物的螢光探針，包載於膠束中，採用雷射共聚焦進行觀察和評價。為便於顯微觀察，MDA-MB-231細胞用DMEM在24孔平板中培養24h，用膠束孵育4h後，細胞用PBS衝洗三次，4％多聚甲醛固定。在螢光拍照前細胞核用Hoechst33258染色，膠束的細胞攝取採用螢光顯微鏡觀察。CLSM用於觀察接下來的膠束的內化和內涵體逃逸過程。MDA-MB-231細胞在玻璃底的培養皿中培養24h，分別於加入C6-MHC膠束後2h，4h，12h，用PBS進行清洗三次，再用LysoTrackerTMRed染色，4％多聚甲醛固定，CLSM觀察。結果表明採用疏水性螢光探針C6載入膠束內，觀察MDA-MB-231細胞內吞情況。C6膠束體外實驗表明24h內釋放量低於1％，說明在細胞內能觀察到的C6大部分都來自於C6膠束攝取，而不是游離的C6。雷射共聚焦實驗進一步證實了膠束從內涵體逃逸的效率。在MDA-MB-231細胞與C6膠束(綠色螢光)孵育後，內涵體採用LysoTrackerTMRed(紅色螢光)染色。進入內涵體膠束用黃色表示。2h孵育後，明顯觀察到細胞內的黃色像素，表明細胞攝取後大多數的膠束都傳遞進入內涵體。然而，黃色螢光信號在4h時明顯減少了，表明內涵體逃逸出膠束。12h觀察到最弱的紅色和綠色螢光，表明C6膠束高效地從內涵體逃逸出來。染色內涵體的紅色螢光在逐漸衰減。這與陽離子材料對內涵體的酸性環境的破壞有關。實施例4細胞毒性通過MTT法在MDA-MB-231細胞上進行空白膠束、載藥膠束的細胞毒性試驗。生物材料MTT分析，將MDA-MB-231細胞孵育於96孔板上，空白膠束濃度從0.005到1000μg/mL，孵育72h。載藥膠束的MTT試驗，是將藥物的濃度從0.001-10μg/mL孵育72h。每孔加入20uLMTT(溶於PBS中濃度為5mg/mL)孵育4h，加入100uLDMSO以溶解formazan結晶，570nm下酶標儀測定吸收度，以未處理組為標準進行數據處理。MTT法結果表明，空白膠束組沒有觀察到明顯的細胞凋亡，說明空白的膠束沒有細胞毒性。載藥膠束的IC50較低，說明膠束更有效地傳遞藥物產生細胞毒性，發揮有效的抗腫瘤作用。當前第1頁1 2 3